黃斐然 王大光 駱丹

真皮黑素細(xì)胞的研究進(jìn)展

黃斐然 王大光 駱丹

真皮干細(xì)胞具有增殖和多向分化的潛能，角質(zhì)形成細(xì)胞通過表達(dá)Wnt3a和E鈣黏素來誘導(dǎo)真皮干細(xì)胞移行和分化為黑素細(xì)胞。研究表明，在黑素細(xì)胞形成過程中，真皮黑素細(xì)胞與表皮黑素細(xì)胞依賴的信號通路明顯不同，表皮黑素細(xì)胞高度依賴干細(xì)胞因子信號通路，而真皮黑素細(xì)胞高度依賴內(nèi)皮素3和肝細(xì)胞生長因子信號通路。目前關(guān)于色素痣痣細(xì)胞的來源尚不清楚，有研究認(rèn)為，痣細(xì)胞來源于能分化為黑素細(xì)胞的干細(xì)胞，真皮干細(xì)胞能分化為黑素細(xì)胞，是否是痣細(xì)胞的來源尚需進(jìn)一步研究。

黑素細(xì)胞；真皮；信號傳導(dǎo)；痣，色素；表皮

黑素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，神經(jīng)嵴細(xì)胞定向分化為成黑素細(xì)胞，成黑素細(xì)胞經(jīng)真皮移行到表皮，在表皮內(nèi)成黑素細(xì)胞增殖、分化為成熟的黑素細(xì)胞［1］。目前對表皮及毛囊內(nèi)黑素細(xì)胞的研究已較為深入，但對真皮內(nèi)黑素細(xì)胞的研究較少。概述真皮黑素細(xì)胞的來源、真皮黑素細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制及真皮黑素細(xì)胞與色素痣關(guān)系等的研究，有助于理解色素性疾病的發(fā)病機(jī)制。

1 人真皮干細(xì)胞（DSC）能分化為有功能黑素細(xì)胞

研究已發(fā)現(xiàn)，毛囊外毛根鞘隆突區(qū)存在黑素干細(xì)胞，小鼠和人毛囊外毛根鞘隆突區(qū)分離獲得的干細(xì)胞，在一定條件下能向黑素細(xì)胞分化。掌跖等無毛皮膚一樣富含黑素細(xì)胞，但沒有毛囊，這一現(xiàn)象提示黑素細(xì)胞很可能也來源于真皮。

1.1 真皮干細(xì)胞可分化為黑素細(xì)胞：Li等［2-4］將從人包皮中分離出來的DSC用HESCM4培養(yǎng)基培養(yǎng)，DSC能形成特征性的3D球（真皮球），這些細(xì)胞具有增殖的能力。DSC與神經(jīng)嵴干細(xì)胞相似，表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志神經(jīng)生長因子受體75（NGFRp75），而且具有多向分化的潛能，在不同細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，能分化為神經(jīng)細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。DSC與毛囊中的黑素干細(xì)胞不同，不表達(dá)黑素細(xì)胞標(biāo)志HMB45和酪氨酸相關(guān)蛋白1（TYRP1），但將DSC用黑素細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，分化的細(xì)胞表達(dá)黑素細(xì)胞標(biāo)志小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）、酪氨酸 酶 相 關(guān) 蛋 白 2 （TRP2）、S100、TYRP1 以 及HMB45，說明DSC能分化為黑素細(xì)胞。

Li等采用3D皮膚重建結(jié)構(gòu)進(jìn)一步證明了DSC能分化為表皮黑素細(xì)胞。這種皮膚重建結(jié)構(gòu)包含真皮和表皮，其中真皮是由膠原和成纖維細(xì)胞組成，表皮是由多層角質(zhì)形成細(xì)胞組成。將DSC形成的真皮球種植在重建皮膚的真皮中，單個(gè)細(xì)胞可從真皮球中移行出來，并逐漸向上移行，最終定位在真皮與表皮交界處的基底膜上，然后開始表達(dá)黑素細(xì)胞特異性標(biāo)記分子S100、TYRP1和HMB45，表明DSC能分化移行為表皮黑素細(xì)胞［2，5］。

作者單位：210029南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科

1.2 角質(zhì)形成細(xì)胞調(diào)控真皮干細(xì)胞移行并生成黑素細(xì)胞：角質(zhì)形成細(xì)胞在DSC形成黑素細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用，角質(zhì)形成細(xì)胞通過表達(dá)Wnt3a和E鈣黏素來誘導(dǎo)DSC移行和分化為成熟的表皮黑素細(xì)胞。既往研究發(fā)現(xiàn)，Wnt能夠抑制神經(jīng)嵴細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，并促使神經(jīng)嵴細(xì)胞向黑素細(xì)胞系分化，神經(jīng)嵴細(xì)胞缺失Wnt3a或其配體β連環(huán)蛋白（catenin）后，會導(dǎo)致分化的細(xì)胞不表達(dá)MITF和黑素細(xì)胞分化標(biāo)記，因此，Wnt3a信號是決定神經(jīng)嵴細(xì)胞向黑素細(xì)胞分化的關(guān)鍵信號分子［6］。Wnt維持 DSC穩(wěn)定并調(diào)節(jié)其分化，Zabierowski等［5］發(fā)現(xiàn)，DSC高表達(dá)Wnt5a信號，不表達(dá)Wnt3a信號，在DSC形成黑素細(xì)胞過程中需要經(jīng)歷Wnt5a向Wnt3a信號轉(zhuǎn)換過程。將DSC用含有Wnt3a的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，能分化為黑素細(xì)胞；把DSC放入3D皮膚重建結(jié)構(gòu)中時(shí)，沒有加入外源性的Wnt3a，依然能分化為表皮黑素細(xì)胞［2，5］。Jia 等［7］發(fā)現(xiàn)，表皮基底層表達(dá)Wnt3a，而角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的主要構(gòu)成細(xì)胞，因而推測可能是角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生Wnt3a誘導(dǎo)了DSC向黑素細(xì)胞分化。既往研究已證明，角質(zhì)形成細(xì)胞通過經(jīng)典的鈣黏素如E鈣黏素、N鈣黏素、P鈣黏素等決定黑素細(xì)胞在皮膚的定位，特別是E鈣黏素在引導(dǎo)黑素前體細(xì)胞到達(dá)表皮過程中起關(guān)鍵作用，黑素細(xì)胞丟失E鈣黏素后，將不受其臨近的角質(zhì)形成細(xì)胞控制，會發(fā)生定位錯(cuò)誤，甚至惡性轉(zhuǎn)變［8］。DSC既不表達(dá)E鈣黏素，也不表達(dá)N鈣黏素，在皮膚3D重建結(jié)構(gòu)的真皮中也沒有發(fā)現(xiàn)E鈣黏素陽性的細(xì)胞，而在表皮基底層上來源于DSC的黑素細(xì)胞在增加與角質(zhì)形成細(xì)胞的聯(lián)系后，表達(dá)E鈣黏素，因而Li等［2］認(rèn)為，在黑素細(xì)胞形成過程中，需通過E鈣黏素與其周邊的角質(zhì)形成細(xì)胞建立聯(lián)系，才能形成成熟的表皮黑素細(xì)胞。

研究表明，DSC是黑素細(xì)胞的儲庫之一，DSC在分化為表皮黑素細(xì)胞過程中，需要角質(zhì)形成細(xì)胞參與才能形成成熟的黑素細(xì)胞。

2 真皮黑素細(xì)胞與表皮黑素細(xì)胞的信號通路區(qū)別

許多信號通路和細(xì)胞因子在黑素細(xì)胞形成過程中發(fā)揮重要作用，其中干細(xì)胞因子（SCF）及其配體（Kit）、內(nèi)皮素（ET）3及ET受體B和肝細(xì)胞生長因子（HGF）及其配體（c-MET）的研究比較深入。這些細(xì)胞因子在參與調(diào)控表皮黑素細(xì)胞和真皮黑素細(xì)胞發(fā)揮生理功能過程中存在一定差異。

2.1 SCF-Kit：在表皮黑素細(xì)胞，SCF通過與其配體Kit結(jié)合調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞的存活、分化、移行和增生等SCF基因Mgf或其配體基因kit突變可導(dǎo)致小鼠全身毛色減退、頭部和腹部白斑。Kawaguchi等［9］通過轉(zhuǎn)基因的方法使鼠皮膚基底層細(xì)胞表達(dá)SCF，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鼠表皮黑素細(xì)胞較同窩正常鼠大量增加，并且出生后無明顯下降，當(dāng)皮下注射Kit特異性抗體ACK2后，阻斷了SCF與c-Kit的結(jié)合，黑素細(xì)胞迅速減少，停止注射后，皮膚的黑素細(xì)胞還可以恢復(fù)說明SCF-Kit具有維持表皮黑素細(xì)胞存活，促進(jìn)表皮黑素細(xì)胞增殖和分化的功能。對于真皮黑素細(xì)胞SCF-Kit不具有類似功能，真皮黑素細(xì)胞的生長過程中不需要SCF參與。Kunisada等［10］通過轉(zhuǎn)基因的方法使鼠皮膚基底層細(xì)胞表達(dá)HGF，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鼠真皮黑素細(xì)胞明顯增多，用ACK2注射HGF轉(zhuǎn)基因新生鼠和非轉(zhuǎn)基因新生鼠，在20 d時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鼠表現(xiàn)黑色皮膚和白色毛發(fā)，而對照組皮膚和毛發(fā)均為白色，通過組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因鼠皮膚真皮中富含黑素細(xì)胞，而對照組未發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞，說明真皮黑素細(xì)胞形成和維持并不依賴SCF-Kit途徑。

2.2 ET-3-ET受體B：ET-3主要作用是促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞增殖并向黑素細(xì)胞分化，ET-3-ET受體B在真皮黑素細(xì)胞形成過程中起重要作用，ET-3能夠促進(jìn)真皮黑素細(xì)胞生成，維持黑素細(xì)胞在真皮中的定位。Garcia等［11］通過轉(zhuǎn)基因的方法使鼠皮膚基底層細(xì)胞表達(dá)ET-3，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鼠與對照組鼠相比皮膚顏色加深，顏色加深的皮膚真皮中有黑素細(xì)胞，表皮中未發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞，對照組鼠表皮真皮中均未發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞。為了進(jìn)一步研究ET-3對真皮黑素細(xì)胞的作用，Aoki等［12］將 ET-3 轉(zhuǎn)基因鼠與 KitV620ATg斑駁病模型鼠交配，發(fā)現(xiàn)雙轉(zhuǎn)基因鼠即使是長白毛區(qū)域的皮膚顏色也變深，長白毛的皮膚毛囊中沒有黑素細(xì)胞，但真皮中有黑素細(xì)胞；而對照組SCF轉(zhuǎn)基因鼠與Kit V620A Tg斑駁病模型鼠交配后的雙轉(zhuǎn)基因鼠毛囊中沒有黑素細(xì)胞，真皮中也沒有黑素細(xì)胞。另外 Saldana-Caboverde 和 Kos［13］發(fā)現(xiàn)，ET-3或Ednrb的基因敲除小鼠黑素細(xì)胞幾乎全丟失Waardenburg綜合征Ⅳ型與ET-3基因或EDNR基因的突變有關(guān)，該病皮膚表現(xiàn)不僅有皮膚白斑，而且存在虹膜色素異常，表明ET-3能夠促進(jìn)真皮黑素細(xì)胞的生成，維持黑素細(xì)胞在真皮中的定位。

2.3 HGF-c-MET：HGF能促進(jìn)真皮黑素細(xì)胞分化和增殖［14］。在體外，HGF可促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖，在神經(jīng)嵴培養(yǎng)基加入HGF后，成黑素細(xì)胞數(shù)量變多、且向黑素細(xì)胞分化的數(shù)量變多，說明HGF-c-MET能夠促進(jìn)成黑素細(xì)胞增殖并向黑素細(xì)胞分化。在體內(nèi)，HGF能促進(jìn)表達(dá)其特異性受體c-MET的前體黑素細(xì)胞向真皮黑素細(xì)胞分化和增殖。與人不同，鼠出生后黑素細(xì)胞僅存在毛囊中，Kunisada等［10］通過轉(zhuǎn)基因的方法使鼠皮膚基底層細(xì)胞表達(dá)HGF，在鼠胚胎17.5天時(shí)，通過免疫組織分析發(fā)現(xiàn)，HGF轉(zhuǎn)基因鼠皮膚中TRP2陽性細(xì)胞大多分布在真皮和毛囊，雖然表皮上也有一些TRP2陽性細(xì)胞，但真皮中TRP2陽性細(xì)胞數(shù)量是表皮中的5倍，并且是正常對照組真皮中細(xì)胞2倍多，95%TRP2陽性細(xì)胞不表達(dá)c-Kit，基本都表達(dá)c-MET；而對照組同窩仔的TRP2陽性細(xì)胞大多分布在毛囊和表皮，毛囊中98%TRP2陽性細(xì)胞表達(dá)c-Kit，表皮中78%TRP2陽性細(xì)胞表達(dá)c-Kit。出生后，HGF轉(zhuǎn)基因鼠皮膚是黑色的，真皮中出現(xiàn)大量黑素細(xì)胞，在背部皮膚真皮中的黑素細(xì)胞數(shù)量比對照組高300倍，并且皮膚顏色一直保持不變，這說明真皮黑素細(xì)胞的形成和維持依賴HGF。HGF轉(zhuǎn)基因鼠真皮中黑素前體細(xì)胞不表達(dá)E鈣黏素，E鈣黏素是表皮黑素細(xì)胞表達(dá)的分子，對于黑素細(xì)胞進(jìn)入并定位于表皮至關(guān)重要。該結(jié)果結(jié)合轉(zhuǎn)HGF基因鼠真皮中存在大量黑素細(xì)胞現(xiàn)象，很可能說明HGF通過下調(diào)細(xì)胞E鈣黏素的表達(dá)，從而使黑素前體細(xì)胞不能進(jìn)入表皮而定位在真皮中，形成了真皮黑素細(xì)胞的大量聚集。盡管轉(zhuǎn)HGF基因鼠表皮中的黑素細(xì)胞與對照組相比也有增多，但與真皮相比可忽略不計(jì)，并且表皮中的黑素細(xì)胞隨著鼠生長逐漸消失，說明HGF不能維持表皮黑素細(xì)胞的存活。

通過以上研究結(jié)果可以得出：表皮黑素細(xì)胞高度依賴SCF-Kit信號通路，而真皮黑素細(xì)胞則高度依賴ET-3-Ednrb信號通路和HGF-c-MET信號通路。

3 真皮黑素細(xì)胞與痣的形成

目前色素痣的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，關(guān)于痣細(xì)胞的來源也無定論［15］。有人認(rèn)為，痣細(xì)胞來源于表皮黑素細(xì)胞，也有人提出，色素痣黑素細(xì)胞是由能分化為黑素細(xì)胞的干細(xì)胞而來，包括毛囊干細(xì)胞和真皮干細(xì)胞，而是由已分化的黑素細(xì)胞而來。早期研究認(rèn)為，痣的形成符合Abtropfung概念，該概念為痣細(xì)胞來源于表皮黑素細(xì)胞，隨著時(shí)間的推移，逐漸下降到真皮，在這一過程中相繼形成了交界痣、復(fù)合痣和皮內(nèi)痣［16］。然而，Worret和 Burgdorf［17］通過對來自各年齡段3534例患者的痣進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)＜10歲患者的痣沒有交界痣，多數(shù)是皮內(nèi)痣，而＞60歲患者的痣12%是交界痣，這與Abtropfung概念不相符，說明痣不太可能開始于表皮黑素細(xì)胞。此外，Grichnik等［15］發(fā)現(xiàn)，藍(lán)痣缺乏表皮成分，也說明痣不太可能起源于表皮黑素細(xì)胞。

Krengel［16］認(rèn)為，色素痣可能來源于毛囊干細(xì)胞，已發(fā)現(xiàn)在鼠毛囊隆突部存在能夠分化為黑素細(xì)胞的黑素干細(xì)胞。有臨床證據(jù)表明，部分先天性色素痣來源于與毛囊緊密相關(guān)的細(xì)胞，例如，先天性痣切除后再生的痣圍繞毛囊生長。然而，毛囊模式并不符合大多數(shù)先天性痣，尤其是在無毛的掌跖皮膚出現(xiàn)的先天性痣。真皮干細(xì)胞已從人無毛皮膚中分離出來了，也具有分化為黑素細(xì)胞的潛能，因而推測，痣有可能來源于DSC。Kinsler等［18］對66例先天性痣的樣本進(jìn)行分析，通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)樣本痣細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記巢蛋白（nestin），而DSC也表達(dá)巢蛋白，先天性痣的基底層上有明顯的正常表皮黑素細(xì)胞，推測這是因?yàn)轲胧怯珊谒丶?xì)胞移行后留下的能分化為黑素細(xì)胞的細(xì)胞發(fā)生突變增殖形成的，而不是有由已分化的表皮黑素細(xì)胞增殖形成。另外先天性痣的超微結(jié)構(gòu)顯示有不規(guī)則和缺口的細(xì)胞核、細(xì)胞核中有夾雜物、增多的纖毛和中心粒、痣巢被基板包繞（痣巢是由分開的單個(gè)細(xì)胞增殖形成的），這些特點(diǎn)均與干細(xì)胞相似。綜上所述，真皮干細(xì)胞很可能是痣細(xì)胞的來源。

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Advances in dermal melanocytes

Huang Feiran,Wang Daguang,Luo Dan.Department of Dermatology and Venereology,First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

Dermal stem cells （DSCs） have great proliferation and multidirectional differentiation potential.Keratinocytes can induce DSCs to migrate and differentiate into melanocytes by expressing Wnt-3a and E-cadherins.Researches have indicated that the generation of dermal and epidermal melanocytes is dependent on different signaling pathways.More concretely,epidermal melanocyte generation is highly dependent on the stem cell factor （SCF） signaling pathway,while dermal melanocyte generation on the endothelin 3 （ET3） and hepatocyte growth factor （HGF） signaling pathways.The origin of nevus cells in pigmented nevus is not yet clear.Some studies suggest that nevus cells may derive from the stem cells which can differentiate into melanocytes.DSCs can differentiate into melanocytes,but further research is needed to determine whether they are the source of nevus cells.

Melanocytes;Dermis;Signal transduction;Nevus,pigmented;Epidermis

Wang Daguang,Email:wangirwin@126.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.04.018

國家自然科學(xué)基金（81000703）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2009437）

王大光，Email：wangirwin@126.com

本文主要縮寫：DSC：真皮干細(xì)胞，NGFRp75：神經(jīng)生長因子受體75，SCF：干細(xì)胞因子，ET：內(nèi)皮素，Ednrb：內(nèi)皮素受體 B，HGF：肝細(xì)胞生長因子，MITF：小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，TYRP1：酪氨酸酶相關(guān)蛋白1，TRP2：酪氨酸酶相關(guān)蛋白2

2014-07-04）