趙洪良　張翠萍　陳 艷　趙換軍　譚志軍　付小兵（1.解放軍醫(yī)學(xué)院01級博士研究生，北京 10085；.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點實驗室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點實驗室，北京 10008；.北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科，北京 100700；.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 00070）

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DNA去甲基化與間充質(zhì)干細(xì)胞的分化調(diào)控

趙洪良1，2張翠萍2陳 艷3趙換軍4譚志軍4付小兵2
（1.解放軍醫(yī)學(xué)院2012級博士研究生，北京 100853；2.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生重點實驗室暨皮膚損傷修復(fù)與組織再生北京市重點實驗室，北京 100048；3.北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科，北京 100700；4.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070）

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種重要的多能干細(xì)胞干細(xì)胞，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為多譜系細(xì)胞，如心肌、骨、軟骨、肌肉和脂肪等多種組織，因其可用于修復(fù)損傷組織及治療某些遺傳缺陷性疾病而具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，所以近年來成為基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的研究熱點,并取得了豐碩的成果[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中其形態(tài)發(fā)生需要經(jīng)歷兩個階段；第一階段是MSCs確定向成骨、成軟骨、成肌和成脂4個譜系中的一個發(fā)展，并且失去分化成其他譜系的能力。第二階段是定向前體細(xì)胞表現(xiàn)出相應(yīng)譜系成熟細(xì)胞的特征[2]。這個分化過程受到一連串的組織特異性轉(zhuǎn)錄因子和生長因子調(diào)節(jié)。以DNA去甲基化為先導(dǎo)，調(diào)節(jié)MSCs形態(tài)發(fā)生過程中關(guān)鍵節(jié)點轉(zhuǎn)錄因子的有序表達(dá)，可以產(chǎn)生多譜系的組織，包括骨、軟骨、肌肉、脂肪和骨髓基質(zhì)等，由此可見，DNA去甲基化是MSCs細(xì)胞分化過程中起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用。此外，DNA去甲基化相關(guān)藥物的研究進(jìn)展迅速，臨床應(yīng)用范圍不斷擴大，已經(jīng)取得較好的效果。本文對近年來DNA去甲基化與MSCs分化調(diào)控的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用綜述如下。

1　DNA去甲基化

DNA去甲基化是指已經(jīng)發(fā)生甲基化的5-甲基胞嘧啶被胞嘧啶代替的過程，DNA去甲基化主要有兩種方式：被動去甲基化和與復(fù)制有關(guān)的去甲基化，其可能存在多種機制，如堿基切除修復(fù)、脫氨酶、核苷酸外切、氧化或水解等導(dǎo)致DNA去甲基化[3-4]。DNA甲基化對于維持細(xì)胞分化的高度穩(wěn)定性具有重要的作用，由于DNA去甲基化,而使其使沉默的染色質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。

1.1DNA去甲基化在成肌細(xì)胞分化中的作用被動去甲基化可以解除基因轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)導(dǎo)致組蛋白去乙?；?，使染色體變得松散，并促進(jìn)基因活性功能增加[4]。 MSCs分化為骨骼肌細(xì)胞的程序就是受到全身低甲基化狀態(tài)和某些特異性位點低甲基化的調(diào)控[5]。在分化開始的第一階段，成肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors, MRFs)發(fā)生去甲基化調(diào)控肌肉特異性基因的轉(zhuǎn)錄活性，而成肌分化因子(myogenic differentiation,MYOD)和成肌因子5的作用是喚醒MSCs向成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化[6-7]。進(jìn)入第二階段后，核心因子的去甲基化是在甲基化結(jié)合蛋白(methyl-binding domain protein2b,MBD2b)的作用下發(fā)生的，這會加速成肌細(xì)胞的終末分化。繼發(fā)于去甲基化的MRFs、肌細(xì)胞生成素(myogenin, MYOG)、MRF4 (也被稱為MYF-6) 驅(qū)動定向成肌細(xì)胞的增殖并最終分化為肌細(xì)胞或者肌管[7-9]。.此外，肌肉結(jié)構(gòu)基因α-actin發(fā)生去甲基化后表達(dá)增強與肌管的形成增加有關(guān)。

1.2DNA去甲基化在成骨細(xì)胞分化中的作用定向的成骨細(xì)胞前體細(xì)胞在形成軟骨細(xì)胞之前，一些系列的去甲基化基因編碼關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄因子對軟骨細(xì)胞譜系的定向分化和成骨特異性基因表達(dá)有重要作用[10]，例如去甲基化調(diào)節(jié)成骨基因有SRY盒因子9（SRY box-containing factor 9，SOX9）和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）。其中RUNX2 通過大量的共同激活和抑制因子來轉(zhuǎn)換誘導(dǎo)多潛能MSCs定向進(jìn)入成骨途徑，并通過RUNX2表達(dá)升高抑制非定向骨-軟骨祖細(xì)胞的軟骨潛能，觸發(fā)成骨細(xì)胞在分化早期的大多數(shù)成骨誘導(dǎo)基因表達(dá)，以及增加未成熟成骨細(xì)胞的數(shù)量[11-12]。此外，還有一個重要的參與者是轉(zhuǎn)化生長因子 -β（transforming growth factor-β， TGF-β）,它通過激活SOX9促進(jìn)MSCs向成骨分化[13]。之后，軟骨調(diào)節(jié)素-I (chondromodulin-I，CHM1)、軟骨粘連素(chondroadherin，CHAD)、成纖維細(xì)胞生長因子受體-3 (fibroblast growth factor receptor-3，F(xiàn)GFR3)、α1(II)膠原[α1 (Ⅱ) collagen] 和 α1(X)膠原[α1(X) collagen] 等CpG富集軟骨細(xì)胞表型相關(guān)的基因啟動子發(fā)生去甲基化[13]，促使相關(guān)基因活化。MSCs的成骨分化也依賴于成骨誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子和大量骨譜系定向基因的繼發(fā)表達(dá)[13]，這些基因有遠(yuǎn)端缺失同源盒5(distal-less homeobox5,DLX5)、 RUNX2、 BGLAP[bone gammacarboxyglutamate (Gla) protein] 和OSX (osterix)，它們在骨分化起始被去甲基化以促進(jìn)MSCs向特異性成骨分化[14]，而且成骨細(xì)胞的成熟過程通過骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2， BMP2）和OSX介導(dǎo)。此外，大量與成骨分化有關(guān)的基因啟動子區(qū)域被去甲基化以便于成骨細(xì)胞逐步獲得骨細(xì)胞表型，這些啟動子包括骨鈣素(osteocalcin, OC)、 骨橋蛋白(osteopontin, OPN)、 堿性磷酸酶和I型膠原。

1.3成脂細(xì)胞分化的DNA去甲基化調(diào)控主轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatoractivated receptor gamma, PPARγ）和 C/EBPα （CCAAT/enhancer binding protein alpha） 是 成 脂分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子。外源性表達(dá)的PPARγ和C/EBPα能使成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞。啟動子去甲基化促進(jìn)成脂譜系定向分化和阻止向非脂肪轉(zhuǎn)化。同樣，大量脂肪相關(guān)基因如瘦素(leptin)、 脂肪酸結(jié)合蛋白4 (fatty acid-binding protein 4,FABP4)、 脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase ，LPL)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter type 4，GLUT4) 的低甲基化使其蛋白得到相應(yīng)的表達(dá)，繼而增強脂肪分化[12]。

2　DNA去甲基化調(diào)控干細(xì)胞分化在表觀遺傳治療中的應(yīng)用

成體干細(xì)胞的細(xì)胞分化關(guān)鍵是增殖能力改變和獲得新的細(xì)胞表型。重要的是，這些分子過程的調(diào)控可以通過DNA去甲基化實現(xiàn)，從而防止與譜系無關(guān)的基因表達(dá)或出現(xiàn)非分化特性成體細(xì)胞。新的證據(jù)表明，表觀遺傳編程機制對疾病的病因能發(fā)揮更大的作用。由于表觀遺傳修飾比基因異常更容易被逆轉(zhuǎn)，它成為疑難疾病的解決方案之一。在這種情況下，改變?nèi)梭w組織中的多能干細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)已經(jīng)成為各種疾病臨床治療應(yīng)用的一個有吸引力的手段。

2.1血液系統(tǒng)疾病通過DNA去甲基化而使甲基化誘導(dǎo)的基因沉默被逆轉(zhuǎn)是干細(xì)胞重新編程用于治療血液系統(tǒng)疾病的重要機制[14-16]。研究表明，骨髓增生異常綜 合 征（myelodysplastic syndromes，MDS） 的 治療可以通過一些基因低甲基化來實現(xiàn)，如β-連環(huán)蛋白啟動子、特異相關(guān)基因，腫瘤抑制基因p16，p15，上皮細(xì)胞鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）和O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase ，MGMT）。造血干細(xì)胞磷酸肌醇磷脂 酶 Cβ1（phosphoinositide-phospholipase Cβ1，PI-PLC-β1）基因啟動子的去甲基化與上述基因的激活和表達(dá)增加有關(guān)，從而提示了MDS治療的潛在靶點。對于人類白血病患者，造血干細(xì)胞中許多基因啟動子的甲基化損害了造血細(xì)胞的分化，包括急性髓系白血病的CCAAT增強子結(jié)合蛋白-α（CCAAT/enhancer-binding protein alpha， CEBP -α）的甲基化，慢性粒細(xì)胞白血病的cellular-abelsongene l癌基因的甲基化，單核細(xì)胞白血病的骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）、降鈣素相關(guān)多肽α、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑2B和視黃酸受體β的甲基化。因此，治療這些惡性腫瘤的有效手段可能涉及這些造血干細(xì)胞中基因的去甲基化，從而為干細(xì)胞正常分化鋪平道路[17-19]，這一方法為這些疾病的治療提供了新的措施。

2.2骨、軟骨及肌肉相關(guān)疾病DNA去甲基化調(diào)節(jié)MSCs的成骨分化技術(shù)的出現(xiàn)，被認(rèn)為是軟骨組織工程、骨組織的改建以及局部或全身性疾病的基因療法的復(fù)興。因為MSCs具有成肌分化能力,所以它可用于治療許多肌肉相關(guān)性疾病。Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥（DMD）是一種致命的骨骼肌壞死性疾病，特點是抗肌萎縮蛋白缺乏。在MSCs中的胚胎肌程序關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的強制表達(dá)，如myod1和PAX3的表達(dá)，可通過DNA去甲基化實現(xiàn)，被認(rèn)為是肌肉再生的一個很有前途的措施[20]。關(guān)節(jié)透明軟骨的再生能力差，而MSCs作為靶細(xì)胞可有效地修復(fù)半月板或關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，或使其再生，并可阻止過早軟骨肥大，這是通過特異性成軟骨基因例如CHM1、 CHAD、 FGFR3、 α1（Ⅱ）膠原和α1（X）膠原的低甲基化實現(xiàn)的[21-22]。MSCs還可用于治療成骨不全。MSCs被編程后，通過低甲基化來表達(dá)Ⅰ型膠原基因，然后應(yīng)用于患者，造成成骨譜系的祖細(xì)胞體內(nèi)增殖，從而治療成骨不全[23]。

2.3神經(jīng)疾病和糖尿病DNA去甲基化誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，然后進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植，這是當(dāng)前探索腦腫瘤、缺血性痙攣性截癱、慢性脊髓損傷和慢性中風(fēng)的未來的治療手段[24]。通過DNA去甲基化介導(dǎo)的分化措施，由原始內(nèi)胚層多能干細(xì)胞最終產(chǎn)生功能性胰島素β細(xì)胞，從而提供了新的胰島素來源，有望成為治療糖尿病的方法。這些措施為大量神經(jīng)退行性疾病和糖尿病患者帶來了新的希望[25]。

3　展 望

隨著表觀遺傳修飾在發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維護(hù)、維持基因完整性和在許多疾病進(jìn)展中體現(xiàn)的作用，去甲基化必然會越來越受到重視。盡管去甲基化仍然有許多懸而未決的問題，例如，哪個基因的去甲基化決定了受精卵的全能性干細(xì)胞分化為定向體細(xì)胞？內(nèi)在因素和/或外在因素如何激發(fā)去甲基化從而刺激胚胎發(fā)育繼而器官的發(fā)生？低甲基化的不同狀態(tài)是如何被其他因素如組蛋白修飾或者染色質(zhì)重組影響的？這些問題的研究對于闡明MSCs的分化機制具有重要的意義。

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DOI:10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 01. 020

(收稿日期：2015-06-25)