靳旺洋，訾紹霞，劉愛英

黑素細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展

靳旺洋，訾紹霞，劉愛英

靳旺洋

黑素細(xì)胞培養(yǎng)可對(duì)皮膚科及相關(guān)科室臨床及基礎(chǔ)研究提供一個(gè)良好的科研模型，同時(shí)對(duì)美容藥物開發(fā)也提供了很好的基礎(chǔ)。黑素細(xì)胞培養(yǎng)方法多種多樣，實(shí)際應(yīng)用中需要添加各種添加劑來滿足黑素細(xì)胞的生長，而不同的添加劑可對(duì)黑素細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響。在實(shí)際培養(yǎng)時(shí)需要根據(jù)目的來選擇不同的添加劑。

黑素細(xì)胞；添加劑；細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞因子

[J Pract Dermatol, 2016, 9(6):391-393]

黑素細(xì)胞分布廣泛，存在于人體多種組織，可見于表皮、毛囊、眼、血管周圍、外周神經(jīng)及交感神經(jīng)干、軟腦膜等結(jié)構(gòu)。黑素細(xì)胞來源于外胚層的神經(jīng)嵴[1]，在胚胎8～10周時(shí)逐漸遷移至皮膚，在成人表皮基底層中的黑素細(xì)胞總數(shù)約為20億，約占表皮細(xì)胞總數(shù)的2%～3%[2]。黑素細(xì)胞的主要功能是在黑素小體合成黑素顆粒，黑素顆粒進(jìn)入角質(zhì)形成細(xì)胞后像傘樣或者帽樣覆蓋于細(xì)胞核頂上方，保護(hù)細(xì)胞核免受紫外線輻射損傷[3]。離體培養(yǎng)的黑素細(xì)胞為在體外研究各種因素對(duì)黑素細(xì)胞的增生、酪氨酸酶的活性、色素代謝的影響及黑素細(xì)胞形態(tài)的變化提供了重要的細(xì)胞模型。黑素細(xì)胞占皮膚比例較小，且分裂能力較低，因此黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)比較困難。體外培養(yǎng)時(shí)過度增生的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞使黑素細(xì)胞在體外環(huán)境下生長增生更加困難[4]。隨著科技的發(fā)展，體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞的技術(shù)和體系逐步得到優(yōu)化，為研究皮膚病理生理學(xué)、皮膚細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、藥物篩選及治療提供了重要的手段和良好的模型，具有很強(qiáng)的科研價(jià)值。在黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常會(huì)添加各種添加劑來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長，如各種細(xì)胞因子、某些低濃度的致癌劑等，來充當(dāng)黑素細(xì)胞的有絲分裂劑。本文對(duì)健康人表皮黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)中輔助添加劑的作用作一綜述，以期作為黑素細(xì)胞培養(yǎng)的參考。

1 細(xì)胞因子對(duì)黑素細(xì)胞的影響

1.1 堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）對(duì)黑素細(xì)胞的影響

bFGF 不僅是黑素細(xì)胞的促分裂劑，還是酪氨酸酶受體和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的激活劑[5]，刺激黑素細(xì)胞色素的生成及樹突生長。Abdel-Malek等[6]發(fā)現(xiàn)在黑素細(xì)胞培養(yǎng)液中加入bFGF可促進(jìn)黑素細(xì)胞的增生，同時(shí)發(fā)現(xiàn)bFGF能促進(jìn)黑素細(xì)胞樹突的形成。有研究證明，bFGF還能增加黑素細(xì)胞酪氨酸酶的活性，且對(duì)黑素細(xì)胞的作用有最適濃度，分別為0.6 μg/L（促增生）、1.5 μg/L（促酪氨酸酶合成）[7]。bFGF對(duì)靶細(xì)胞發(fā)生效應(yīng)的可能機(jī)制為：bFGF與相應(yīng)受體結(jié)合后，①激活腺苷酸環(huán)化酶與鳥苷酸環(huán)化酶；②激活磷脂酶C，通過肌醇脂代謝途徑產(chǎn)生第二信使(三磷酸肌醇和甘油二酯)，導(dǎo)致蛋白激酶C激活，鈣離子內(nèi)流；③與bFGF相關(guān)聯(lián)的酪氨酸激酶活化而發(fā)揮作用；④bFGF與受體結(jié)合后產(chǎn)生配體受體復(fù)合物胞吞，胞吞后的bFGF大部分被進(jìn)一步轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，影響RNA聚合酶Ι，加強(qiáng)核糖體的轉(zhuǎn)錄，以加速細(xì)胞由G0期到G1期和G1期到S期的轉(zhuǎn)換，刺激DNA合成增強(qiáng)，促使細(xì)胞的分裂與增生[4-17]。有學(xué)者嘗試用bFGF作為培養(yǎng)基的組分進(jìn)行黑素細(xì)胞的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)能更有效地培養(yǎng)出黑素細(xì)胞，細(xì)胞從接種到貼壁的時(shí)間較短，1周就能進(jìn)入指數(shù)生長期；且發(fā)現(xiàn)小牛血清可進(jìn)一步地增強(qiáng)這種促進(jìn)作用[8]。因此黑素細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)可以適量添加bFGF，但其最適濃度目前尚無明確的數(shù)據(jù)。

1.2 α-促黑素細(xì)胞刺激素對(duì)黑素細(xì)胞的影響

α-促黑素細(xì)胞刺激素（α-melanophore stimulating hormone，α-MSH）能提高黑素細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，進(jìn)而促進(jìn)黑素細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)其樹突的形成[9,11]；在含α-MSH的培養(yǎng)條件下，體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞形成樹突的數(shù)目增加，形態(tài)亦更接近于體內(nèi)狀態(tài)[5]。

1.3 神經(jīng)生長因子對(duì)黑素細(xì)胞的影響

黑素細(xì)胞在受到損傷時(shí)表達(dá)神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）受體，提示NGF可能是這類細(xì)胞的生存因子；有學(xué)者觀察到NGF不會(huì)促進(jìn)黑素細(xì)胞的分裂[1,12,13]。學(xué)者分別用添加了NGF和抗NGF抗體（anti-NGF monoclonal antibody）的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)黑素細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對(duì)黑素細(xì)胞樹突數(shù)量和細(xì)胞間接觸并無影響[14]。NGF可以使黑素細(xì)胞磷酸化[15]，從而影響黑素細(xì)胞的功能。因此培養(yǎng)液中是否必須添加NGF還有待進(jìn)一步探索。

1.4 內(nèi)皮素-1對(duì)黑素細(xì)胞的影響

內(nèi)皮素-1（（endothelin-1，ET-1）可以促進(jìn)黑素細(xì)胞生長、黑素合成、黑素細(xì)胞樹突形成、細(xì)胞黏附[16]。因此在培養(yǎng)基中添加ET-1可以形成一個(gè)合適的環(huán)境，以促進(jìn)黑素細(xì)胞的增生，但其最適濃度可能需要根據(jù)培養(yǎng)目的的不同來調(diào)整。

1.5 白細(xì)胞介素對(duì)黑素細(xì)胞的影響

白細(xì)胞介素（IL）-4對(duì)體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞活力有抑制作用，能使細(xì)胞增生能力降低，黑素合成減少，增加黑素細(xì)胞的凋亡率[17]。IL-6對(duì)體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞活力有抑制作用，能使細(xì)胞增生能力降低，黑素合成減少，增加黑素細(xì)胞的凋亡率[18]。IL-8 對(duì)體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞活力有增強(qiáng)作用，能使細(xì)胞增生能力和黑素合成增加，但對(duì)黑素細(xì)胞的凋亡率無顯著影響[19]。濃度適當(dāng)時(shí)，IL-10對(duì)體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞的增生起到促進(jìn)作用；而IL-22和IL-23在高濃度時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞的生長和酪氨酸的活性均有抑制作用[20,21]。有研究表明，一定濃度的IL-23對(duì)體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞的增生起抑制作用，并有促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制酪氨酸酶活性的作用[22]。角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的物質(zhì)可以調(diào)控黑素細(xì)胞的增生與分化，有研究表明角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的IL-33可直接或間接抑制黑素細(xì)胞的增生[23]。

1.6 腫瘤壞死因子對(duì)黑素細(xì)胞的影響

腫瘤壞死因子α對(duì)黑素細(xì)胞活力有抑制作用，能使細(xì)胞增生能力降低，黑素合成減少，增加黑素細(xì)胞的凋亡率[24,25]。有學(xué)者用IL-17 和腫瘤壞死因子作用于體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-17和腫瘤壞死因子可協(xié)同影響黑素細(xì)胞的增生和黑素合成[21]。

2 霍亂毒素與十四烷酰佛波醇己酯

2.1 霍亂毒素對(duì)黑素細(xì)胞的影響

1982年Eisinger和Marko首次報(bào)告成功大量培養(yǎng)出了黑素細(xì)胞，所用的培養(yǎng)液中就添加了霍亂毒素（cholera toxin，CT）[26]，CT可增加黑素細(xì)胞cAMP的水平[12-13,26]，促進(jìn)黑素細(xì)胞DNA的合成。

2.2 十四烷酰佛波醇己酯對(duì)黑素細(xì)胞的影響

同樣Eisinger和Marko的培養(yǎng)液中也添加了十四烷酰佛波醇己酯（phorbol myristate acetate，TPA），TPA能促進(jìn)黑素細(xì)胞的附著和增生，而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的附著和增生。有學(xué)者用不含CT和TPA的培養(yǎng)基（Mel-mix培養(yǎng)基）成功培養(yǎng)出了黑素細(xì)胞，并與含CT和TPA的培養(yǎng)液培養(yǎng)出的黑素細(xì)胞的相關(guān)指標(biāo)做了比較，結(jié)果顯示Mel-mix培養(yǎng)基在某些方面優(yōu)于傳統(tǒng)含有CT和TPA的方法。

CT和TPA在促進(jìn)細(xì)胞增生的同時(shí)具有細(xì)胞毒性，且有致癌的風(fēng)險(xiǎn)，限制了其在黑素細(xì)胞移植方面的應(yīng)用。目前很多學(xué)者在研究不添加此兩種成分能否培養(yǎng)出滿意的黑素細(xì)胞。有學(xué)者用添加了白血病抑制因子（leukaemia inhibitory facyor，LIF）和毛喉素（forskolin）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基成功培養(yǎng)出了大量活力良好的黑素細(xì)胞[27]，可以避免使用CT或TPA等具有毒性的物質(zhì)。

3 小結(jié)

黑素細(xì)胞培養(yǎng)作為研究色素性皮膚病甚至皮膚相關(guān)疾病的一個(gè)手段，其培養(yǎng)方法隨著科技的進(jìn)步會(huì)更加完善。不同的培養(yǎng)液及添加成分會(huì)對(duì)黑素細(xì)胞造成不同的影響，因此需要根據(jù)研究目的或應(yīng)用目的來選擇不同的培養(yǎng)液及添加成分[28]。目前對(duì)于實(shí)驗(yàn)室研究，添加CT 和TPA的培養(yǎng)基是比較常見的，目前仍有應(yīng)用。多數(shù)是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MCDB153，1640等）加入相應(yīng)濃度的CT或者TPA及其他輔助的物質(zhì)。目前也有公司專門生產(chǎn)黑素細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品：Promocell 公司的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基分為含TPA和不含TPA兩種。M-254-500培養(yǎng)基也是一個(gè)已經(jīng)上市的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基。對(duì)于白癜風(fēng)患者的細(xì)胞移植，有學(xué)者用F12培養(yǎng)基添加bFGF，CT，胎牛血清等物質(zhì)可以成功培養(yǎng)出供移植的細(xì)胞[29]。M-254-500培養(yǎng)基也是一個(gè)已經(jīng)上市的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基。也可用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)表皮混懸液來進(jìn)行細(xì)胞移植。黑素細(xì)胞培養(yǎng)過程復(fù)雜，培養(yǎng)液的配制是整個(gè)過程的關(guān)鍵，但僅僅配制好培養(yǎng)液是不夠的，還需要做好以后每一步來確保細(xì)胞順利生長。實(shí)驗(yàn)者應(yīng)該在培養(yǎng)開始時(shí)，認(rèn)真查閱文獻(xiàn)，甚至將實(shí)驗(yàn)的每一步寫在紙上，在實(shí)驗(yàn)時(shí)嚴(yán)格按照預(yù)定步驟操作，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，不斷改進(jìn)。

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Research progress on melanocyte cell culture

JIN Wang-yang，ZI Shao-xia，LIU Ai-ying
North China University of Science and Technology, Tangshan 063300, China

Melanocyte cell culture provides a good model for the research of dermatological department and related departments, also for the development of beauty products. Today, there is a variety of melanocyte cell culture methods can be used. In the practical application, various additives may be added to meet the growth of the cells, and different influence can be seen when different additives to be used, so additives should be selected according to the different purposes.

Melanocyte；Additive；Cell culture；Cell factor

R331

A

1674-1293(2016)06-0391-03

2016-07-18

2016-10-30）

（本文編輯 敖俊紅）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160612

063300 唐山，華北理工大學(xué)研究生院（靳旺洋），煤炭總醫(yī)院皮膚科（訾紹霞，劉愛英）

靳旺洋，碩士研究生，研究方向：色素性疾病的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail: 526584536@qq.com

劉愛英，E-mail: laydlr@163.com