孫曉東，呂國忠，趙志慧 ，楊　紅，劉紹芹，蘇　丹

(1.大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連116605; 2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)

會(huì)計(jì)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

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三裂葉豚草霜霉病的病原鑒定及生物學(xué)特性研究

孫曉東1，呂國忠1，趙志慧1，楊紅1，劉紹芹2，蘇丹1

(1.大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連116605; 2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)

會(huì)計(jì)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

摘要：對(duì)霜霉菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明：該菌的孢子囊萌發(fā)的適宜溫度為15～20℃，最適溫度18℃；孢子囊萌發(fā)需較高的濕度，濕度低于95 %時(shí)孢子囊不萌發(fā)；可溶性淀粉對(duì)孢子囊的萌發(fā)有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用，用可溶性淀粉溶液處理孢子囊3 h后，其萌發(fā)率由原來的37.7 %提高到90.9 %；低溫處理孢子囊，會(huì)降低霜霉菌孢子囊的萌發(fā)力，處理時(shí)間越長(zhǎng)，孢子囊的萌發(fā)力越低。恒溫條件下，在10～20℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高，霜霉菌侵染能力增強(qiáng)；保濕時(shí)間低于2 h，霜霉菌不能侵染豚草，說明濕度條件是影響三裂葉豚草發(fā)病與否的重要因素。

關(guān)鍵詞：三裂葉豚草；蒼耳軸霜霉；生物學(xué)特性

Research on Pathogen Identification and Biological Characteristics of

三裂葉豚草(A.trifidaL.)是重要的外來入侵雜草，素有“植物殺手”之稱[1]，已對(duì)中國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成了巨大威脅和危害，其產(chǎn)生的大量花粉是人類重要的過敏源[2]，嚴(yán)重危害了人類健康。為研究三裂葉豚草霜霉病在東三省的發(fā)生情況，對(duì)該地區(qū)進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)鐵嶺、沈陽、鞍山、大連、丹東等地此病發(fā)生嚴(yán)重，且發(fā)病面積廣。目前對(duì)三裂葉豚草的防治包括人工防除、化學(xué)防除、植物替代控制等方法，但由于豚草種子產(chǎn)生量大，蔓延迅速，上述方法都無法徹底根除。近年來，通過大量的野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，三裂葉豚草上普遍發(fā)生霜霉病，這類病害對(duì)三裂葉豚草表現(xiàn)了很強(qiáng)的致病性和致死性，為此，利用專性寄生菌來防治三裂葉豚草已經(jīng)提上了日程。本研究對(duì)霜霉病菌的形態(tài)學(xué)特征及生物學(xué)特性進(jìn)行了深入研究，為利用霜霉菌防治三裂葉豚草提供初步的理論依據(jù)。

1病原的鑒定

1.1　病菌來源

在三裂葉豚草生長(zhǎng)季節(jié)(6-9月)進(jìn)行病害調(diào)查，并在霜霉病多發(fā)的鐵嶺、沈陽、鞍山、大連、丹東等地區(qū)采集發(fā)病豚草樣品。采用直接觀察法，或者刮取葉背面較厚的霉層，用光學(xué)顯微鏡觀察霜霉菌的形態(tài)特征，測(cè)量其孢子囊、孢囊梗大小，根據(jù)《中國真菌志》第六卷(霜霉目)及寄主范圍進(jìn)行鑒定[3]。

1.2　卵孢子觀察

在進(jìn)行霜霉菌卵孢子觀察時(shí)，將干標(biāo)本用清水浸濕，用打孔器在三裂葉豚草霜霉病斑處打取圓片，分別采用NaOH透明法、乳酚油透明法[4]和改良方法進(jìn)行觀察[5]。結(jié)果以改良方法觀察到的細(xì)胞壁與其內(nèi)含物界線清晰可見(如圖1)。

改良方法：取三裂葉豚草霜霉病葉圓片多片置于燒杯中，用10 %NaOH溶液煮沸5～7 min，煮至豚草葉片透明，但尚未消解為止，用清水涮洗2～3次，加酸性品紅染色(若卵孢子逸出可染色1～2 min，否則時(shí)間可稍加長(zhǎng))，用乳酚油作浮載劑進(jìn)行鏡檢。

1.3　病原菌形態(tài)鑒定

經(jīng)光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)該病菌孢囊梗常具隔膜，無色，全長(zhǎng)167.5～515 μm(平均374.3 μm)，主軸長(zhǎng)140～362.5 μm(平均255.8 μm)，占全長(zhǎng)的3/5～5/6，寬度4.2～10 μm(平均6.3 μm)，基部略膨大，上部近直角單軸分枝3～5 次，末枝直或略彎曲，圓錐形，常2～3枝簇生，長(zhǎng)3.3～6.5 μm(平均5.1 μm)，頂端鈍平。孢子囊卵形至橢圓形，基部有短柄，無色，具淺乳突，長(zhǎng)12.2～15.6 μm(平均14.3 μm), 寬 8.8～11.9 μm(平均10.4 μm), 長(zhǎng)∶寬=1.375。卵孢子生于病葉組織內(nèi)，球形或近球形，淡黃色，直徑22.5～40 μm(平均28.2 μm)，壁厚2.5～4(平均2.9 μm)(如圖1)，初步鑒定該菌為蒼耳軸霜霉(PlasmoparaangustiterminalisNovotelnova)。

圖1　蒼耳軸霜霉的孢囊梗、孢子囊及卵孢子

2三裂葉豚草霜霉病菌生物學(xué)特性測(cè)定與分析

2.1　溫度對(duì)孢子囊萌發(fā)的影響

用蒸餾水配制新鮮孢子囊懸浮液，采用懸滴法培養(yǎng)，分別置于5，10，15，20，25℃下處理，每隔0.5 h室溫(18～21℃)下鏡檢各處理的孢子囊萌發(fā)率，統(tǒng)計(jì)3，6，9，12 h后的萌發(fā)率。每項(xiàng)測(cè)定重復(fù)3次，每重復(fù)觀察不少于200個(gè)孢子囊(以下同)。結(jié)果見表1。

結(jié)果表明：孢子囊在0～30℃都能萌發(fā)，其中適宜溫度為15～20℃，最適溫度為18℃且在最適溫度下2 h即可萌發(fā)，12 h時(shí)萌發(fā)率達(dá)85.6 %，24 h基本全部萌發(fā)。在其適宜萌發(fā)的溫度范圍之外，12 h后孢子囊萌發(fā)率增幅緩慢。

表1　不同溫度下孢子囊的萌發(fā)率　%

2.2　濕度對(duì)孢子囊萌發(fā)的影響

在干燥器內(nèi)用硫酸法控制濕度。將葉片背面的新鮮孢子囊彈撒在載玻片上，每次處理8個(gè)載玻片。置于相對(duì)濕度分別為100 %、98 % 、95 %、90 %、85 %、80 % 的干燥器中， 18℃培養(yǎng)。3，6，9，12 h后分別取出2個(gè)載玻片，制片并鏡檢孢子囊萌發(fā)率，以蒸餾水中的孢子囊萌發(fā)為對(duì)照。每重復(fù)觀察不少于400個(gè)孢子囊。

結(jié)果表明：孢子囊萌發(fā)需較高的濕度，濕度低于95 %時(shí)不萌發(fā)。在相對(duì)濕度達(dá)98 %和95 %時(shí)20 h后的萌發(fā)率分別為0.98 %和0.21 %，但在蒸餾水中3 h后的萌發(fā)率高達(dá)55.6 %。

2.3　碳源對(duì)孢子囊萌發(fā)的影響

碳源種類為葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘油。用蒸餾水配制5 %的碳源溶液，18℃下懸滴法培養(yǎng)，以蒸餾水為對(duì)照。3，6，9，12 h后鏡檢孢子囊萌發(fā)率。

結(jié)果表明：可溶性淀粉對(duì)孢子囊的萌發(fā)有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用，3 h后對(duì)照處理的孢子囊萌發(fā)率僅為37.7 %，而可溶性淀粉溶液中的孢子囊萌發(fā)率已達(dá)90.9 %。此外，蔗糖對(duì)孢子囊的萌發(fā)也有促進(jìn)作用，而葡萄糖和甘油對(duì)孢子囊萌發(fā)無促進(jìn)作用(見表2)。

表2　不同碳源下孢子囊的萌發(fā)率　%

2.4　氮源對(duì)孢子囊萌發(fā)的影響

配制體積分?jǐn)?shù)為20 %、10 %、5 %的KNO3溶液，18℃下懸滴法培養(yǎng)。不同質(zhì)量濃度的硝酸鉀對(duì)孢子囊萌發(fā)均有抑制作用，但隨著硝酸鉀質(zhì)量濃度的降低，孢子囊的萌發(fā)率逐漸提高(見表3)。

表3　不同質(zhì)量濃度的硝酸鉀下孢子囊萌發(fā)率　%

2.5　pH值對(duì)孢子囊萌發(fā)的影響

用磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉配制4.92～9.18等15個(gè)不同pH值梯度的磷酸緩沖液，18℃下懸滴法培養(yǎng)。孢子囊在pH值低于6或高于9時(shí)均不萌發(fā)，而在6.4～8.0時(shí)均可萌發(fā)，但都低于蒸餾水中84.5 %的萌發(fā)率，因此最適pH值為7.5，而且孢子囊開始萌發(fā)較對(duì)照處理晚。

結(jié)果表明∶不同酸堿度的磷酸緩沖液對(duì)孢子囊的萌發(fā)均有抑制作用，但隨著pH值的增加萌發(fā)率也提高(見表4)。

表4　不同pH值對(duì)孢子囊萌發(fā)率的影響　%

2.6　極端條件對(duì)孢子囊萌發(fā)的影響

2.6.1低溫對(duì)離體病葉上孢子囊萌發(fā)的影響

取離體葉片上冷凍(-20℃)保存1，3，6 個(gè)月的豚草軸霜霉菌孢子囊，配制每毫升5×104個(gè)孢子囊的懸浮液，采用懸滴法培養(yǎng)，每處理8個(gè)載玻片， 6，12，18，24 h后分別取出2個(gè)載玻片，制片并鏡檢孢子囊萌發(fā)率，以蒸餾水中的新鮮孢子囊萌發(fā)為對(duì)照。

結(jié)果表明∶低溫(-20℃)降低了霜霉菌孢子囊的萌發(fā)力，低溫時(shí)間越長(zhǎng)，孢子囊的萌發(fā)力越低。-20℃冷凍保存1，3，6個(gè)月的立體葉片上的孢子囊雖然具有一定的萌發(fā)力，但是萌發(fā)力較對(duì)照明顯降低(見表5)。

表5　低溫對(duì)離體病葉上孢子囊萌發(fā)率的影響　%

2.6.2干燥對(duì)離體病葉上孢子囊萌發(fā)的影響

將具大量新鮮霉層的三裂葉豚草葉片采下，放入培養(yǎng)皿(直徑為18 cm)中，干燥放置5,15,20,30,60 min后，分別刷下孢子囊，配制每升5×104個(gè)孢子囊的懸浮液，采用懸滴法培養(yǎng)，每處理8個(gè)載玻片，6，12，18，24 h后分別取出2個(gè)載玻片，制片并鏡檢孢子囊萌發(fā)率，以蒸餾水中的新鮮孢子囊萌發(fā)為對(duì)照。

結(jié)果表明∶將離體葉片干燥5 min，其上孢子囊的萌發(fā)力略有降低；干燥30 min后，其上孢子囊的萌發(fā)力顯著降低；干燥60 min，即三裂葉豚草葉片完全干枯，其上的孢子囊不萌發(fā)(見表6)。

表6　干燥對(duì)離體病葉上孢子囊萌發(fā)率的影響　%

3結(jié)論與討論

三裂葉豚草主要分布于中國的遼寧、吉林、黑龍江等省，已成為鐵路和公路兩側(cè)的優(yōu)勢(shì)雜草[6]，危害嚴(yán)重，而入侵的機(jī)制尚不清楚，科學(xué)合理的防治技術(shù)體系還未建立。蒼耳軸霜霉菌的發(fā)現(xiàn)，為利用病原真菌防治豚草提供了新的途徑。向日葵霜霉菌的孢子囊在3～28℃可萌發(fā)，最適溫度為5～10℃；黃瓜霜霉菌孢子囊在5～30℃圍內(nèi)均可萌發(fā)，但最適溫度為15～24℃。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，三裂葉豚草霜霉菌的孢子囊在5～30℃范圍內(nèi)均可萌發(fā)，最適溫度為15～20℃，這與向日葵霜霉菌和黃瓜霜霉菌的孢子囊萌發(fā)溫度有所差異。

采自三裂葉豚草上霜霉菌的孢子囊在室溫蒸餾水中的萌發(fā)率每次都不相同，這主要與孢子囊的成熟度、標(biāo)本采集的時(shí)間及當(dāng)時(shí)的氣候條件對(duì)孢子囊形成的影響因素有關(guān)。此外，孢子囊在pH值6.4～8.0均可萌發(fā)，但萌發(fā)率明顯降低，表明不同酸堿度的緩沖液均對(duì)孢子囊的萌發(fā)有抑制作用，但隨著pH值的增加萌發(fā)率也有提高[7]。

甜瓜種子在播種后分別施用不同量的N、P、K 和6種微量元素，結(jié)果證明：低用量的N和K同時(shí)施用時(shí)，會(huì)加重病害的發(fā)生[8]。因此，在本文氮源與孢子囊萌發(fā)的研究中，選用KNO3作為營養(yǎng)元素，結(jié)果表明，低用量的N和K同時(shí)施用時(shí)，能夠促進(jìn)霜霉菌孢子囊的萌發(fā)率，即會(huì)加重霜霉病的發(fā)生。

碳源中可溶性淀粉對(duì)孢子囊的萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)作用，此外，蔗糖對(duì)孢子囊的萌發(fā)也具有促進(jìn)作用，這種促進(jìn)作用對(duì)向日葵霜霉菌孢子囊也同樣適用，而不同質(zhì)量濃度的蔗糖溶液對(duì)罌粟霜霉菌的孢子囊萌發(fā)無明顯刺激作用[9]。

對(duì)三裂葉豚草霜霉病菌生物學(xué)特性的研究，可進(jìn)一步了解病害的發(fā)生、發(fā)展及致病機(jī)理，為將三裂葉豚草霜霉病菌應(yīng)用于三裂葉豚草的生物防治提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 關(guān)廣清，萬方浩.豚草及豚草綜合治理[M]. 北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1994.

[2] 陶愛林，何韶衡.豚草花粉泛過敏源同源基因克隆與序列分析[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2004，24(3)：169-173.

[3] 余永年.中國真菌志(第六卷)霜霉目[M].北京：科學(xué)出版社，1998.

[4] 郝建軍，劉延吉.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].沈陽：遼寧科學(xué)出版社，2001.

[5] 國家技術(shù)監(jiān)督局. GB 15699-1995(GB/T 15699-2013)煙草種子霜霉病檢疫規(guī)程[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1996：4-17.

[6] 黃寶華.豚草國內(nèi)的分布及其危害調(diào)查[J].植物檢疫，1985，1：62-65.

[7] ANILA DOSHI, B LAL THAKORE. Effect of certain environment factors on germination of conidia ofPeronosporaarborescens(Berk) de bary.[J].J Phytol Res, 1993, 6 (1&2): 59.

[8] MAHRISHI R P, SIRADHANA BS, Effect of nutrition on downy mildew disease caused byPseudoperonosporacubensis(Berk.& Curt．) Rostow[J].On Muskmelon , 1988, 27(2): 153-155.

[9] 李金花.罌粟霜霉病病原及其生物學(xué)特性[J].中國中藥雜志，2002，27(3)：176-179.

(責(zé)任編輯鄒永紅)

Plasmopara Occurring on Ambrosia Trifida L

SUN Xiao-dong1,LV Guo-zhong1*, ZHAO Zhi-hui1,

YANG Hong1, LIU Shao-qin2, SU Dan1

(1.College of Environment and Resources, Dalian Minzu University， Dalian Liaoning 116605, China;

2.School of Accountancy, HeiLongJiang BaYi Agriculture University, Daqing Heilongjiang 163319, China)

Abstract:In the paper, the systemic research on the biological characteristics of downy mildew is conducted. The results show that the preference temperature range for its sporangium germination is from 15 to 20℃ with the optimal temperature of 18℃. Sporangium germination needs higher humidity because humidity is below 95% sporangium fails to germinate. Soluble starch has a strong role in promoting the sporangium germination; after being treated with soluble solution for 3h, the germination rate of sporangium increases from 37.7% to 90.9%. The treatment of sporangium under the condition of low temperature reduces the sporangia germination ability. the longer the processing time is, the lower the germination ability is. Under the condition of constant temperature, within the scope of 10 ℃~20 ℃, with the increase of temperature, downy mildew infection ability enhances. When the moisturizing time is less than 2h, downy mildew can’t infect Ambrosia trifida, which shows humidity condition is the important factor affecting the morbidity of Ambrosia trifida.

Key words:ambrosia trifida L; plasmopara angustiterminalis Novotelnova; biological characteristics

中圖分類號(hào)：Q939.95

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2096-1383(2016)01-0015-04

作者簡(jiǎn)介：孫曉東(1979-) ，女，遼寧丹東人，工程師，主要從事真菌分類與真菌資源利用研究。

基金項(xiàng)目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(DC120101154，DC120101152)。

收稿日期：2015-01-16；最后修回日期：2015-06-01