杭　航， 伍國(guó)鋒*， 王麗琨， 周海燕

(貴州醫(yī)科大學(xué) 急診醫(yī)學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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乳鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定*

杭航**， 伍國(guó)鋒***， 王麗琨， 周海燕

(貴州醫(yī)科大學(xué) 急診醫(yī)學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 探索乳鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定方法。方法： 取新生SD乳鼠腦組織搗碎、消化及共培養(yǎng)，用振搖法分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)；在相差顯微鏡下觀察共培養(yǎng)第3、9及14天時(shí)細(xì)胞形態(tài)，計(jì)數(shù)純化培養(yǎng)后小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)及存活率，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法在共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)純化培養(yǎng)后小膠質(zhì)細(xì)胞特異性O(shè)X-42抗體表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)及存活率，同時(shí)觀察小膠質(zhì)細(xì)胞活化形態(tài)；觀察純化培養(yǎng)12、24、48及72 h后小膠質(zhì)細(xì)胞的靜止型細(xì)胞數(shù)和靜止率。結(jié)果: 振搖法共培養(yǎng)第14天時(shí)可見(jiàn)胞體折光不均的星形膠質(zhì)細(xì)胞最多，分離時(shí)可獲得1.2×10(6 )個(gè)/瓶(75 cm2,250 mL)小膠質(zhì)細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示小膠質(zhì)細(xì)胞特異性O(shè)X-42表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)95%，存活率>95%；在顯微鏡下小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)以阿米巴樣、長(zhǎng)梭形及馬鞍形為主；純化培養(yǎng)72 h后小膠質(zhì)細(xì)胞的靜止型細(xì)胞數(shù)和靜止率最高。結(jié)論： 振搖法分離小膠質(zhì)細(xì)胞純化培養(yǎng)72 h,可獲得最高的靜止型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)和靜止率。

[關(guān)鍵詞]大鼠,Sprague-Dawley； 小膠質(zhì)細(xì)胞； 培養(yǎng)； 振搖法； 純化； 鑒定

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的3種膠質(zhì)細(xì)胞之一，其數(shù)量約占總膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的10%，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，具有與外周巨噬細(xì)胞最相似的結(jié)構(gòu)和功能[1-2]。小膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)釋放促炎或抗炎介質(zhì)對(duì)機(jī)體感染或損傷作出快速反應(yīng)，影響疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。因此建立一種在體外培養(yǎng)并能進(jìn)行鑒定的腦小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的方法尤為重要[4]，本研究用振搖法分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞并鑒定，探索乳鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定方法，報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試劑

新生1～2 d的SD乳鼠(由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體質(zhì)量5～8 g。北美胎牛血清(FBS) ，DMEM/F12培養(yǎng)基，胰酶(含EDTA，0.25%)，Hanks液，PBS液，青霉素-鏈霉素溶液，GlutaMax；多聚L-賴氨酸，脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DnaseⅠ)，小鼠單克隆抗體CD11b/c(OX-42)。4%多聚甲醛溶液，山羊抗兔二抗異硫氰酸熒光素(FITC)，封閉山羊血清，抗熒光衰減封片劑及細(xì)胞核染料(DAPI)。

1.2方法

1.2.1混合膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)將1～2 d的新生SD乳鼠用CO2吸入法處死后，無(wú)菌條件下取出腦組織，放入Hanks液中浸泡，僅保留雙側(cè)大腦半球，仔細(xì)將腦膜和血管剝離，再放入DMEM/F12 培養(yǎng)基中剪碎，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入等量0.25%的胰酶消化液，37 ℃消化4 min，按1∶1比例加入含10%胎牛血清、1%雙抗、1% DMEM /F12高糖完全培養(yǎng)基終止消化，加入適量的DnaseⅠ(30 000 U/L)，37 ℃消化2 min， 200目過(guò)濾，收集濾液，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞沉淀懸浮后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2×106個(gè)接種至用0.001%多聚L-賴氨酸包被的75 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，24 h后全量換液；之后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，約3 d進(jìn)行一次半量換液，培養(yǎng)至第7～9天時(shí)可見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞分層，下層細(xì)胞連成片主要是神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞鋪展均勻，上層細(xì)胞為圓形或橢圓形，透光性好，主要是小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，收集上層細(xì)胞。

1.2.2分離及純化小膠質(zhì)細(xì)胞待原代細(xì)胞培養(yǎng)第7～9天，細(xì)胞充分分層生長(zhǎng)后，再繼續(xù)培養(yǎng)至第14天時(shí)，吸除約10 mL培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶口封口后放在37 ℃恒溫?fù)u床上200 r/min振蕩2 h，收集培養(yǎng)液直接接種至涂布0.001%多聚L-賴氨酸的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)箱放置約1 h，鏡下可見(jiàn)大部分細(xì)胞貼壁，此時(shí)半量換液1次，加入含10 %胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分離后的混合細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3 d ，第2次收取小膠質(zhì)細(xì)胞。

1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)染色取分離培養(yǎng)24 h的細(xì)胞爬片經(jīng)PBS液充分洗滌后，用4%的多聚甲醛固定15 min，用0.25% Triton處理20 min，10%正常山羊血清封閉，PBS洗3次(3 min/次)；分別加入一抗小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物0X-42抗體[5]，濃度為1∶50、1∶100及1∶250，37 ℃孵育2 h，PBS洗3次(3 min/次)；加入二抗山羊抗小鼠FITC ，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3次(3 min/次)；DAPI染核5 min，最后加入抗熒光淬滅封片劑封片。用激光共聚焦顯微鏡觀察、攝片。用PBS及正常牛血清代替一抗作為對(duì)照染色。FITC是一種綠色熒光染料，若0X-42表達(dá)會(huì)呈綠色；DAPI則是一種藍(lán)色染核染料，專(zhuān)染細(xì)胞核，如為藍(lán)色說(shuō)明所染細(xì)胞是活細(xì)胞或是有核細(xì)胞；活細(xì)胞陽(yáng)性率則用Merge進(jìn)行判斷，為FITC和DAPI二者染色的融合圖片。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1混合共培養(yǎng)時(shí)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)

第3天　　　　　　　　　　　第9天　　　　　　　　 第14天圖1　混合共培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞(200×)Fig.1　The growth of cultured microglia cells in different time points under the phase contrast microscope

混合共培養(yǎng)第3天時(shí)，相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞逐漸生長(zhǎng)，比較稀疏；培養(yǎng)至第9天時(shí)間細(xì)胞開(kāi)始分層，底部的細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突細(xì)胞，而上面圓形透光性好的為小膠質(zhì)細(xì)胞；第14天時(shí)，上層小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞分層明顯，底層細(xì)胞充分鋪展，緊密接觸，其上層主要為散在分布的阿米巴樣細(xì)胞，胞體圓形，透光性較底層細(xì)胞好，相差顯微鏡下可見(jiàn)胞體折光不均，為星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖1)。 2.2純化小膠質(zhì)細(xì)胞存活率

第1天　　　　　　　　　　 第2天　　　　　　　　　　第3天圖2　純化培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞(200×)Fig.2　Microglia cells in culture and purification

圖3　免疫組織化學(xué)染色鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞(200×)Fig.3　The expression of OX42 detected by immunohistochemistry for identification of microglias

將培養(yǎng)瓶置于37 ℃恒溫?fù)u床上以200 r/min振搖 2 h后，可見(jiàn)位于上層的小膠質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始懸浮，計(jì)數(shù)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)量為1.5 ×106個(gè)，存活率>95%。經(jīng)純化分離后的小膠質(zhì)細(xì)胞多在1 h左右貼壁，多為圓形，邊緣不規(guī)則；培養(yǎng)至第2天時(shí)部分細(xì)胞胞體回縮，少量細(xì)胞伸出突起，多為單極，也有呈雙極，部分細(xì)胞伸展為梭形、馬鞍形及不規(guī)則形，但部分細(xì)胞仍為圓形；培養(yǎng)至第3天時(shí)，見(jiàn)約半數(shù)細(xì)胞由活化態(tài)轉(zhuǎn)為靜止?fàn)顟B(tài)，即胞體狹長(zhǎng)， 可見(jiàn)不對(duì)稱分支，形態(tài)伸展為梭形、馬鞍形或不規(guī)則形(圖2)。0X-42染色顯示細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形、不規(guī)則形等形狀，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，呈草綠色；DAPI染色顯示細(xì)胞核被染成藍(lán)色，Merge后重疊率達(dá)95%以上，證明分離純化的細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞；一抗對(duì)照組DAPI染色雖可見(jiàn)細(xì)胞核也被染成藍(lán)色，但FITC無(wú)細(xì)胞著色，Merge重疊后未見(jiàn)細(xì)胞著色(圖3)。

2.3小膠質(zhì)細(xì)胞增殖

純化培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞總數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而各時(shí)間點(diǎn)靜止細(xì)胞數(shù)和靜止率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)， 24、48及72 h靜止細(xì)胞數(shù)和靜止率高于12 h(P<0.01)，72 h最高，見(jiàn)表1。

表1　純化培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞

(1)與12 h組比較，P<0.01；(2)與24 h組比較，P<0.01；(3)與48 h組比較，P<0.01

3討論

小膠質(zhì)細(xì)胞屬于單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，生理情況下，靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)遷移及吞飲的功能從而清除自身壞死組織及廢物，而活化的小膠質(zhì)細(xì)胞則可以通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及自我修復(fù)[6]；病理狀態(tài)下，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞在各種病原物質(zhì)的刺激下持續(xù)激活，不僅分泌多種炎性因子，還會(huì)產(chǎn)生大量一氧化氮、超氧陰離子、谷氨酸和其他神經(jīng)毒素，從而造成大腦的進(jìn)一步損傷[7]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腦出血后血腫中的血紅細(xì)胞裂解后，可釋放大量的凝血酶等細(xì)胞毒性物質(zhì)，這些細(xì)胞毒性物質(zhì)可直接產(chǎn)生氧自由基或通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞和(或)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基，而氧自由基可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成繼發(fā)性腦損傷[8-9]。因而，建立一種穩(wěn)定而優(yōu)化的培養(yǎng)及分離小膠質(zhì)細(xì)胞的方法，有助于小膠質(zhì)細(xì)胞和(或)巨噬細(xì)胞的吞噬功能及降低氧化應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)研究，對(duì)腦缺血、創(chuàng)傷等疾病的防治提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

常規(guī)的小膠質(zhì)細(xì)胞純化培養(yǎng)主要來(lái)源于McCarthy 建立的星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞純化培養(yǎng)的方法，之后國(guó)內(nèi)外也有人改良為手動(dòng)振搖法及消化法[10-12]。在前人的操作步驟中，筆者所在課題組在前期混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)選擇高密度膠質(zhì)細(xì)胞種植于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞約在第7～9天可出現(xiàn)分層現(xiàn)象，并且將振搖條件設(shè)定為200 r/min，2 h振搖細(xì)胞，振搖后不進(jìn)行離心分離細(xì)胞，直接將懸液種植于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，待1 h貼壁完全后進(jìn)行換液，這樣的操作可以收獲質(zhì)量好，數(shù)量多的小膠質(zhì)細(xì)胞。本次研究則發(fā)現(xiàn)，在提取細(xì)胞的操作中，應(yīng)盡量避免離心的過(guò)程，這樣能最大限度的減少細(xì)胞損傷，使得細(xì)胞很快從激活狀態(tài)轉(zhuǎn)換至靜息狀態(tài)，得到優(yōu)質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞；本研究中選擇小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗體0X-42[5]鑒定純化后培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)95 %以上。小膠質(zhì)細(xì)胞分為靜止型和激活型，本實(shí)驗(yàn)的另一目的為在體外建立一個(gè)穩(wěn)定的靜止型細(xì)胞模型，未后續(xù)研究提供正常生理?xiàng)l件下的細(xì)胞模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離后的小膠質(zhì)細(xì)胞在24、48及72 h的靜止細(xì)胞率顯著高于分離后12 h組，且以分離后72 h的靜止細(xì)胞數(shù)最多。為體外研究靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞提供可靠的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

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(2015-12-08收稿，2016-02-21修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Primary Culture and Identification of Microglias from Neonatal Rat Brain

HANG Hang, WU Guofeng, WANG Likun, ZHOU Haiyan

(DepartmentofEmergencyMedicine,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the method of primary culture and identification of microglia cells from the neonatal rats. Methods: The brain tissues from the neonatal SD rats were stamped, digested and co-cultured. The microglia cells were isolated and purified by shaking method and continued to be cultured. The cellular morphology was observed under phase contrast microscope at day three, day nine and day fourteen after co-culture, and the number of microglia cells was counted and survive rate was detected after purification and culture. Immunocytochemical staining method was adopted to count cell number of positive expression of specific OX-42 antibody of microglia cells and survive rate after purification and culture under confocal microscopy. The morphology was observed by the inverted phase contrast microscope, and the resting cell number and resting rate 12, 24, 48 and 72 hours after purification and culture were counted. Results: It was observed that there were abundant astrocytes of uneven refraction 14 days after shaking method and co-culture. Immunocytochemical stain showed that the method steadily produced 1.2×106 cells per flask (75 cm2,250 mL) with high survival rate (>95%) and the high positive rate (>95%)of expression of OX-42. Under the microscope, the morphology of microglia cells was mainly ameboid morphous, long spindle shape and saddle. The number of resting cells and the rate of resting cells were the highest 72 hours after purification and culture. Conclusion: The microglia cells were isolated and purified by shaking method and continued to be cultured for 72 hours and the highest resting cells number and resting rate can be obtained.

[Key words]rats,Sprague-Dawley; microglia cells; culture; shaking method; purification; identify

[中圖分類(lèi)號(hào)]R459.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)03-0272-04

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81460185/H09106)； 貴州省科技基金(2013-2043)

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)碩士研究生

***通信作者 E-mail:wuguofeng3013@sina.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-17網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1102.054.html