高 珊， 孔立紅

湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院，武漢 430061

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Tau蛋白的過度磷酸化機制及其在阿爾茨海默病中的作用*

高 珊， 孔立紅△

湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院，武漢 430061

阿爾茨海默??； Tau蛋白； 異常磷酸化； 神經(jīng)纖維纏結； 14-3-3ζ蛋白

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是最為常見的神經(jīng)退行性疾病之一，其臨床表現(xiàn)主要有記憶功能的進行性衰退、認知功能障礙、語言及社交功能減退，乃至人格改變及生活能力喪失等,直至死亡[1]。其病因和發(fā)病機制至今尚無定論，但大量研究表明，該病病理特征主要表現(xiàn)為神經(jīng)細胞外的老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)元內的神經(jīng)纖維纏結(neurofibrillarytangles，NFTs)、神經(jīng)元功能的喪失以及突觸數(shù)目的減少等[2]。細胞內的神經(jīng)纖維纏結主要由雙螺旋纖維細絲(paired helical filaments，PHF)聚集變粗后扭曲而成，雙螺旋纖維形成依賴Tau蛋白的過度磷酸化[3-4]。形成老年斑的β-淀粉樣蛋白(amyloid β peptide，Aβ)的毒性作用也需要Tau蛋白介導[5-6]。表明Tau蛋白異常在AD的發(fā)展過程中扮演著重要角色。

1 Tau蛋白的結構特征

Tau蛋白基因主要位于17號染色體上，由單基因編碼。其一級結構特征明顯，從羧基端到氨基端依次分為4個功能區(qū)：N端的投射功能區(qū)(projection domain)、脯氨酸富集區(qū)(proline-rich domain)、微管結合區(qū)(microtubule bindingdomain)以及C端功能區(qū)(C-terminal domain)等[7-8]。微管結合區(qū)由3～4個Pro-Gly-Gly-Gly重復序列構成，幫助Tau蛋白結合在微管的外表面，促進微管的組裝，并參與軸突運輸[9]。N端含有不同數(shù)量的插入序列，從微管表面外伸出來與其他細胞骨架成分和細胞膜接觸，在維持軸突的穩(wěn)定中發(fā)揮重要的作用。微管結合區(qū)重復序列數(shù)量的差異以及N端插入序列數(shù)量的不同，使得Tau蛋白出現(xiàn)6種不同的異構體[10]。Tau蛋白的分布區(qū)域主要集中在大腦的額葉、顳葉、海馬和內嗅區(qū)的神經(jīng)元，還包括外周神經(jīng)的軸突，就結合能力而言，軸突明顯高于神經(jīng)元胞體以及樹突。

2 Tau蛋白的生理功能

Tau蛋白是一種微管相關蛋白，與微管蛋白結合后可作為微管組裝早期的核心，促進其他微管蛋白在此核心上延伸聚集形成微管，防止解聚，維持其結構的穩(wěn)定性，保持微管間的距離，影響神經(jīng)元軸突的蛋白激酶附著點，且在神經(jīng)元可塑性中起著重要的作用[11-12]。Tau蛋白還可通過維持微管結構的穩(wěn)定性，為軸突生長延伸創(chuàng)造條件[13]。在細胞內，Tau蛋白幫助微管組織中心運輸線粒體、溶酶體等細胞器和胞外分泌囊泡[14]。此外，Tau蛋白還參與少突膠質細胞髓鞘形成，在促進少突膠質細胞成熟中具有重要作用[15]。Tau蛋白還可通過結合到14-3-3ζ蛋白而參與細胞內信號通路，間接調節(jié)細胞內多種蛋白的分布和功能。Tau蛋白異常表達或翻譯后修飾方式異常都會使之失去對微管的穩(wěn)定作用，造成神經(jīng)細胞功能退化，進而引發(fā)相應的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[16-19]。

3 Tau蛋白的翻譯后修飾

Tau蛋白的翻譯后修飾是調控Tau蛋白結構和功能的重要方式，常見的有磷酸化(phosphorylation)、糖基化(glycosylation)、乙?；?acetylation)、截斷(truncation)、肽脯氨酸異構化(peptidyl-prolyl isomerization)等。

3.1 Tau蛋白磷酸化

Tau蛋白磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)殘基，成人腦組織中最長的Tau蛋白異構體形式(Tau441)共含有80個Ser和Thr殘基，這些殘基都是磷酸化修飾的潛在作用位點[20]。近期有研究表明，Tau蛋白上部分酪氨酸(Tyr)位點也可能發(fā)生磷酸化[21-22]。正常成熟腦內Tau蛋白磷酸化位點很少，平均只有2、3個，而AD患者腦中Tau蛋白磷酸化位點高達40個以上，其中Thr231、Ser262的磷酸化直接影響了Tau蛋白與微管的結合[20，23]。同時，Tau蛋白各磷酸化位點之間還可能發(fā)生相互調控而影響Tau蛋白的功能[24-25]。

Tau蛋白的磷酸化和去磷酸化是受磷酸激酶和磷酸酯酶共同調控的近似平衡過程[26-29]，2種酶相互調控將Tau蛋白的磷酸化水平維持在正常狀態(tài)。而在AD患者腦中，這種平衡狀態(tài)被打破，磷酸激酶和磷酸酯酶的表達水平失衡，引起Tau蛋白磷酸化水平異常升高。Tau蛋白的構象也會影響其磷酸化水平，如對pThr231-Pro232肽脯氨酸順反異構的系列研究表明，順式構象的Tau蛋白更容易被過度磷酸化而形成神經(jīng)纖維纏結[30-31]。Tau蛋白過度磷酸化可影響星形膠質細胞的形態(tài)，使其突起延伸和胞體肥大、增生，改變與相鄰神經(jīng)元間的關系，從而導致神經(jīng)元異常放電，增生的神經(jīng)突起還可與鄰近神經(jīng)元形成異常突觸。Tau蛋白的糖基化及其他翻譯后修飾方式也對磷酸化有微妙的調節(jié)作用[16，32]。

3.2 Tau蛋白的糖基化

Tau蛋白糖基化包括N-糖基化和O-糖基化，其中N-糖基化主要發(fā)生在蛋白質的天冬酰胺(Asn)殘基上，是過度磷酸化Tau蛋白的糖基化方式，而O-糖基化主要發(fā)生在Ser或Thr側鏈羥基上，是正常Tau蛋白的糖基化形式[33-35]。神經(jīng)纖維纏結中存在大量N-糖基化Tau蛋白，N-糖基化Tau蛋白對于細胞氧化應激的產生具有促進作用，可能是Tau蛋白形成神經(jīng)纖維纏結的誘因[36]。O-糖基化也對Tau蛋白的結構和功能有一定調節(jié)作用，O-糖基化和磷酸化在某些位點發(fā)生競爭，某位點的糖基化修飾位點被占用后將對空間上相鄰位點的酸化修飾產生一定的影響，O-糖基化的下調會引起Tau蛋白很多位點的過度磷酸化[20，37]。因此，通過調節(jié)Tau蛋白糖基化水平降低過度磷酸化可能成為治療AD的途徑。

3.3 Tau蛋白的乙?；?/p>

García-Sierra等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Tau蛋白280位的賴氨酸(Lys)存在p300和SIRT1介導的乙?；揎?、去乙?；揎棧撐稽c的乙?；龠M了Tau蛋白自身的磷酸化，在相同條件下乙?；腡au蛋白比去乙酰化的Tau蛋白更易聚集形成纖維絲。深入研究表明，在AD患者腦組織病變出現(xiàn)的前期和中期，已經(jīng)可以檢測到Tau蛋白的乙?；揎?，個別位點的錯誤乙酰化會降低Tau蛋白與微管的結合能力，從而降低微管結構的穩(wěn)定性，甚至解聚。另外，Tau蛋白的乙?；芗觿au蛋白本身磷酸化程度。因此，深入探索Tau蛋白乙?；{控磷酸化的分子機制，以及Tau蛋白自身乙?；瘜ι窠?jīng)纖維聚集的影響，對于開發(fā)AD診斷及治療相關藥物具有重要意義。

3.4 Tau蛋白的截斷

天然Tau蛋白是一系列蛋白酶的底物，蛋白酶酶切或者通過其他途徑產生的蛋白片段可能加速Tau蛋白的聚集及神經(jīng)退行性疾病的進展[38]。Zhang等[39]研究表明，天冬酰胺內肽酶(asparagine endopeptidase，AEP)可以誘發(fā)機體衰老機制，并通過抑制微管的裝配功能誘導Tau蛋白截斷或聚集，從而觸發(fā)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。目前Tau蛋白已經(jīng)鑒定出了9個酶切位點，這9個位點的截斷由不同的蛋白酶介導，截斷所產生的片段聚集速度明顯快于正常大小的Tau蛋白，產生明顯細胞毒性[40]。因此，Tau蛋白的截斷與AD的發(fā)展有一定的相關性。

除以上幾種翻譯后修飾的形式之外，Tau蛋白還存在肽脯氨酸異構化、泛素化、類泛素化、硝基化和多聚胺化等翻譯后修飾方式。Tau蛋白的不同修飾方式可能發(fā)生在同一位點，不同的修飾方式之間相互調控，對AD發(fā)生和發(fā)展具有不同程度的影響。

4 Tau蛋白過度磷酸化與AD

4.1 Tau蛋白過度磷酸化機制

在機體生長發(fā)育過程中，蛋白質的磷酸化和去磷酸化是其發(fā)揮正常生理作用的重要環(huán)節(jié)。蛋白激酶活性升高或者磷酸酯酶活性降低是引發(fā)Tau蛋白過度磷酸化的直接原因。研究表明，Tau蛋白磷酸化是由多種蛋白激酶共同作用引起的，這些蛋白激酶主要分為脯氨酸指導的蛋白激酶(proline-directed protein kinase，PDPK)、非脯氨酸指導的蛋白激酶(non-proline-directed protein kinase，non-PDPK)和酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinases，TPK)。在擁有大量絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化Tau蛋白激酶中，脯氨酸指導的Tau蛋白激酶糖原合成酶激酶-3(glycogensynthase kinase-3，GSK-3)和細胞周期素依賴蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)是誘導Tau蛋白磷酸化的主要激酶，因此，PI3K/AKT-GSK-3β信號通路是調節(jié)Tau蛋白磷酸化的主要通路之一[41]。

4.2 Tau蛋白過度磷酸化與Aβ相互作用參與AD的發(fā)生

Aβ主要由APP蛋白經(jīng)β分泌酶途徑產生，現(xiàn)在醫(yī)學界普遍認同Aβ蛋白在人大腦內沉積是AD病理變化的中心環(huán)節(jié)[42]。Tau蛋白的過度磷酸化與Aβ生成之間可能存在相應的調節(jié)機制。研究發(fā)現(xiàn)，在腦脊液過度磷酸化Tau蛋白(hyperphosphorylated Tau，p-Tau)呈陰性的認知障礙患者中，腦脊液Aβ含量與腦皮質萎縮沒有相關性，然而p-Tau呈現(xiàn)陽性的患者會出現(xiàn)腦皮質萎縮程度與腦脊液中Aβ表達量負相關的趨勢，提示p-Tau存在是Aβ影響皮質萎縮的必備因素[43]。另一方面，神經(jīng)細胞異常分泌和積累的Aβ通過激活Tau蛋白激酶，促進Tau蛋白磷酸化，引發(fā)慢性炎性反應，激活細胞凋亡，產生未被代謝完全的自由基，引起神經(jīng)元細胞內氧化與抗氧化作用失衡，從而導致大量神經(jīng)元及神經(jīng)膠質細胞死亡。

Aβ需要依賴Tau蛋白產生下游的毒性作用[44-45]，Aβ單獨作用于缺乏內源性Tau蛋白的海馬神經(jīng)元時無法引起神經(jīng)細胞的退行性改變。而另一項研究表明，僅降低AD小鼠Aβ的水平不能緩解其學習記憶障礙，只有同時減少Aβ和Tau蛋白才能改善AD小鼠的認知功能。Aβ蛋白單體在腦組織病變發(fā)生的早期即可影響神經(jīng)元軸突的運輸，抑制線粒體中的ATP形成以及神經(jīng)營養(yǎng)因子受體在軸突中的正常功能[46]。生理狀態(tài)下，只降低Tau蛋白表達水平不能很好地修復神經(jīng)元軸突的運輸功能。而在Aβ蛋白存在的條件下，Tau蛋白表達的下調表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)保護作用。說明降低Tau蛋白能在不影響軸突運輸功能的情況下阻止Aβ異常表達介導的軸突運輸障礙[47]。除此之外，Tau蛋白還參與調節(jié)Aβ和非受體型酪氨酸蛋白激酶Fyn對神經(jīng)網(wǎng)絡的異常興奮作用[48]。

目前，對于Tau蛋白通過調控Aβ毒性參與AD發(fā)生的可能機制有2種假說：① Fyn激酶是Tau蛋白和Aβ連接的紐帶，AD患者神經(jīng)系統(tǒng)中定位在神經(jīng)元細胞胞體樹突上的Tau蛋白通過結合Fyn，使Fyn累積在樹突棘上。樹突棘F(xiàn)yn磷酸化修飾促進了NMDA與樹突棘神經(jīng)元中的支架蛋白PSD95形成穩(wěn)定的相互作用。這種作用激活了興奮性神經(jīng)遞質Glu的信號傳導，導致Aβ蛋白對神經(jīng)元的興奮性毒性[49]。② GSK-3介導了Tau蛋白對Aβ的調控，該假說認為共同的上游途徑GSK-3分別同時存在于Aβ和Tau蛋白的上游信號通路，具有調節(jié)兩者生理病理改變的作用[40]。GSK-3有GSK-3α和GSK-3β兩種異構體，其中GSK-3β在中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量表達[50]。有數(shù)據(jù)表明，GSK-3β的功能除了誘導Tau蛋白磷酸化之外，還會影響Aβ的生成和毒性積累，GSK-3可調控APP的酶解作用使Aβ生成增加，而Tau蛋白能夠調節(jié)GSK-3β磷酸化，降低Tau蛋白表達量可以抑制GSK-3活性[51]。Tau蛋白除了間接地調節(jié)Aβ的毒性作用之外，還可以與Aβ直接結合形成可溶性復合體。結合后的復合物通過提高GSK-3β活性促進了Tau蛋白磷酸化，同時成為Aβ蛋白積累的作用中心，加劇Aβ生成淀粉樣沉淀[52]。

4.3 Tau蛋白過度磷酸化與14-3-3ζ相互作用參與AD的發(fā)生

14-3-3蛋白基因序列高度保守，蛋白分子量較小，能夠參與調節(jié)機體的多種生理過程，共存在7種不同基因亞型[53]。有研究表明，14-3-3蛋白的ζ亞型在AD患者大腦NFTs中表達增高最顯著，提示14-3-3ζ與AD病變息息相關[54]。Qureshi等[54]通過一系列體外實驗研究了AD患者腦組織提取物中14-3-3ζ與Tau蛋白的相互作用，結果顯示14-3-3ζ與Tau能夠被共同免疫沉淀，表明14-3-3ζ與Tau能夠相互結合。當Tau蛋白與14-3-3ζ一起在EP管中共培養(yǎng)時，Tau蛋白會形成無定形的聚集體、單鏈、直絲、帶狀的細絲和PHFs狀細絲等不同狀態(tài)，這些都與在AD患者腦中分離的病變超微結構相似。另外通過電鏡可以直接觀察到病變超微結構中同時存在Tau蛋白和14-3-3ζ，且它們的具體形態(tài)與培養(yǎng)時間有一定的相關性。當磷酸化Tau蛋白與14-3-3ζ一起培養(yǎng)時，它們以類似的方式聚集。

4.4 Tau蛋白過度磷酸化與p62相互作用參與AD的發(fā)生

AD大鼠腦內神經(jīng)元數(shù)量減少，多功能蛋白p62的表達顯著降低。p62表達量降低使NF-E2相關因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)的抗氧化反應序列元件信號通路的抗氧化應激能力顯著降低，這可能是AD腦組織中Tau過度磷酸化及隨后的神經(jīng)元結構和功能損傷的原因[55]。

神經(jīng)元細胞中含有大量的不飽和脂肪酸，當游離基在腦組織中大量積累時可引起不飽和脂肪酸變性，從而導致神經(jīng)元細胞受到嚴重損傷。細胞內活性氧水平增加時，細胞自噬途徑被激活，細胞自噬與其氧化應激密切相關，兩者都能造成AD患者腦組織的損傷[56]。p62的表達增加可以通過分離Keap1而干擾泛素連接酶的功能。因此，神經(jīng)元細胞自噬與p62蛋白均可能通過干擾Keap1-Nrf2系統(tǒng)以及降低腦組織的氧化應激耐受性，導致AD腦組織中Tau蛋白的過度磷酸化。p62通過LC3-相互作用區(qū)(LC3-interacting region，LIR)與自噬體的LC3連接，并通過溶酶體途徑降解。因此，p62的表達水平與自噬水平呈正相關。由此可知，AD患者腦中細胞自噬程度的增高可以降低p62的表達。p62可能通過激活氧化應激相關的信號轉導通路的方式對神經(jīng)細胞起到保護作用。因此，神經(jīng)元細胞自噬增加，誘導p62過度降解，可能與AD患者腦中Tau蛋白過度磷酸化以及隨后神經(jīng)元結構和功能損傷密切相關。

4.5 Tau蛋白過度磷酸化直接參與AD的發(fā)生

研究表明，Tau蛋白的過度磷酸化加快了其在大腦和腦脊液中的積累并直接促進NFTs的形成[57]。過度磷酸化的Tau蛋白與MAP1、MAP2等微管蛋白競爭性地結合微管導致微管解聚，微管系統(tǒng)瓦解后阻礙軸漿的運輸，從而拮抗性阻礙了Tau與微管蛋白的結合。從微管上脫落下來的Tau蛋白彼此互相聚集形成具有神經(jīng)毒性的纖維狀物質NFTs，而NFTs在不改變微管完整性的前提下即可減弱順向軸漿運輸能力，進而通過異常復雜的機制誘發(fā)神經(jīng)元變性并最終引起癡呆的發(fā)生[58-59]。

5 抑制Tau蛋白過度磷酸化治療AD的潛在方法

Tau蛋白磷酸化及去磷酸化由蛋白激酶和磷酸酯酶催化，因此，使用蛋白激酶抑制劑是治療AD的潛在方法之一。研究表明，接受GSK-3β抑制劑ARA014418治療的AD小鼠腦干組織中不溶解的Tau蛋白含量比對照組小鼠明顯減少?？怪旅艄押塑账崮茴A防Aβ蛋白誘導的Tau蛋白過度磷酸化。令人失望的是，研發(fā)激酶抑制劑的道路困難重重，目前市面上已有的激酶抑制劑大多數(shù)是針對蛋白質氨基酸殘基上普通的ATP結合位點，而無法選擇性地完全抑制某一種特異性激酶。此外，由于激酶作用的廣泛性，激酶抑制劑還可能會產生副反應。盡管激酶抑制劑在腫瘤的治療中已經(jīng)開展得如火如荼且收獲頗多，但酶抑制劑類藥物能否對AD產生療效還是未知數(shù)。另一方面，通過拮抗作用降低Tau蛋白磷酸化水平也能夠緩解AD的發(fā)展。最有利的證據(jù)就是美金剛胺(memantine)，它是由美國食品及藥物管理局(FDA)批準用于治療中重度AD的NMDA受體拮抗劑，此拮抗劑可通過抑制岡田酸(okadaic acid)引起的Tau蛋白過度磷酸化進而實現(xiàn)對大鼠海馬神經(jīng)元變性的修復[60]。

6 展望

Tau蛋白的異常磷酸化是AD的重要病理特征之一，對Tau蛋白異常磷酸化的研究為揭示AD發(fā)病的分子機制提供了依據(jù)。在AD的不同發(fā)病階段，Tau蛋白異常磷酸化都會發(fā)揮重要作用。在神經(jīng)元細胞病變的早期，已經(jīng)出現(xiàn)了Tau蛋白異常磷酸化，通過阻礙神經(jīng)元軸突運輸，引發(fā)胞體突觸丟失和神經(jīng)炎發(fā)生；發(fā)展到晚期病變則表現(xiàn)出NFTs的大量積累，正常細胞功能喪失，從而導致AD的發(fā)生。同時，NFTs可能屏蔽了很多重要的功能性蛋白質，加劇神經(jīng)元功能的損傷。Tau蛋白的正常磷酸化和去磷酸化受著細胞內許多蛋白激酶和磷酸酯酶的調節(jié)。在異常的神經(jīng)細胞中，調節(jié)它正常生理功能的這些酶發(fā)生了表達量和催化活性的異常升高或降低。對這些調節(jié)酶的研究在以Tau蛋白為靶點的AD治療方面具有一定的指導意義。抑制神經(jīng)元細胞中Tau蛋白的過度磷酸化可以有效緩解神經(jīng)退行性病變的發(fā)生和發(fā)展，改善AD患者的認知功能。

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(2016-05-05 收稿)

*國家自然科學基金資助項目(No.81373741)

R749.16

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.024

高 珊，女，1982年生，博士研究生，E-mail：gaoshan7200@sohu.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail:xiyu1618@sina.com