趙永峰，王　仙

荊州市第一人民醫(yī)院血液科，湖北 荊州 434000

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*通信作者

Cereblon在多發(fā)性骨髓瘤中的研究進(jìn)展及臨床意義

趙永峰，王仙*

荊州市第一人民醫(yī)院血液科，湖北 荊州 434000

[摘要]以沙利度胺、來(lái)那度胺、泊馬度胺為代表的免疫調(diào)節(jié)藥物，對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤患者的治療反應(yīng)率及預(yù)后產(chǎn)生了重要影響。Cereblon(CRBN)，最初發(fā)現(xiàn)與常染色體隱性遺傳非綜合征性智力發(fā)育遲緩相關(guān)，近年研究已經(jīng)證明其不僅為沙利度胺致畸作用的靶點(diǎn)，還與免疫調(diào)節(jié)藥物抗骨髓瘤作用的臨床反應(yīng)率及患者的生存時(shí)間相關(guān)；目前認(rèn)為，CRBN可能是通過(guò)形成DDB1-CUL4-ROC1泛素連接酶復(fù)合物介導(dǎo)抗骨髓瘤活性。還需要更多有關(guān)CRBN分子機(jī)制及臨床相關(guān)性研究以促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)藥物耐藥機(jī)制的進(jìn)一步發(fā)展以及更有效、低毒性的藥物出現(xiàn)，提高多發(fā)性骨髓瘤患者的生存質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞]多發(fā)性骨髓瘤；免疫調(diào)節(jié)藥物；Cereblon

0引言

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一種惡性漿細(xì)胞腫瘤，以貧血、腎功能損害、反復(fù)感染、溶骨性骨破壞等為臨床表現(xiàn)，多發(fā)生于中、老年人。免疫調(diào)節(jié)藥物是多發(fā)性骨髓瘤治療方案中的重要基石，其對(duì)患者臨床緩解率的提高以及生存期的延長(zhǎng)產(chǎn)生了重要影響。

Cereblon(CRBN)作為沙利度胺致畸作用的主要分子靶標(biāo)而被發(fā)現(xiàn)，其對(duì)探討免疫調(diào)節(jié)藥物在多發(fā)性骨髓瘤中的作用機(jī)制具有重要意義，且近年來(lái)多數(shù)研究報(bào)道其與多發(fā)性骨髓瘤患者的反應(yīng)率和生存期相關(guān)。為了解CRBN與多發(fā)性骨髓瘤的臨床相關(guān)性以及可能的作用機(jī)制，筆者對(duì)其在多發(fā)性骨髓瘤中的相關(guān)研究作簡(jiǎn)要綜述。

1CRBN與免疫調(diào)節(jié)藥物的發(fā)現(xiàn)

1.1CRBN的發(fā)現(xiàn)CRBN基因位于3p染色體，作為輕型智力發(fā)育遲緩家族中編碼ATP依賴的Lon蛋白酶的基因而首次被發(fā)現(xiàn)[1]。廣泛分布于不同的組織，尤其是在腦組織中存在高水平表達(dá)，通過(guò)對(duì)腦組織裂解物的免疫沉淀，發(fā)現(xiàn)其可與大電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道(Large-conductance calcium-activated potassium channel，BKCa)α亞單位細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)的羧基末端直接相互作用，干擾該通道四聚體的組裝及細(xì)胞表面表達(dá)；此外,CRBN的Lon結(jié)構(gòu)域可與視網(wǎng)膜電壓門控性氯離子通道(ClC-2)羧基端的遠(yuǎn)側(cè)區(qū)相互作用[2-3]。Ito等[4]通過(guò)使用高性能的磁珠以及親和純化的方法，發(fā)現(xiàn)沙利度胺與CRBN蛋白結(jié)合，作為Cul4-DDB1 E3泛素連接酶復(fù)合物的底物受體發(fā)揮功能，第一次證明了CRBN可能為沙利度胺致畸作用的重要靶點(diǎn),該發(fā)現(xiàn)對(duì)于沙利度胺作用機(jī)制的研究具有里程碑式的意義。

1.2三代免疫調(diào)節(jié)藥物的發(fā)現(xiàn)沙利度胺為第一代免疫調(diào)節(jié)藥物，其用藥史經(jīng)歷了多重轉(zhuǎn)變：于上世紀(jì)50年代合成，在歐洲和加拿大，因?yàn)槠鋷椭呒版?zhèn)吐作用作為非處方藥而廣泛應(yīng)用；1961年德國(guó)“海豹肢癥”生長(zhǎng)缺陷嬰兒數(shù)量的增加，使其撤出市場(chǎng)；幾年之后，發(fā)現(xiàn)其可用于麻風(fēng)病的治療，于1998年在美國(guó)再次被應(yīng)用于臨床；1999年，Singhal等[5]首次將沙利度胺作為單藥用于治療難治性多發(fā)性骨髓瘤患者,顯示了較好的臨床有效性；隨后進(jìn)行了大量關(guān)于沙利度胺單藥或聯(lián)合地塞米松治療難治或復(fù)發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤的臨床試驗(yàn)。沙利度胺隨后被來(lái)那度胺取代，來(lái)那度胺為一個(gè)毒性較低但活性較高的衍生物，2006年被FDA批準(zhǔn)與地塞米松聯(lián)合用于治療復(fù)發(fā)或難治性多發(fā)性骨髓瘤。2013年，第三代免疫調(diào)節(jié)藥物泊馬度胺被批準(zhǔn)用于經(jīng)包括來(lái)那度胺及硼替佐米至少兩種藥物治療在內(nèi)的復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤患者。

2免疫調(diào)節(jié)藥物治療多發(fā)性骨髓瘤的相關(guān)研究

1999年，Singhal等[5]首次將沙利度胺用于治療多發(fā)性骨髓瘤，給藥劑量為200～800 mg/d，中位給藥天數(shù)為80 d，經(jīng)治療的總反應(yīng)率為32%，隨后進(jìn)行了許多關(guān)于沙利度胺治療難治或復(fù)發(fā)多發(fā)性骨髓瘤的臨床試驗(yàn)[6-7]。2006年美國(guó)FDA批準(zhǔn)比沙利度胺活性強(qiáng)的衍生物-來(lái)那度胺用于多發(fā)性骨髓瘤的治療；無(wú)論單用來(lái)那度胺，還是與其他藥物聯(lián)合，對(duì)復(fù)發(fā)或難治性多發(fā)性骨髓瘤均具有較好的臨床反應(yīng)性，且無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間延長(zhǎng)，不良反應(yīng)主要是粒細(xì)胞減少、血小板減少及靜脈血栓形成等[8-9]。2013年2月被FDA批準(zhǔn)的治療多發(fā)性骨髓瘤的新藥泊馬度胺，適用于在來(lái)那度胺或硼替佐米治療過(guò)程中或者末次治療結(jié)束的60 d內(nèi)病情進(jìn)展的多發(fā)性骨髓瘤患者。Ⅰ～Ⅲ期臨床，臨床反應(yīng)率及生存時(shí)間令人欣慰[10-12]，尤其是Ⅱ、Ⅲ期泊馬度胺聯(lián)合地塞米松的多中心臨床研究結(jié)果顯示：泊馬度胺聯(lián)合低劑量地塞米松治療組無(wú)論與泊馬度胺單藥治療相比，還是與高劑量地塞米松單藥治療相比，中位無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間均延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。泊馬度胺聯(lián)合低劑量地塞米松的治療方案可作為復(fù)發(fā)或難治性多發(fā)性骨髓瘤患者的新選擇。

3CRBN在多發(fā)性骨髓瘤中的臨床意義

3.1CRBN及相關(guān)蛋白對(duì)于免疫調(diào)節(jié)藥物活性的必要性免疫調(diào)節(jié)藥物改善了多發(fā)性骨髓瘤患者的預(yù)后，但是其作用機(jī)制一直尚未闡明。近年來(lái)，CRBN的發(fā)現(xiàn)，為理解該類藥物的作用機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)，多項(xiàng)研究證明，CRBN為該類藥物發(fā)揮作用的重要條件，似乎可以稱其為免疫調(diào)節(jié)藥物結(jié)合分子，可能與其抗骨髓瘤活性以及藥物耐藥相關(guān)。

Zhu等[13]首次將多發(fā)性骨髓瘤與CRBN的表達(dá)聯(lián)系起來(lái)，通過(guò)利用預(yù)先設(shè)計(jì)的CRBN shRNA慢病毒表達(dá)載體感染人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)感染后的細(xì)胞CRBN表達(dá)明顯降低，細(xì)胞活性降低65%～78%；檢測(cè)0～30%的感染后存活細(xì)胞在抗骨髓瘤藥物存在條件下的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)CRBN缺失可以誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)抗骨髓瘤藥物的耐藥，但是并沒有對(duì)不相關(guān)的藥物如硼替佐米、地塞米松以及美法侖發(fā)生耐藥。進(jìn)一步通過(guò)shRNA進(jìn)行CRBN基因敲除，可誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系IRF4基因及蛋白表達(dá)水平的下調(diào)，提示CRBN的下游分子靶標(biāo)可能包括了干擾素調(diào)節(jié)因子4(Interferon regulatory factor 4，IRF4)。IRF4在成熟的漿細(xì)胞上大量表達(dá)，并且在B細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與骨髓瘤患者的生存率相關(guān)[14]。

上述有關(guān)CRBN對(duì)于免疫調(diào)節(jié)藥物抗骨髓瘤活性的重要性及其表達(dá)水平與藥物耐藥的相關(guān)性在Lopez-Girona等[15]的研究中同樣得到了證實(shí)：shRNA可以誘導(dǎo)U266細(xì)胞系CRBN表達(dá)水平的降低，這些低水平表達(dá)CRBN的細(xì)胞對(duì)來(lái)那度胺的敏感性低；來(lái)那度胺耐藥的細(xì)胞系H929細(xì)胞系同樣存在CRBN水平的降低，泊馬度胺及來(lái)那度胺均耐藥的細(xì)胞系DF15R中，CRBN水平無(wú)法檢測(cè)。上述幾項(xiàng)研究證明，CRBN可能為直接與來(lái)那度胺及泊馬度胺治療意義相關(guān)的分子靶標(biāo)，且研究者對(duì)下游分子通路進(jìn)行了初步探討，CRBN可能通過(guò)形成CRBN-DDB1-CUL4復(fù)合物而介導(dǎo)其抗骨髓瘤活性。

3.2CRBN與多發(fā)性骨髓瘤患者臨床反應(yīng)率及生存時(shí)間的相關(guān)性Heintel等[16]通過(guò)對(duì)使用來(lái)那度胺及地塞米松治療的49份新診斷多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓樣本通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)行CRBN表達(dá)的檢測(cè)：正常骨髓組織的CRBN表達(dá)設(shè)置為1；發(fā)生完全反應(yīng)CR的患者中位CRBN表達(dá)值確定為3.45；非常好的部分反應(yīng)VGPR、部分反應(yīng)PR、疾病穩(wěn)定SD以及疾病進(jìn)展PD的中位CRBN表達(dá)分別為3.75、2.01、0.78、0.70，即未發(fā)生反應(yīng)患者的CRBN表達(dá)水平低于正常骨髓組織。此外，反應(yīng)患者與非反應(yīng)患者相比，CRBN表達(dá)水平與來(lái)那度胺治療的反應(yīng)性顯著相關(guān)(r=0.48，P<0.001)；在明確的預(yù)后參數(shù)中，只有β2微球蛋白與CRBN表達(dá)顯著相關(guān)(r=0.66，P<0.001)；CRBN表達(dá)與IRF4(r=0.57，P<0.001)、CTNNB1(r=0.7，P<0.001)存在比較緊密的聯(lián)系；Cox回歸分析并沒有發(fā)現(xiàn)與無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間及總生存時(shí)間的相關(guān)性。

總之，該研究證明CRBN表達(dá)與來(lái)那度胺治療的多發(fā)性骨髓瘤患者的臨床反應(yīng)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性。

Broyl等[17]研究者對(duì)參加HOVON-65/GMMG-HD4臨床試驗(yàn)的新診斷多發(fā)性骨髓瘤患者進(jìn)行CRBN基因檢測(cè)分析，并對(duì)其與患者的臨床反應(yīng)率及生存時(shí)間進(jìn)行相關(guān)性研究：?jiǎn)巫兞緾ox回歸分析表明，CRBN基因表達(dá)與無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(P=0.005)及總生存時(shí)間(P=0.04)顯著相關(guān)；使用Kaplan-Meier進(jìn)一步分析表明，CRBN表達(dá)在中位數(shù)以上與中位數(shù)以下相比較，存在較長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(P=0.009)；多變量Cox回歸分析表明，較高的CRBN表達(dá)水平與較長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間顯著相關(guān)，與總生存時(shí)間無(wú)此相關(guān)性；但該研究并沒有發(fā)現(xiàn)CRBN表達(dá)水平與臨床反應(yīng)率改善之間的相關(guān)性。

另外的一項(xiàng)研究不僅肯定了CRBN表達(dá)水平與臨床反應(yīng)率之間的相關(guān)性，同時(shí)證明其可能與患者的生存時(shí)間相關(guān)：77例接受免疫調(diào)節(jié)藥物聯(lián)合地塞米松治療的患者中有14例患者存在CRBN中位表達(dá)<0.8,而這些患者中沒有一例對(duì)治療發(fā)生反應(yīng)；CRBN表達(dá)0.8～0.9患者的反應(yīng)率為40%；CRBN表達(dá)>0.9患者的反應(yīng)率為49%；中位CRBN表達(dá)≥0.889與<0.889患者之間的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(3.0個(gè)月vs.8.9個(gè)月,P=0.000 6)及總生存時(shí)間(9.1個(gè)月vs.27.2個(gè)月,P=0.01)之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在多藥聯(lián)合化療組尚未發(fā)現(xiàn)此相關(guān)性[18]。

3.3CRBN在多發(fā)性骨髓瘤中相關(guān)分子機(jī)制的研究泛素化修飾在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，其中E3泛素連接酶Cullin4A( CUL4A)能夠通過(guò)與DDB1相結(jié)合而泛素化多種底物，介導(dǎo)其降解，這種酶通過(guò)調(diào)節(jié)DNA的修復(fù)、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。多數(shù)有關(guān)CRBN與多發(fā)性骨髓瘤的相關(guān)性研究證明了CRBN通過(guò)結(jié)合DDB1-CUL4-ROC1，形成泛素連接酶多蛋白復(fù)合物而介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)藥物發(fā)揮抗骨髓瘤活性，并且對(duì)該復(fù)合物的可能下游分子靶標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

Kr?nke等[19]使用SILAC為基礎(chǔ)的定量質(zhì)譜研究分析多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系MM1S經(jīng)來(lái)那度胺處理后細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的變化情況，發(fā)現(xiàn)來(lái)那度胺結(jié)合DDB1、CRBN，與CUL4、ROC1共同形成E3泛素連接酶，增加了B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Ikaros家族鋅指蛋白1和3(Ikaros family zinc finger proteins 1、3，IKZF1、IKZF3)與CRBN-DDB1泛素連接酶的結(jié)合，誘導(dǎo)其降解，且為劑量依賴性，并且通過(guò)突變的CRBN證明了CRBN對(duì)于IKZF1和IKZF3調(diào)節(jié)的重要性；同時(shí)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)58個(gè)氨基酸序列的敏感區(qū)，且該結(jié)構(gòu)存在于鋅指結(jié)構(gòu)域2，該結(jié)構(gòu)域中氨基酸的變化可以引起對(duì)來(lái)那度胺不同的敏感性。

來(lái)那度胺與CRBN結(jié)合，從而獲得了降解IKZF1和IKZF3的能力，Lu等[20]的研究也證實(shí)了該結(jié)論。Zhu等[21]通過(guò)使用慢病毒表達(dá)載體感染人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，共發(fā)現(xiàn)了244種CRBN的結(jié)合蛋白，并且通過(guò)在來(lái)那度胺治療后含量的變化情況，確定了其與多發(fā)性骨髓瘤的生物學(xué)相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在來(lái)那度胺治療后，46種CRBN結(jié)合蛋白含量降低，IKZF1在3/5種的免疫調(diào)節(jié)藥物耐藥的細(xì)胞系明顯降低；在44例使用泊馬度胺及地塞米松治療的耐藥多發(fā)性骨髓瘤患者存在較低的IKZF1基因表達(dá)水平，預(yù)示著對(duì)治療缺乏反應(yīng)；除此之外，還發(fā)現(xiàn)IKZF1與KPNA2水平同樣與總生存率方面的區(qū)別相關(guān)。

4小結(jié)

通過(guò)對(duì)上述有關(guān)CRBN與免疫調(diào)節(jié)藥物抗骨髓瘤相關(guān)性的研究進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)藥物顯著改善了多發(fā)性骨髓瘤患者的反應(yīng)率及生存率，改變多發(fā)性骨髓瘤治療的革命化時(shí)代正在到來(lái)。還希望更多有關(guān)CRBN高純度抗體及其晶體結(jié)構(gòu)的研究，以促進(jìn)藥物耐藥機(jī)制的進(jìn)一步發(fā)展，以及更有效的、低毒性的藥物出現(xiàn)，尤其是非致畸性的免疫調(diào)節(jié)藥物。除此之外，需要大樣本、多中心的CRBN與多發(fā)性骨髓瘤患者臨床反應(yīng)率及生存時(shí)間的相關(guān)性研究以驗(yàn)證其檢測(cè)價(jià)值。

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Advances and clinical importance of cereblon in multiple myeloma

ZHAO Yong-feng,WANG Xian*

(Department of Hematology,the First People′s Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,China)

[Abstract]The immunomodulatory drugs,including thalidomide,lenalidomide and pomalidomide,play an important part in treatment response and prognosis of patients with multiple myeloma.Cereblon (CRBN) was first found to be associated with autosomal recessive non-syndromic mental retardation.There were studies which discovered that it not only was the teratogenic target of the immunomodulatory drugs,but also was associated with clinical response rate of these drugs in multiple myeloma and the patients′ survival time.It is presumed that CRBN probably mediates anti-myeloma activity by binding to DDB1-CUL4-ROC1 and forming an E3 ubiquitin ligase complex.Many studies about the molecular mechanism and clinical associativity of CRBN are needed to pave the way to an developed understanding of drug resistance of immunomodulatory drugs and the appearance of more effective,hypotoxic drugs,thereby advancing the quality of life for patients with multiple myeloma.

Key words：Multiple myeloma;Immunomodulatory drugs;Cereblon

收稿日期：2015-08-13

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201604036