丁 義，趙 剛,趙 爽

(佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科,黑龍江 佳木斯 154000)

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β磷酸三鈣/膠原支架材料骨組織工程研究和應(yīng)用進展

丁 義，趙 剛,趙 爽

(佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科,黑龍江 佳木斯 154000)

骨組織工程在骨缺損修復(fù)中對支架材料的性能有很高的要求，一方面，支架材料應(yīng)能防止缺損部位組織坍塌，為組織長入、新骨生成提供空間；另一方面，支架材料的骨誘導(dǎo)性直接影響其成骨效率，這對材料的臨床應(yīng)用有著極其重要的意義。β磷酸三鈣/膠原復(fù)合支架具備以上兩點的同時降解率較好，使新骨與支架緊密結(jié)合，進而阻止了結(jié)締組織過度增生防止其對骨愈合效率的影響。且可塑性強，術(shù)中操作方便。該文就目前β磷酸三鈣/膠原復(fù)合支架材料及其負載細胞、蛋白、基因的研究和應(yīng)用做了綜述，認為其作為骨組織工程的支架材料潛力巨大。

β磷酸三鈣;膠原;骨組織工程

骨缺損的修復(fù)途徑之一即采用骨組織工程技術(shù)，利用各種性能良好的支架材料高效誘導(dǎo)新骨的形成。β磷酸三鈣/膠原支架材料(β-TCP/Col)從仿生學(xué)的角度出發(fā),模擬了骨組織的有機和無機成分,尤為重要的是,兩種材料復(fù)合后,膠原材料因為與β磷酸三鈣良好的生物活性和骨傳導(dǎo)性結(jié)合而使復(fù)合物具備了骨誘導(dǎo)性,而且這種支架材料創(chuàng)造了一種適合人類細胞生長的三維環(huán)境[1]。Zou[2]利用掃描電鏡觀察到β磷酸三鈣與膠原纖維緊密結(jié)合，復(fù)合物細胞毒性經(jīng)MTT法檢測與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，在動物實驗中，12周時完成骨組織再生。隨著對支架材料研究手段的不斷完善，β磷酸三鈣/膠原復(fù)合材料各種形式的應(yīng)用屢屢見諸報道。我們從單純支架材料、與種子細胞復(fù)合培養(yǎng)、添加生長因子3個方面對目前該材料的研究進展做一綜述。

1 單純支架材料

劉星綱[3]將β-TCP/Col復(fù)合物植入5月齡新西蘭大白兔下頜骨下緣箱型缺損中，12周時實驗側(cè)骨質(zhì)完全愈合，與周圍骨質(zhì)界限不明顯，僅表面骨皮質(zhì)較周圍骨質(zhì)欠光滑。Zheng[4]研究了β-TCP/Col復(fù)合物作為兔股骨遠端孔狀缺損模型充填物的生物相容性，在兔股骨兩端制備直徑6 mm深10 mm的極限缺損，其中一孔充填實驗材料，另一個作空白對照，1、3、6個月后處死實驗動物做骨愈合程度分析，實驗組使用β-TCP復(fù)合物，新骨生成的質(zhì)與量顯著優(yōu)于空白組。Eiji[5]利用該材料充填直徑5 mm的大鼠顱骨缺損,術(shù)后6周，實驗組可見不成熟的骨結(jié)構(gòu)伴致密結(jié)締組織；12周時，支架材料完全由致密、連續(xù)、成熟的骨組織替代。

牙齒缺失后行種植修復(fù)是目前較為先進的一種修復(fù)方式，但牙齒缺失后局部解剖關(guān)系的改變導(dǎo)致的骨量不足及牙槽骨不斷吸收所致的牙槽骨寬度和高度的降低均會影響種植修復(fù)效果[6]，因此，對牙槽骨缺損修復(fù)的研究越來越多。Takahashi[7]拔除13條比格犬上頜第2、3前磨牙，制備5 mm×3 mm×7 mm的骨缺損，缺損位置由β-TCP/Col、β-TCP、Col充填或不充填，術(shù)后4周，β-TCP顆粒留存在骨缺損處，β-TCP/Col和β-TCP組骨生成活躍，膠原組和空白組缺損處結(jié)締組織長入，在β-TCP/col和β-TCP組，可見保存完好的牙槽嵴；8周時，大多數(shù)β-TCP顆粒吸收，只少量剩余。Brkovic[8]在人拔牙創(chuàng)愈合中使用含膠原膜或不含膠原膜的β-TCP/Col復(fù)合物，9個月后進行臨床檢查，無膜組牙槽嵴顯著降低；利用組織形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)對活檢樣本進行分析，新骨生成區(qū)域比例無明顯差異(分別為42.4%和45.3%)，骨粘連蛋白表達均有增強，生成足量活力骨。

2 與種子細胞復(fù)合培養(yǎng)

鐘金晟[9]完整拔除1.5歲雄性比格犬獲得犬牙周膜細胞，在多孔β-TCP/Col支架上貼附生長。掃描電鏡觀察顯示，較多的犬牙周膜細胞貼附材料表面，細胞生長旺盛，排列緊密。細胞伸展充分，呈星形或梭形,表面有絨毛狀結(jié)構(gòu),周圍可見較多細長突起,與材料及周圍細胞緊密相連。細胞表面可見明顯的纖維狀和顆粒狀基質(zhì)分泌物。目前普遍認為異位成骨能力是初步評判材料是否具有成骨活性的重要指標(biāo)[10]。許衛(wèi)兵[11]觀察骨髓基質(zhì)干細胞與β磷酸三鈣體外復(fù)合培養(yǎng)1周后自體回植兔肌肉內(nèi)異位成骨的效果，4周時可見新生骨樣基質(zhì)；8周后新生骨量明顯增多，可見典型的骨組織結(jié)構(gòu)，為復(fù)合物負載種子細胞的研究奠定了基礎(chǔ)。陳竹生[12]制備納米β磷酸三鈣/Ⅰ、Ⅱ型膠原層狀支架-犬骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合物，植入普通級12月齡雜種犬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型：第12周，實驗組分布白色半透明組織，軟骨細胞分布較均一；第24周，實驗組分布白色半透明新生軟骨組織，色澤與正常軟骨相似，質(zhì)韌，表面平整，與正常軟骨界限消失。劉星綱[13]將新西蘭大白兔骨髓間充質(zhì)干細胞與β-TCP/Col支架材料復(fù)合培養(yǎng)3 d，自體回植，10周時，骨外形比對照側(cè)豐滿，與周圍正常骨質(zhì)外形相似；而對照側(cè)尚有許多索條狀新生骨，外形與周圍骨質(zhì)差別明顯，處于骨改建過程中。

Todo,Arahira[14-15]將兔骨髓間充質(zhì)干細胞在β-TCP/col支架上培養(yǎng)28 d評估隨時間進展胞外基質(zhì)生成的變化和支架-細胞系統(tǒng)機械性能的表現(xiàn)，評估彈性模量，β-TCP組的細胞數(shù)和ALP活性較單純膠原組較強，復(fù)合支架組成骨基因表達和I型膠原生成量明顯高于另一組，彈性模量在d 28增加了。其在隨后的研究中通過掃描電鏡觀察支架微觀結(jié)構(gòu)的變化，將彈性模量與生物性能微觀結(jié)構(gòu)相聯(lián)系解釋肉眼可見的材料彈性的多種變化機制。實驗表明，在第一階段由于細胞的增殖和之后網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，復(fù)合支架模量趨于升高；第二階段，由于材料的降解(例如膠原的塑性形變和β-TCP的分解)對性能的影響大于胞外基質(zhì)的生成，所以模量趨于降低；第三階段，礦化結(jié)節(jié)的形成和生長引起的活躍鈣化導(dǎo)致模量的恢復(fù)。

3 添加生長因子

組織工程學(xué)技術(shù)修復(fù)骨缺損正在由傳統(tǒng)的單一材料到復(fù)合材料轉(zhuǎn)變，細胞因子、載藥緩釋系統(tǒng)等載入到復(fù)合材料中，為加快修復(fù)骨缺損提供了良好的動物實驗依據(jù)[16]。臨床前研究和臨床研究已經(jīng)證明骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)能夠應(yīng)用于多種治療干預(yù)，例如骨缺損、不規(guī)則骨折、脊柱融合、骨質(zhì)疏松和根管手術(shù)等[17]。李想[18]將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhBMP-2)復(fù)合到兩種材料上植入大鼠皮下觀察異位成骨的情況，證實了加入rhBMP-2蛋白的兩實驗組表現(xiàn)更高的組織骨密度和骨小梁厚度。Martínez-Sanz[19]通過注射BMP-2蛋白給兩種不同載體實現(xiàn)上腭黏膜下的成骨誘導(dǎo)。7只加入rhBMP-2蛋白和β-TCP生物材料，6只加入rhBMP-2蛋白和膠原凝膠，加入量為5～10 μL，位置是2～3腭皺之間右側(cè)腭黏膜，對側(cè)做空白對照，6周后，未見編織骨等新骨，實驗側(cè)可見黏膜厚度增加。實驗側(cè)骨調(diào)素、增生細胞核抗原的免疫標(biāo)記反應(yīng)、末端標(biāo)記法均顯示強烈的成骨誘導(dǎo)，同一樣本對照側(cè)無此變化。Cristiane Ibanhes[20]將rhBMP-2蛋白負載在多種骨代物上用于兔顱骨垂直引導(dǎo)性骨再生，證實了添加rhBMP-2蛋白促進組織生長平均體積，表現(xiàn)為生成更多薄片狀骨，同時更多骨代物的降解。

Lee[21]將rhBMP-2負載于β磷酸三鈣上，實驗發(fā)現(xiàn)ALP的活性及表達在全β磷酸三鈣顆粒組顯著增加。在SD大鼠顱骨缺損模型中，術(shù)后4、8周CT及組織學(xué)檢測，載rhBMP-2蛋白的TCP和載rhBMP-2蛋白的TCP/HA(80%/20%)組充滿新骨且骨體積和小梁數(shù)均高于未載rhBMP-2蛋白各組，證實了β磷酸三鈣可用作rhBMP-2蛋白的載體。

Tobias[22]構(gòu)建β磷酸三鈣和Ⅰ、Ⅱ型膠原的雙層結(jié)構(gòu)修復(fù)gottingen小型豬的兩條后腿膝關(guān)節(jié)中的髕骨槽內(nèi)側(cè)小面上的骨軟骨臨界性缺損。實驗分3組，第一組為空白對照組，缺損處不充填任何物質(zhì)(自體愈合，n=12)；第二組充填該雙層結(jié)構(gòu)(n=12)；第三組，雙層結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上添加生長因子混合物(BMP-2,3,4,6,7和轉(zhuǎn)化生長因子1，2，3)(n=12)，術(shù)后第6、12、52周對缺損的再生情況進行評估，通過光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡和X射線顯微照相術(shù)等手段對缺損再生和移植物吸收進行定性和定量的組織形態(tài)學(xué)檢測，臨界骨缺損始終沒有發(fā)生自愈,第一組52周的骨形成率最高只有(21.84±2.81)%；雙層結(jié)構(gòu)充填后新骨形成較空白對照組明顯增多，6周時(29.8±9.68)%，12周時(40.09±4.76)%,52周時β磷酸三鈣幾乎完全降解(4.35±3.70)%，缺損部位由薄層狀的骨小梁充滿;第三組β磷酸三鈣吸收更早、骨再生更快。

4 小結(jié)與展望

劉星綱、Zheng、Eiji分別將支架材料應(yīng)用于兔下頜骨下緣箱型缺損、兔股骨孔狀缺損和大鼠顱骨缺損，實現(xiàn)了不同部位、不同形狀的骨缺損的修復(fù)，反映了β磷酸三鈣/膠原復(fù)合物生物相容性、骨誘導(dǎo)性高，適合多種類型的骨組織修復(fù)；其易于塑形，術(shù)中操作方便，可塑性好。Kishore[23]選擇雙側(cè)牙周骨下缺損患者的20個部位作為研究對象，比較β-TCP添加可吸收I型膠原膜與否對其再生潛力的影響。0、6周及3、6、9個月分別測定菌斑指數(shù)、牙周指數(shù)、牙周袋深度、附著水平和牙齦退縮，結(jié)果顯示，兩組各項指標(biāo)均有改善，單純移植物和膜都顯示出了理想的實驗結(jié)果。但將β-TCP和I型膠原聯(lián)合使用并不能有統(tǒng)計學(xué)角度的療效增強。

鐘金晟觀察到犬牙周膜細胞在支架材料表面伸展充分，與支架、細胞緊密相連且分泌基質(zhì)。Zhang[24]觀察到大鼠牙胚細胞與滴加rhBMP-2蛋白的支架材料復(fù)合培養(yǎng)后，形成典型的牙樣結(jié)構(gòu)，同時形成幾率明顯較大，為β磷酸三鈣/膠原支架材料在牙組織工程的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，兩個實驗的結(jié)果為后續(xù)負載種子細胞提供了依據(jù)。同時，Zhang的研究實現(xiàn)了生長因子與種子細胞同時參與支架材料的改性。

關(guān)于生長因子的選擇，生長因子混合物的添加加速了β磷酸三鈣層的吸收，但不能促進新骨生成。

支架材料負載目的基因修飾的種子細胞是基因工程與骨組織工程結(jié)合的重要成果。Kaige[25]在修飾種子細胞時利用非病毒載體GenEscortTM基因轉(zhuǎn)染效率高達(36.67±4.12)%，得出了其介導(dǎo)的BMP-2基因轉(zhuǎn)染可以作為基因修飾骨組織工程的一種安全有效的非病毒轉(zhuǎn)染途徑。而寧寅寬[26]利用的則是重組腺病毒作為載體，成功對骨髓間充質(zhì)干細胞進行了基因修飾，修飾后的細胞高效表達了目的基因。李娟[27]制備納米級多孔β磷酸三鈣/膠原支架，并負載BMP-2質(zhì)粒DNA形成基因修飾的支架材料，成功修復(fù)大鼠顱骨頂部骨缺損。兩種載體的成功運用，選擇的質(zhì)粒DNA濃度為以后研究提供了實驗參數(shù)和依據(jù)。目前采用基因工程聯(lián)合骨組織工程可以有效防止細胞老化，并且能使細胞長期有效地表達生長因子[28]。第三代支架的發(fā)展趨勢是其應(yīng)具有成血管化和成骨誘導(dǎo)性。血管化和骨組織再生是骨愈合過程中的2個最基本環(huán)節(jié)，體外構(gòu)建的組織工程化骨植入體內(nèi)后必須迅速建立充分的血供為種子細胞提供充足營養(yǎng)[29]。

綜上，單純β磷酸三鈣/膠原支架材料已經(jīng)用于臨床研究，更多的人體內(nèi)研究將會開展，通過細胞、生長因子對β磷酸三鈣/膠原支架材料進行改性，一方面可以檢驗支架材料對不同細胞的生物相容性，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域；另一方面，可以不斷調(diào)整支架材料降解速度與新骨生成速度，使之同步，進而提高成骨效率并加快愈合，發(fā)展前景廣闊。而利用基因工程手段實現(xiàn)細胞表達水平的改變的研究較少，隨著學(xué)科交叉的深入發(fā)展，相信會成為研究的前沿。

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[責(zé)任編輯：李薊龍]

丁義(1990-)，男，河北張家口人，碩士研究生在讀。

R 318.08

C

10.3969/j.issn.1673-1492.2016.10.020

來稿日期：2016-04-13