張　靜 綜述，崔亞利，江詠梅 審校

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,成都 610041)

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·綜述·

佐劑在肺炎鏈球菌疫苗免疫中的作用*

張靜 綜述，崔亞利，江詠梅△審校

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,成都 610041)

霍亂毒素；肺炎鏈球菌疫苗；佐劑

肺炎鏈球菌是引起各年齡組高發(fā)病率和病死率的主要病原菌，其疫苗的研制和使用對肺炎鏈球菌感染的防治具有重要意義。但目前臨床能投入使用的疫苗卻較少，主要有23價多糖疫苗和7、10、13價多糖蛋白結(jié)合疫苗，原因之一是缺乏能用于人體的高效的免疫佐劑。肺炎鏈球菌疫苗常用的佐劑主要有：霍亂毒素(cholera entero toxin,CT)、大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin LT)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、DNA疫苗佐劑、鋁劑等。本文對肺炎鏈球菌疫苗中常用的幾種佐劑的免疫效應(yīng)進(jìn)行了綜述，為肺炎鏈球菌疫苗及免疫佐劑的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研制提供參考資料。

1　常用肺炎鏈球菌疫苗佐劑及作用機(jī)制

1.1CTCT是霍亂弧菌分泌的一種不耐熱腸毒素，由1個A 亞單位和5個B 亞單位構(gòu)成[1]。A亞單位為毒性單位，可引起機(jī)體腹瀉，包含A1和A2兩種肽鏈，A1 肽鏈具有腺苷二磷酸(ADP)核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，能催化腸道上皮細(xì)胞表面環(huán)磷酸腺苷復(fù)合物中三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合蛋白腺苷二磷酸核糖化反應(yīng)。A2肽鏈則通過與B 亞單位結(jié)合參與受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用中的轉(zhuǎn)位作用。B 亞單位能特異性地同時與真核生物腸上皮細(xì)胞的5個神經(jīng)節(jié)苷脂神經(jīng)節(jié)苷脂1(GM1)結(jié)合[2]，它們之間的這種交互作用可增強(qiáng)機(jī)體對疾病的感應(yīng)。已有學(xué)者提出CTB可有效增強(qiáng)自身免疫病及過敏性疾病的治療效果[3]。CTB與抗原共同經(jīng)鼻或口服免疫，不僅誘導(dǎo)局部黏膜發(fā)生免疫反應(yīng)，同時遠(yuǎn)隔部位其他黏膜也可產(chǎn)生。其免疫反應(yīng)的機(jī)制可能如下：(1)誘導(dǎo)腸黏膜離子通道和載體的表達(dá)，增加分泌黏蛋白的表達(dá)[4]，也可通過改變抗原的物理性狀和增加腸黏膜通透性來增加抗原的攝入量。(2)增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞)呈遞抗原的能力[5]。(3)增強(qiáng)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10，而非IL-2、IL-12、干擾素γ(IFN-γ)的產(chǎn)生及誘導(dǎo)以Th17為主的免疫反應(yīng)[6]，也可通過激活腸黏膜淋巴細(xì)胞核因子κB(NF-κB)通路增強(qiáng)免疫效應(yīng)[7]。(4)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗炎反應(yīng)，促進(jìn)Th2型反應(yīng)，抑制Th1型反應(yīng)，增強(qiáng)IgA的產(chǎn)生。(5)調(diào)節(jié)黏膜相關(guān)淋巴組織T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Treg)生長環(huán)境。

CT作為免疫佐劑主要有兩種使用方式：一種是與抗原形成嵌合或融合蛋白進(jìn)行免疫，另一種是與抗原簡單的混合共同免疫，這兩種方法對免疫效應(yīng)的影響是不同的。目前肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白，如肺炎鏈球菌表面蛋白A(PsaA)與CTB融合，形成融合蛋白，融合的PsaA-CTB免疫原性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)的PsaA或CTB，經(jīng)鼻或經(jīng)口免疫可誘導(dǎo)系統(tǒng)的及局部的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量IgG和IgA，其中由Th2型免疫反應(yīng)介導(dǎo)的抗體亞型IgG1、IgG2a滴度最高。雖然CT已廣泛用于動物實(shí)驗(yàn)，但因其具有強(qiáng)毒性，在人體的使用仍受到限制，目前，已有研究通過對CTA區(qū)域進(jìn)行肽鏈融合及對CT的活性中心進(jìn)行定點(diǎn)誘變來減弱CT的毒性[3]。

1.2LTLT由產(chǎn)毒性大腸桿菌產(chǎn)生，其三維結(jié)構(gòu)與CT極為相似，由1個A亞單位和5個B亞單位組成，A亞單位具有ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，B亞單位則可與細(xì)胞結(jié)合[8]。根據(jù)基因、生化、免疫學(xué)方面的差異，可將LT分為LTⅠ和LTⅡ，通常所說的LT 一般是指Ⅰ型大腸桿菌不耐熱腸毒素，而LT Ⅱ與人類疾病無關(guān)，在自然界很少見。LT通過腸道黏液的分泌來激活A(yù)亞單位，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。LTA 是LTⅠ的毒性亞基，可引起機(jī)體發(fā)生水性腹瀉。目前，有些研究者通過突變LT中的某些氨基酸位點(diǎn)，去除毒性而保留其作為佐劑的免疫原性。LTB 無毒性且具有良好的黏膜佐劑活性，可作為黏膜免疫的佐劑。LTB通過與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合而發(fā)揮作用。目前，LT作為佐劑已可通過黏膜(滴鼻、舌下、口服、直腸)、局部外用(經(jīng)皮)、腸外(皮下、皮內(nèi))等免疫途徑與免疫原共同用于機(jī)體免疫。LT可能通過調(diào)節(jié)一些細(xì)胞因子的水平，如 IFN-γ、IL-4、IL-10等來增強(qiáng)免疫效應(yīng)。

1.3乳酸乳球菌乳酸乳球菌是一種革蘭陽性菌，在發(fā)酵及食品保存中廣泛應(yīng)用，被美國食品與藥品管理局(food and drug administration,FDA)認(rèn)證為安全級微生物(generally regarded as safe,GRAS)。乳酸乳球菌基本不在胃腸道內(nèi)定植，不會危害腸道內(nèi)正常益生菌群和造成基因污染，并可避免長期定植帶來的耐受[9]。活的或滅活的乳酸乳球菌都是較好的疫苗載體[10]，能誘導(dǎo)特定人群如嬰幼兒、老年人、免疫抑制人群產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。乳酸乳球菌本身分泌蛋白較少，可減少載體微生物自身蛋白對外源分泌蛋白的干擾，不產(chǎn)生任何胞外蛋白酶，不會引起抗原蛋白降解，表達(dá)的重組蛋白不需純化[11]。乳酸乳球菌可激活Toll樣受體，能刺激、活化免疫細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)抗原特異性免疫反應(yīng)[12]。重組乳酸乳球菌已成功用于表達(dá)多種異種抗原，可作為多種病原菌及病毒的佐劑[13]。目前，對乳酸乳球菌在各種疫苗中的應(yīng)用研究已取得了一定成果，但僅限于臨床前期研究階段，對乳酸乳球菌特性、增強(qiáng)抗原免疫原性、產(chǎn)生免疫應(yīng)答的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白，如PspA[14]、肺炎鏈球菌保護(hù)蛋白(PppA)與活的或滅活的乳酸菌經(jīng)黏膜或經(jīng)口免疫小鼠[13]，都可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生系統(tǒng)的、局部的免疫反應(yīng)，其免疫效應(yīng)高于用鋁劑作為佐劑的效應(yīng)。但由于重組乳酸菌表達(dá)的抗原不同，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體類型也有所不同。

1.4DNA疫苗佐劑鳥嘌呤核苷酸(CpG) DNA序列由胞嘧啶核苷酸和CpG為基序組成，在DNA疫苗載體骨架中導(dǎo)入該基序，能夠快速活化T、B細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子及多價IgM，增強(qiáng)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類分子、CD40、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)的表達(dá)，并能促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞的增殖與成熟。用肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白PspA與Flt3配體(pFL)和CpG寡脫氧核苷酸(ODN)聯(lián)合免疫2歲齡的小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生與幼鼠相似的免疫反應(yīng)，主要是Th1、Th2型反應(yīng)，并可誘導(dǎo)小鼠上呼吸道的成熟DCs[15]。并且在鼻黏膜相關(guān)淋巴組織(NALT)、頸部淋巴結(jié)(CLNs)表面可檢測到表達(dá)MHC Ⅱ、CD40、CD80、CD86等黏附分子的CD11b+、CD8+、 B220+DCs。pFL誘導(dǎo)的CD8+DC對Th2型細(xì)胞因子介導(dǎo)的抗原特異性免疫反應(yīng)具有重要作用。CpG ODN通過激活類漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞表面的Toll樣受體9(TLR9)，進(jìn)一步介導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的激活[16]，TLR9介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在免疫應(yīng)答過程中具有重要作用，CpG DNA疫苗佐劑可有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性免疫反應(yīng)，是一種高效的黏膜免疫佐劑[17]。

1.5鋁鹽佐劑鋁鹽佐劑從19世紀(jì)30年代開始已廣泛用于疫苗中，且是美國惟一批準(zhǔn)的可用于臨床的疫苗佐劑。鋁鹽佐劑能輔助疫苗快速地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞因子如IL-1β的分泌。但是一些研究者認(rèn)為炎癥因子并不參與鋁鹽佐劑誘導(dǎo)的機(jī)體免疫反應(yīng)[18]。鋁劑與抗原共同免疫能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)的、高濃度的IgG抗體[19]。由于鋁劑對機(jī)體的生物反應(yīng)性，它也可作為有效的過敏性免疫治療的佐劑。盡管鋁劑已用于臨床多年，但其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的機(jī)制仍然不清楚。

2　其他肺炎鏈球菌疫苗佐劑

肺炎鏈球菌疫苗候選蛋白除與上述幾種常用佐劑可共同作用發(fā)揮免疫保護(hù)作用外，還可與如細(xì)菌鞭毛蛋白(vibrio vulnificus flagellin,FlaB)、納米凝膠(nanogel，consisting of a cationic cholesteryl group-bearing pullulan,cCHP)、IL-12等共同免疫而增強(qiáng)機(jī)體的免疫效應(yīng)。

2.1FlaBFlaB在細(xì)菌體內(nèi)高度表達(dá)且生物學(xué)功能穩(wěn)定，作為疫苗及免疫治療的佐劑對黏膜具有很強(qiáng)的免疫刺激作用。FlaB是TLR5 的配體，是種類有限的受體激動劑之一，可直接結(jié)合表達(dá)TLR5的免疫細(xì)胞，激活NF-κB途徑，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌。將FlaB與PspA融合組成重組蛋白：FlaB-PspA 和 PspA-FlaB，分別免疫小鼠，結(jié)果顯示FlaB-PspA組小鼠存活率較高，并有大量的IL-4產(chǎn)生，但兩組小鼠的IFN-γ水平無差別，并且IgG1滴度高，IgG2a滴度低，這都表明FlaB刺激機(jī)體主要產(chǎn)生Th2型反應(yīng)[20]。

2.2cCHPcCHP是一種納米凝膠制劑，用重組的cCHP-PspA免疫小鼠可抵抗肺炎鏈球菌致死性感染，減少肺炎鏈球菌在宿主上下呼吸道黏膜的定植及侵襲，增強(qiáng)細(xì)菌在支氣管黏膜及肺部的清除，誘導(dǎo)機(jī)體系統(tǒng)的及局部的黏膜免疫反應(yīng)[21]。研究表明cCHP-PspA經(jīng)鼻黏膜免疫，是一種有效、安全的免疫方式，不會引起嗅球及中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損[22]。主要誘導(dǎo)黏膜產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th2 和Th17型免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量的IL-4 和 IL-13等細(xì)胞因子。

2.3IL-12IL-12是一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)CD4+T、CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，刺激Th1和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等細(xì)胞因子，也可增強(qiáng)固有免疫反應(yīng)，促進(jìn)感染部位中性粒細(xì)胞的聚集[23]。肺炎鏈球菌的清除主要通過調(diào)理吞噬作用，用IL-12作佐劑經(jīng)鼻黏膜免疫小鼠可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)的、局部的免疫反應(yīng)，其中IgM、IgG2a的滴度較高，而IgG1的滴度與不加佐劑組相比無差異，IgG3在無佐劑組則不能檢測到。IL-12作佐劑可減少肺炎鏈球菌在鼻咽部的定植，曾有文獻(xiàn)報道，IL-12作為PPS疫苗佐劑經(jīng)皮下免疫具有顯著的毒性作用，但是也有其他研究表明IL-12經(jīng)鼻黏膜免疫與經(jīng)注射途徑給藥相比所產(chǎn)生的毒性作用較小。

3　展　　望

同種類的疫苗選擇不同的免疫佐劑對免疫效應(yīng)的影響不同。開發(fā)研制新型的免疫佐劑以增強(qiáng)疫苗的免疫效力并減少疫苗的毒副作用將是未來的發(fā)展趨勢。相信隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，對相關(guān)載體和佐劑的研究將極大地推動其在免疫中的應(yīng)用。

[1]Sanchez J,Holmgren J.Cholera toxin - A foe & a friend[J].Indian J Med Res,2011,133(2):153-163.

[2]Chinnapen DJ,Hsieh WT,Te Welscher YM,et al.Lipid sorting by ceramide structure from plasma membrane to ER for the cholera toxin receptor ganglioside GM1[J].Dev Cell,2012,23(3):573-586.

[3]Sun JB,Czerkinsky C,Holmgren J.Mucosally induced immunological tolerance,regulatory T cells and the adjuvant effect by cholera toxin B subunit[J].Scand J Immunol,2010,71(1):1-11.

[4]Kirkeby S.Cholera toxin B subunit-binding and ganglioside GM1 immuno-expression are not necessarily correlated in human salivary glands[J].Acta Odontol Scand,2014,72(8):694-700.

[5]Gustafsson T,Hua YJ,Dahlgren MW,et al.Direct interaction between cholera toxin and dendritic cells is required for oral adjuvant activity[J].Eur J Immunol,2013,43(7):1779-1788.

[6]Basset C,Thiam F,Di Martino C,et al.Cholera-Like enterotoxins and regulatory T cells[J].Toxins (Basel),2010,2(7):1774-1795.

[7]Im SY,Kim KJ,Kim HA,et al.Cholera toxin breakdowns oral tolerance via activation of canonical NF-kappa B[J].J Immunl,2013,190(1):92-99.

[8]Sánchez J,Holmgren J.Cholera toxin structure,gene regulation and pathophysiological and immunological aspects[J].Cell Mol Life Sci,2008,65(9):1347-1360.

[9]Berlec A,Ravnikar M,Strukelj B.Lactic acid bacteria as oral delivery systems for biomolecules[J].Pharmazie,2012,67(11):891-898.

[10]Vinti?i EO,Medina MS.Immune response in nasopharynx,lung,and blood elicited by experimental nasal pneumococcal vaccines containing live or heat-killed lactobacilli as mucosal adjuvants[J].Can J Physiol Pharmacol,2014,92(2):124-131.

[11]Zhang QX,Zhong J,Huan LD.Expression of hepatitis B virus surface antigen determinants in Lactococcus lactis for oral vaccination[J].Microbiol Res,2011,166(2):111-120.

[12]Lei H,Xu Y,Chen J,et al.Immunoprotection against influenza H5N1 virus by oral administration of enteric-coated recombinant Lactococcus lactis mini-capsules[J].Virology,2010,407(2):319-324.

[13]Vinti?i EO,Medina MS.Host immunity in the protective response to nasal immunization with a pneumococcal antigen associated to live and heat-killed Lactobacillus casei[J].BMC Immunol,2011,12:46.

[14]Campos IB,Darrieux M,Ferreira DM,et al.Nasal immunization of mice with Lactobacillus casei expressing the Pneumococcal Surface Protein A:induction of antibodies,complement deposition and partial protection against Streptococcus pneumoniae challenge[J].Microb Infect,2008,10(5):481-488.

[15]Hanniffy SB,Carter AT,Hitchin E,et al.Mucosal delivery of a pneumococcal vaccine using Lactococcus lactis affords protection against respiratory infection[J].J Infect Dis,2007,195(2):185-193.

[16]Fukuyama Y,King JD,Kataoka K,et al.A combination of Flt3 ligand cDNA andAged MiceImmunity to streptococcus pneumoniae in adjuvant elicits protective Secretory-IgACpG oligodeoxynucleotide asNasal[J].Immunol,2011,186(4):2454-2461.

[17]Iho S,Maeyama J,Suzuki F.CpG oligodeoxynucleotides as mucosal adjuvants[J].Hum Vaccin Immunother,2015,11(3):755-760.

[18]Li H,Willingham SB,Ting JP.Cutting edge:In ammasome activation by alum and alum′s adjuvant effect are mediated by NLRP3[J].J Immunol，2008,181(1):17-21.

[19]Barbaud A,Deschildre A,Waton J,et al.Hypersensitivity and vaccines:an update[J].Eur J Dermatol,2013,23(2):135-141.

[20]Nguyen CT,Kim SY,Kim MS,et al.Intranasal immunization with recombinant PspA fused with a flagellin enhances cross-protective immunity against Streptococcus pneumoniae infection in mice[J].Vaccine,2011,29(34):5731-5739.

[21]Kong IG,Sato A,Yuki Y,et al.Nanogel-Based PspA intranasal vaccine prevents invasive disease and nasal colonization by streptococcus pneumoniae[J].Infect Immun,2013,81(5):1625-1634.

[22]Nochi T,Yuki Y,Takahashi H,et al.Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines[J].Nat Mater,2010,9(7):572-578.

[23]Sun KE,Salmon SL,Lotz SA,et al.Interleukin-12 promotes gamma interferon-dependent neutrophil recruitment in the lung and improves protection against respiratory Streptococcus pneumoniae infection[J].Infect Immun,2007,75(3):1196-1202.

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.25.037

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(81301399)。

張靜(1989-)，在讀碩士，主要從事肺炎鏈球菌致病機(jī)制及蛋白疫苗研發(fā)的分子生物學(xué)研究。

,E-mail:jiangyongmei-1@163.com。

R446

A

1671-8348(2016)25-3565-03

2016-03-18

2016-05-15)