張曉衛(wèi)（洛陽(yáng)市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，河南洛陽(yáng)471003）

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茶葉化學(xué)成分樣品制備的優(yōu)化方法

張曉衛(wèi)
（洛陽(yáng)市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，河南洛陽(yáng)471003）

摘要：以指紋識(shí)別要求為基礎(chǔ)，結(jié)合1H NMR以及主成分分析（PCA）兩種方法分別作為測(cè)試以及評(píng)估手段，深入研究了對(duì)茶葉中化學(xué)成分樣品制備優(yōu)化方法。以生物指紋為手段，對(duì)化學(xué)組分和樣品體系多而復(fù)雜的特點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別，以主成分分析為手段綜合分析了樣品質(zhì)控多方面的因素，最后對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行確立。在樣品制備程序基礎(chǔ)上，采取4種代表性茶葉分別展開預(yù)處理以及測(cè)試。實(shí)踐結(jié)果表明，本文所述方法不僅穩(wěn)定，而且可靠性較好，與1H NMR要求相吻合。本文中所提優(yōu)化方法操作簡(jiǎn)單，即使樣品體系復(fù)雜也同樣適用。

關(guān)鍵詞：茶葉；化學(xué)成分；樣品制備；優(yōu)化方法

在生物學(xué)研究領(lǐng)域，指紋技術(shù)發(fā)揮著不可替代的作用，隨著該技術(shù)的不斷完善，也逐漸得到了大家普遍關(guān)注。代謝組學(xué)在近年來的興起為該技術(shù)繼續(xù)發(fā)展提供了重要支撐。Fiehn等人在進(jìn)行植物樣品標(biāo)準(zhǔn)化處理上，將其代謝物做到了“全提取”生成1H NMR譜，將主成分分析法等方法結(jié)合進(jìn)來，以此來分析所得1H NMR譜。本文以“代謝物指紋識(shí)別”作為研究思路進(jìn)行篩選。1H NMR具有快速、獲取內(nèi)容豐富等特點(diǎn)，PCA能夠?qū)Υ罅啃畔⒄归_整體性分析。因此在本文研究中，引入此方法既簡(jiǎn)化了操作步驟，又保證了最大程序獲取和利用內(nèi)涵信息。

1　實(shí)驗(yàn)步驟

1.1儀器以及試劑的選擇

核磁譜儀；數(shù)控超聲波清洗器；天平；數(shù)據(jù)處理軟件；氘代甲醇；重水；3-三甲基甲硅烷基-2，2，3，3-四氘代丙酸鈉；磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉重水緩沖溶液，pH值控制在7.4，取部分加入TSP-d4作內(nèi)標(biāo)基準(zhǔn)試劑用。

1.2具體過程

根據(jù)參考資料以及多年工作經(jīng)驗(yàn)，本次實(shí)驗(yàn)采用的預(yù)處理方法是超聲提取。采用四個(gè)樣品分別是曬青毛茶（編號(hào)為T1）、寧洱困蘆山古茶（編號(hào)為T2）、普洱茶（編號(hào)為T3）以及人參烏龍茶（編號(hào)為T4）。分別取出4種茶葉，研磨成粉末并過篩處理；取定量粉末浸泡于配置好的溶劑中，經(jīng)過一段時(shí)間的控溫超聲之后，將其冷卻離心處理，在核磁管中加入400μL上清液，取10μL基準(zhǔn)試劑加入其中待測(cè)。這樣做能夠使體系pH值保持恒定，并且能夠提供內(nèi)標(biāo)參考峰。

1.3獲取1H NMR譜

選取脈沖序列，其中譜寬設(shè)置為6000 Hz，弛豫延遲設(shè)置為2s，混合時(shí)間設(shè)置為150ms，采樣點(diǎn)數(shù)32K，掃描次數(shù)為256次，得出1H NMR后，利用Fouier進(jìn)行變換、相位以及基線校正，將甲基質(zhì)子信號(hào)峰值位移定位成零，化學(xué)位移定標(biāo)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟都在恒溫狀態(tài)下完成。

1.4PCA

該方法是一種數(shù)據(jù)線映射方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多元變量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理。它能夠最大限度將原有信息保留下來，把樣本從高維空間狀態(tài)下映射到低維空間狀態(tài)下。PCA思路：利用少量變量解釋原始數(shù)據(jù)中包含的大量信息，對(duì)相關(guān)性較高的變量進(jìn)行處理，轉(zhuǎn)化成不相關(guān)或者獨(dú)立新變量，我們所說的主成分指的就是這些新變量。PCA的本質(zhì)就是數(shù)據(jù)降維。在實(shí)驗(yàn)中引用PCA，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)1H NMR的數(shù)據(jù)分析，為設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件提供科學(xué)依據(jù)。為了保證PCA與數(shù)據(jù)要求相符合，我們首先要處理1H NMR譜。具體操作方法如下：首先對(duì)甲基質(zhì)子峰積分面積進(jìn)行設(shè)定，為1；然后利用專業(yè)的數(shù)據(jù)處理軟件，單位設(shè)置為20Hz，把1H NMR譜圖劃分為多個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)均等，將各個(gè)小區(qū)相對(duì)積分面積值進(jìn)行獲取，對(duì)殘留水峰區(qū)和殘留質(zhì)子峰區(qū)數(shù)據(jù)進(jìn)行刪除處理；再次對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換為ASC II文件，將其輸出，通過EXCEL做歸一化處理，并對(duì)數(shù)據(jù)格式進(jìn)行轉(zhuǎn)置。該步驟完成之后，輸至PCA專業(yè)軟件中進(jìn)行分析，最終結(jié)果以“載荷圖”和“得分圖”體現(xiàn)出來。

2　結(jié)果分析

2.11H NMR譜圖

為了便于進(jìn)行PCA分析，需要進(jìn)行指認(rèn)歸屬的位移區(qū)段，對(duì)不同條件下樣品的物質(zhì)含量進(jìn)行了考察，這樣做的目的在于能夠?qū)⒆罴阎苽錀l件提取出來。首先有針對(duì)性地對(duì)T1提取物1H NMR譜指認(rèn)，憑借核磁共振對(duì)部分信號(hào)進(jìn)行了確證。

圖1　1H NMR譜圖

根據(jù)圖1特征，將其劃分為4個(gè)區(qū)段。通過對(duì)圖1進(jìn)行觀察，我們能夠觀察到下列信息：I區(qū)只包含甲基質(zhì)子信號(hào)，這樣在進(jìn)行后續(xù)處理時(shí)，就有了保證。Ⅱ區(qū)信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)適中，分布也比較均勻，信號(hào)之間出現(xiàn)分離，以便于指認(rèn)。出現(xiàn)的信號(hào)主要是飽和烷基質(zhì)子。茶葉中包含的大量糖苷、咖啡因和糖等質(zhì)子信號(hào)都體現(xiàn)在Ⅲ區(qū)中，通過圖1我們可以看出，該區(qū)內(nèi)的信號(hào)總體來說較強(qiáng)，具有嚴(yán)重的譜線重疊，該區(qū)中有很多信號(hào)不能直接指認(rèn)。Ⅳ區(qū)信號(hào)非常分散，而且共振譜線之間的強(qiáng)度差異十分明顯。在接下來的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該區(qū)信號(hào)對(duì)茶葉品種極為敏感，容易識(shí)別的信號(hào)有氮雜環(huán)、芳香環(huán)、和烯烴等質(zhì)子。

2.2優(yōu)化提取條件

在設(shè)計(jì)預(yù)處理方法時(shí)，從四個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化，分別是調(diào)整了溶劑的配比、樣本量比例、提取溫度和時(shí)間。具體步驟是將上述四個(gè)條件結(jié)合起來，分別獲取四種茶葉的1H NMR譜圖，依次進(jìn)行預(yù)處理和PCA分析，得出分別對(duì)應(yīng)的主成分得分圖以及載荷圖，共四組。在這里，由于篇幅限制不將圖進(jìn)行一一列舉。通過得分圖能夠發(fā)現(xiàn)制備條件的變化對(duì)樣本點(diǎn)分布產(chǎn)生了哪些影響。其分布取決于PC1、PC2得分。而得分受到位移區(qū)段的影響。這樣一來，就能夠得知制備條件的不同會(huì)對(duì)哪些成為提取量產(chǎn)生影響。具體制備條件如下：

第一，溶劑配比。提取劑極性取決于溶劑配比，對(duì)提取到的物質(zhì)提取量多少也有著直接關(guān)系，以指紋譜形式反映出來。等量稱取經(jīng)研磨過篩處理的茶葉樣本共10份，分別加入1000 μL以氘代甲醇和提取劑，提取劑體積分?jǐn)?shù)從10％以每次增加10％為準(zhǔn)，直至100％為止。在超聲下進(jìn)行30min提取，樣本量比例為12。通過前文所述方法得出10個(gè)樣品，對(duì)10樣品依次編號(hào)。在第一、二主成分空間上將樣品1H NMR譜圖進(jìn)行投影。

第二，提取劑的用量。提取劑用量對(duì)提取效率有很大的影響。以70％ 的MeDo為提取劑用量，在40℃超聲條件下進(jìn)行30min提取，然后進(jìn)行篩選。對(duì)T1樣本進(jìn)行平行稱取，共6份，每份重量控制在100mg。誤差不超過0.1mg。依次加入提取劑，提取劑量從600μL以每次200μL遞增，最高提取劑量為1600μL，共產(chǎn)生6個(gè)樣品，依次進(jìn)行編號(hào)。

第三，提取溫度。溫度控制在整樣品的整個(gè)制備過程中非常重要。將經(jīng)過研磨過篩處理的T1樣本進(jìn)行平衡稱取，共6份，每份質(zhì)量控制在83.3mg，誤差不超過0.1mg。參照上一步驟加入提取劑，分別置于溫度20℃、3O℃、40℃、50℃、60℃和65℃下，進(jìn)行30min的超聲提取。共產(chǎn)生6個(gè)樣品，依次進(jìn)行編號(hào)。

第四，提取時(shí)間。經(jīng)過研磨過篩處理的T1樣本進(jìn)行平衡稱取，共5份，每份質(zhì)量控制在83.3mg，誤差不超過0.1mg。參照上一步驟加入提取劑，置于溫度為60℃的條件下進(jìn)行下超聲提取，提取時(shí)間從10min以每次10min遞增，最長(zhǎng)時(shí)間為50min，共產(chǎn)生5個(gè)樣品，依次進(jìn)行編號(hào)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出以下分析：在上述4個(gè)條件中，樣品最大的制備條件是提取劑的配比；然后是提取劑量。關(guān)于提取溫度和時(shí)間，應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行合理選擇。通過對(duì)上述4個(gè)制備條件的綜合分析，最終決定本次實(shí)驗(yàn)制備條件：提取劑是70％MeOD，提取劑用量是12，提取溫度和時(shí)間分別是60℃、20min。

2.3分析樣品

以前文所述4種茶葉作為樣本，憑借指紋測(cè)試考察了的預(yù)處理方案的可行性。經(jīng)過研磨過篩處理的4個(gè)樣本進(jìn)行平衡稱取，共3份，每份質(zhì)量控制在83.3mg，誤差不超過0.1mg。樣品數(shù)量為12，分別進(jìn)行標(biāo)記。每一個(gè)樣品都要進(jìn)行3次平行測(cè)量，一共得到了36張1H NMR譜圖，經(jīng)過轉(zhuǎn)化之后，一共獲取了36組樣本。對(duì)全部樣品進(jìn)行PCA分析，并得到了投影判別圖。發(fā)現(xiàn)4組樣本數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的離散非常明顯，而且每一類樣本都出現(xiàn)了聚類現(xiàn)象。

表1　4種茶葉樣品離散因子表

由于上述測(cè)試所得到的效果非常好，因此，對(duì)預(yù)處理效果考察借助離散因子就可以體現(xiàn)出來。通過表1我們可以直觀看出，除了T4樣本以外，離散因子均不超過10，該樣本雖然離散因子較大，但是也控制在了90左右。除此之外，根據(jù)表1能得出下列結(jié)論：（1）單一樣本的聚集度較高，預(yù)處理方法的穩(wěn)定性非常高，同時(shí)，具有良好的重現(xiàn)性；（2）兩個(gè)樣本的數(shù)據(jù)點(diǎn)之間呈現(xiàn)高度離散現(xiàn)象，即使T1和T2兩個(gè)樣本屬于一種性質(zhì)，與單一樣本相比，離散分子的倍數(shù)超過33倍。由此可見，原始數(shù)據(jù)中含有能對(duì)樣品差異進(jìn)行充分反映的特征信息。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出本次預(yù)處理方法非?？煽康慕Y(jié)論。在本次預(yù)處理方法下可能產(chǎn)生的偏差要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于樣品自身內(nèi)源差異。因此符合指紋技術(shù)要求。

3　結(jié)　語(yǔ)

本文以超聲提取作為提取方法，這一方法在實(shí)驗(yàn)室研究中十分普遍。該方法不僅簡(jiǎn)單、便于操作，而且具有極高的推廣價(jià)值，因此，對(duì)于普及指紋技術(shù)及其數(shù)據(jù)也是十分有利的。除此之外，在提取劑方面進(jìn)行替換，本文所采用的提取劑不僅操作起來更為簡(jiǎn)單，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中由于轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的樣品算是和污染做到了保證，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性也做到了有效保證。

參考文獻(xiàn)

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