許淑芬　王英凱　劉　磊　孫牧男　譚　巖　方艷秋(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，吉林　長春　130021)

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順鉑通過抑制RIP活性增強(qiáng)rhTRAIL殺傷肺癌A549細(xì)胞

許淑芬王英凱劉磊孫牧男譚巖方艷秋
(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心，吉林長春130021)

〔摘要〕目的探討順鉑( DDP)通過抑制受體相互作用蛋白( RIP)增強(qiáng)肺癌細(xì)胞A549對腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體( TRAIL)敏感性的分子機(jī)制。方法Western印跡檢測順鉑、Nec－1作用A549細(xì)胞后RIP的蛋白表達(dá)。MTT法檢測聯(lián)合應(yīng)用DDP+ rhTRAIL和Nec－1 +rhTRAIL作用后A549細(xì)胞的生長抑制率。Western印跡檢測DDP+ rhTRAIL和Nec－1+rhTRAIL對A549凋亡相關(guān)蛋白caspase－8的活化情況。流式細(xì)胞儀檢測DDP+ rhTRAIL和Nec－1 +rhTRAIL作用后對A549細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果DDP和Nec－1能顯著降低A549細(xì)胞中RIP的蛋白水平，DDP、Nec－1聯(lián)合rhTRAIL可以實(shí)現(xiàn)caspase－8的活化，促進(jìn)rhTRAIL對A549細(xì)胞的殺傷作用，凋亡率從( 5．9±4．93) %提高到( 60．5±4．93) %和( 64．1±5．17) %( P＜0．01)。抑制率分別提高到( 65．5±4．93) %和( 76．3±9．52) %( P＜0．01)。結(jié)論抑制RIP蛋白活性能增加A549細(xì)胞對rhTRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性，有利于促進(jìn)rhTRAIL蛋白在治療NSCLC方面的應(yīng)用。

〔關(guān)鍵詞〕重組TRAIL蛋白;受體相互作用蛋白;順鉑;非小細(xì)胞肺癌

腫瘤壞死因子( TNF)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體( TRAIL)是一種殺傷腫瘤的細(xì)胞因子，是TNF家族成員之一，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對正常細(xì)胞無殺傷作用〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)TRAIL蛋白可以誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌( NSCLC)發(fā)生凋亡，但部分NSCLC對 TRAIL顯示耐藥，限制了TRAIL廣泛應(yīng)用〔2〕。受體相互作用蛋白( RIP)在細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮了重要作用〔3〕，在促細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，RIP的C末端死亡結(jié)構(gòu)域能與TRAIL受體蛋白相互作用，形成復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔4〕。Nec－1是RIP的高度特異性抑制劑，通過變構(gòu)抑制RIP1的活性〔5〕。本研究分別應(yīng)用順鉑( DDP)和Nec－1抑制RIP表達(dá)，探討抑制RIP表達(dá)能否增強(qiáng)rhTRAIL蛋白誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞凋亡。

1材料與方法

1. 1主要材料細(xì)胞株A549由本室保存;重組rhTRAIL由本室制備純化〔2〕; IMDM培養(yǎng)基、胰蛋白酶( Gibco公司) ;小牛血清(杭州四季青生物材料公司) ; Nec－1( Calbiochem公司) ;鼠抗人抗caspase－8、鼠抗人抗RIP( BD Pharmingen公司) ;兔抗人βactin單克隆抗體( Santa Cruz公司) ;四甲基偶氮唑藍(lán)( MTT) ( Sigma公司) ;生物素標(biāo)記的馬抗小鼠IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素(北京晶美公司)。

1. 2 DDP、Nec－1對RIP的抑制復(fù)蘇NSCLC A549細(xì)胞株，采用IMDM培養(yǎng)液(含10%滅活胎牛血清)在37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)傳代，生長至對數(shù)生長期。5× 105個(gè)/ml接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分為加入5 μg/ml DDP、10 μg/ml Nec－1、對照A549細(xì)胞、培養(yǎng)液四組，作用24 h后，免疫印亦觀察A549細(xì)胞的RIP蛋白水平。

1. 3 Western印跡檢測RIP蛋白表達(dá)加入DDP、Nec－1后24 h收集各組A549細(xì)胞，用裂解液制備總蛋白，測定蛋白含量并調(diào)整濃度為10 μg/μl。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉。加入稀釋的小鼠抗RIP工作液，4℃振搖孵育過夜，加入二抗室溫下孵育。TBST液洗膜，加入顯色劑DAB，室溫下顯色。以β－actin作為內(nèi)參照，檢測各組細(xì)胞RIP蛋白表達(dá)情況。

1. 4 MTT法檢測A549細(xì)胞抑制率將5×105/ml NSCLC A549株細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔100 μl。分別加入DDP+ rhTRAIL( 100 ng/ml)、25 μg/ml Nec－1+ rhTRAIL( 100 ng/ml)、rhTRAIL及空白對照組，每組設(shè)3平行孔，培養(yǎng)24 h后，加入新配制的5 mg/ml MTT 20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，棄上清加入150 μl DMSO溶解，混勻后在490 nm處測定吸光度。

1. 5 caspase－8活化的檢測Western印跡測定DDP+ rhTRAIL ( 100 ng/ml)、25 μg/ml Nec－1+ rhTRAIL( 100 ng/ml)、rhTRAIL及空白對照組作用A549細(xì)胞株后caspase－8活化表達(dá)(方法同1. 3)。

1. 6 A549細(xì)胞凋亡率的檢測取生長狀態(tài)良好的A549細(xì)胞接種于6孔板中，分別加入DDP + rhTRAIL ( 100 ng/ml)、25 μg/ml Nec－1+ rhTRAIL( 100 ng/ml)、rhTRAIL作用，培養(yǎng)24 h后收集A549細(xì)胞，AnnexinV－FITC/PI染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11．5軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2. 1 DDP、Nec－1對A549細(xì)胞中RIP表達(dá)的抑制蛋白印跡結(jié)果顯示，DDP、Nec－1作用于A549細(xì)胞24 h后，RIP蛋白表達(dá)量顯著降低(圖1)。

1．空白對照; 2．rhTRAIL; 3．DDP+rhTRAIL; 4．Nec－1+ rhTRAIL;圖3同圖1 DDP、Nec-1對A549細(xì)胞中RIP蛋自表達(dá)的影響

2. 2 MTT法檢測A549細(xì)胞增殖抑制率單獨(dú)應(yīng)用rhTRAIL作用A549細(xì)胞24 h后，細(xì)胞生長抑制率僅為( 7．62±0．62) %; Nec－1+rhTRAIL作用24 h后，A549細(xì)胞的生長抑制率增加到( 76．3±9．52) %; DDP+ rhTRAIL作用24 h后，A549細(xì)胞的生長抑制率為( 65．47±4．93) %。Nec－1+rhTRAIL、DDP+ rhTRAIL均能顯著增強(qiáng)rhTRAIL對A549細(xì)胞的殺傷活性( P＜0．01)，Nec－1+rhTRAIL與DDP+rhTRAIL組比較，A549細(xì)胞的生長抑制率差異不顯著( P＞0．05)，見圖2。

2. 3 caspase－8活化的檢測DDP、Nec－1均有助于55 kD的caspase－8蛋白活化成為具有催化活性的43 kD caspase－8，促進(jìn)rhTRAIL蛋白誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，見圖3。

圖2 DDP聯(lián)合rhTRAIL對A549細(xì)胞增殖的抑制作用

圖3蛋自印跡分析A549細(xì)胞內(nèi)caspase-8的表達(dá)

2. 4 A549細(xì)胞凋亡率的檢測DDP + rhTRAIL和Nec－1+ rhTRAIL組的平均凋亡率分別為( 60．52±4．93) %和( 64．12± 5．17) %，顯著高于rhTRAIL組的( 5．9±4．93) %，提示抑制RIP表達(dá)能促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

3討論

TRAIL凋亡療法被認(rèn)為是一種極具潛力的抗腫瘤治療策略。TRAIL蛋白可以有效殺傷NSCLC細(xì)胞，但一些TRAIL耐藥株的出現(xiàn)制約了其應(yīng)用〔6〕。TRAIL對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用主要是通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)凋亡信號通路的活化完成〔7〕。研究證實(shí)，在多種耐藥細(xì)胞株中，某些凋亡抑制基因的過表達(dá)是導(dǎo)致凋亡信號終止的重要因素〔8〕。RIP的高表達(dá)能夠激活I(lǐng)－κB激酶( IKK)復(fù)合物，磷酸化I－κB，使其被泛素－蛋白酶體途徑降解，并從NF－κB/I－κB異二聚體中脫離。此時(shí)，NF－kB活化并可轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，調(diào)節(jié)其下游的靶基因IL－6、A20等的表達(dá)，這些蛋白可以減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔9，10〕。

本研究證實(shí)，rhTRAIL蛋白作用A549細(xì)胞后，caspase－8未能被活化，其誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡率很低，A549細(xì)胞表現(xiàn)出對rhTRAIL蛋白耐藥;聯(lián)合應(yīng)用DDP及RIP抑制劑Nec－1均可有效下調(diào)RIP的表達(dá)，同時(shí)，caspase－8裂解帶出現(xiàn)，說明DDP聯(lián)合TRAIL作用A549細(xì)胞是通過下調(diào)RIP蛋白并活化caspase－8蛋白、激活了細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路來實(shí)現(xiàn)的。綜上所述，RIP參與了DDP聯(lián)合rhTRAIL誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的凋亡，使caspase－8蛋白表達(dá)活化，凋亡信號通路開放，促進(jìn)了rhTRAIL蛋白對A549細(xì)胞的生長抑制作用，為更好地開展TRAIL治療NSCLC提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

4參考文獻(xiàn)

1 Parkin DM，Brav F，F(xiàn)erlay J，et al．Global cancer statistics，2002〔J〕．CA Cancer J Clin，2005; 55( 2) : 74－108．

2劉磊，方艷秋，譚巖，等．重組可溶性TRAIL表達(dá)及誘導(dǎo)A549 和H460wt細(xì)胞凋亡〔J〕．吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008; 34( 2) : 270－3．

3 Declercq W，Vanden Berghe T，Vandenabeele P，et al．RIP kinases at the crossroads of cell death and survival〔J〕．Cell，2009; 138( 2) : 229－32．

4 Festjens N，Vanden Berghe T，Cornelis S，et al．RIP1，a kinase on the crossroads of a cell's decision to live or die〔J〕．Cell Death Differ，2007; 14( 3) : 400－10．

5 Degterev A，Hitomi J，Germscheid M，et al．Identification of RIP1 kinase as a specific cellular target of necrostatins〔J〕．Nat Chem Biol，2008; 4 ( 5) : 313－21．

6 Sun SY，Yue P，Zhou JY，et al．Overexpression of BCL2 blocks TNF－related－apoptosis－inducing ligand ( TRAIL)－induced apoptosis in human lung cancer cells〔J〕．Biochem Biophys Res Commun，2001; 280( 3) : 788－98．

7 Ashkenazi A，Pai RC，F(xiàn)ong S，et al．Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand〔J〕．J Clin Invest，1999; 104( 2) : 155－62．

8 Kim YS，Jin，HO，Seo SK，et al．Sorafenib induces apoptotic cell death in human non－small cell lung cancer cells by down－regulating mammalian target of rapamycin mTOR－dependent survivin expression〔J〕．Biochem Pharmacol，2011; 82( 3) : 216－26．

9 Tomasella A，Blangy A，Brancolini C．A receptor interacting protein 1 ( RIP1)－independent necrotic death under the control of protein phosphatase PP2A that involves the reorganization of actin cytoskeleton and the action of cofilin－1〔J〕．J Biol Chem，2014; 289: 25699－710．

10 Zhang YF，He W，Zhang C，et al．Role of receptor interacting protein ( RIP) 1 on apoptosis－inducing factor－mediated necroptosis during acetaminophen－evoked acute liver failure in mice〔J〕．Toxicol Lett，2014; 225: 445－53．

〔2015－11－12修回〕

(編輯郭菁)

通訊作者:譚巖( 1956－)，男，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤生物治療的臨床及基礎(chǔ)研究。

基金項(xiàng)目:吉林省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目( 20082036)

〔中圖分類號〕R734. 2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0276-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 009

第一作者:許淑芬( 1962－)，女，主任技師，主要從事免疫與分子生物學(xué)技術(shù)研究。