張　鑫,朱林忠,朱　旭,楊仁杰

(北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所介入科、惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室,北京100029)

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雷替曲塞持續(xù)動脈灌注化療的藥代動力學(xué)研究

張鑫,朱林忠,朱旭*,楊仁杰*

(北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所介入科、惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室,北京100029)

摘要：目的于動物模型中測定雷替曲塞動脈持續(xù)灌注化療期間給藥動脈/回流靜脈及外周靜脈的血藥濃度，分析雷替曲塞在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法8頭小型豬，隨機(jī)分為低濃度組和高濃度組，經(jīng)髂內(nèi)動脈近端給藥，于髂內(nèi)動脈遠(yuǎn)端及髂內(nèi)靜脈、外周靜脈分別采集血液標(biāo)本，采用固相萃取法提取血漿樣品中的雷替曲塞，高效液相色譜儀分析血藥濃度。結(jié)果隨著動脈持續(xù)給藥時間的延長，兩組髂內(nèi)動脈內(nèi)的血藥濃度都迅速達(dá)到最高值，并且峰值變化波動范圍不大，最高峰值分別為161.5 μg/L，631.5 μg/L，藥時曲線下面積(area under curve AUC)分別為285.6 μg/L·h，1 078.3 μg/L·h。隨著動脈持續(xù)給藥時間的延長，兩組髂內(nèi)靜脈內(nèi)的血藥濃度都逐漸緩慢上升，給藥結(jié)束時達(dá)到最高值，動脈給藥結(jié)束后血藥濃度迅速下降。外周靜脈血的血藥濃度未檢出。結(jié)論動脈持續(xù)灌注化療可以在足夠的時間內(nèi)保持局部組織內(nèi)較高血藥濃度，且外周血中濃度極低，更有利于提高局部腫瘤藥物濃度直接殺死腫瘤細(xì)胞，降低全身不良反應(yīng)。

(ChinJLabDiagn,2016,20:0008)

雷替曲塞(N-[5-[N-甲基-N-(2-甲基-4-氧代-3,4-二氫喹唑啉-6-基甲基)氨基]-2-噻吩甲酰基]-L-谷氨酸)是一種喹啉類葉酸鹽類似物，為新型水溶性胸苷合成酶(TS)特異性抑制劑。其作用機(jī)制為：通過葉酸鹽轉(zhuǎn)運載體(RKC)轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)，被多聚谷氨酰合酶(FPGS)代謝為多聚谷氨?；衔铮x擇性抑制TS，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用[1,2]。主要用于治療晚期結(jié)直腸癌[3]。雷替曲塞全身給藥半衰期極短，T1/2α約10 min，該藥被腫瘤組織及正常組織組織快速攝取，在取得理想療效的同時，全身毒性也需要引起注意。

目前雷替曲塞已經(jīng)成為介入治療中常用的化療藥物之一，為了進(jìn)一步掌握動脈持續(xù)灌注狀態(tài)下不同時間點局部組織內(nèi)及外周靜脈內(nèi)的藥物濃度，我們在豬中開展了藥代動力學(xué)研究，并以高效液相色譜檢測血漿中血藥濃度[4-6]。

1材料與方法

1.1實驗動物及給藥劑量本實驗選擇體重45-55 kg的豬作為實驗對象，4公4母，月齡在14-18個月之間。隨機(jī)分為低濃度組和高濃度組；低濃度組給藥方案為1 mg，動脈持續(xù)給藥2 h；高濃度組給藥方案為4 mg，動脈持續(xù)給藥2 h。

1.2插管技術(shù)術(shù)前豬禁食水12 h，采用力月西10 ml和速眠新II 10 ml以20 ml注射器抽吸后混合后麻醉，麻醉成功后采用Seldinger技術(shù)依次穿刺雙側(cè)股動脈及雙側(cè)股靜脈，置入導(dǎo)管鞘。

1.3動脈灌注和采血透視下將5F Cobra導(dǎo)管經(jīng)血管鞘置于髂內(nèi)動脈作為引導(dǎo)導(dǎo)管，然后送入2.8Fr微導(dǎo)管作為給藥導(dǎo)管。經(jīng)對側(cè)股動脈送入Cobra導(dǎo)管至髂內(nèi)動脈遠(yuǎn)端作為采血導(dǎo)管；股靜脈導(dǎo)管鞘置入成功后，將5F Cobra導(dǎo)管送入髂內(nèi)靜脈造影確定位置。將雷替曲塞溶解于250 ml生理鹽水中，經(jīng)2.8Fr動脈導(dǎo)管給予持續(xù)化療灌注，輸液泵控制速度125 ml/h；髂內(nèi)動脈、髂內(nèi)靜脈、外周血采血時間點均為5 min，15 min，25 min，40 min，60 min，80 min，100 min，120 min，140 min，160 min，180 min。整個實驗過程采用靜脈注射3%戊巴比妥維持麻醉。

1.4血漿的分離將收集的血液3 500轉(zhuǎn)/min離心10 min后分離血漿，置于EP管內(nèi)凍存。

1.5標(biāo)準(zhǔn)品與試劑雷替曲塞標(biāo)準(zhǔn)品(批號：140912，南京正大天晴制藥有限公司，純度99.6%)，雷替曲塞樣品(批號：140912，規(guī)格2 mg，南京正大天晴制藥有限公司)。豬的空白血漿，甲醇、乙睛為色譜純，冰醋酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙酸胺為分析純，水為蒸餾水。

1.6色譜條件高效液相色譜儀為Agilent-1260。采用DIKMA-C18(250 mmX4.6 mm，5 μm)。色譜柱；流動相：甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液(8:12:80，PH7.2)：柱溫：30℃；流速:1.0 ml/min；檢測波長:349 nm。

1.7配制雷替曲塞標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密稱取1 mg雷替曲塞標(biāo)準(zhǔn)品放入20 ml棕色瓶中，用去離子水定容，搖勻得50 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)母液，測定時再用去離子水配制所需濃度的雷替曲塞標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.8標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取50 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以空白血漿配置出5 000 ng/ml、1 000 ng/ml、500 ng/ml、200 ng/ml、100 ng/ml濃度。取C18固相萃取柱，用甲醇4 ml活化兩遍，再用PH3.5磷酸鹽緩沖液4 ml活化，精密吸取1 ml含藥血漿過C18固相萃取柱，用PH3.5磷酸鹽緩沖液2 ml洗去雜質(zhì)，用乙腈-乙酸3 ml萃取，萃取液用試管濃縮儀(50℃水浴)濃縮，用甲醇100 μl溶解，離心10 min，取上清液80 μl，分別進(jìn)樣50 μl。標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍在100-5000 μg/L線性關(guān)系良好，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，本法的檢測限為9 ng。以血漿樣品濃度為橫坐標(biāo)，雷替曲塞的峰面積為縱坐標(biāo)，峰面積(Y)值對血藥濃度(X)做回歸計算。回歸方程：Y=0.0716X-6.7696，r2=0.998 5，n=3。回收率為92.6%-99.3%。

1.9血漿樣品處理同標(biāo)準(zhǔn)溶液方法處置。

2結(jié)果

2.1色譜峰如圖1所示，雷替曲塞的保留時間約為10 min，洗脫液(乙腈-乙酸)和空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾雷替曲塞的測定。

圖1　雷替曲塞的HPLC圖譜　A：雷替曲塞　　　　　　　圖2　雷替曲塞標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2兩組不同濃度給藥動脈下游和回流靜脈的血藥濃度見圖3。本實驗中外周靜脈血未能檢測到雷替曲塞。

2.3用DAS2.0軟件計算雷替曲塞在血漿中的藥代動力學(xué)參數(shù)表1。

圖3　雷替曲塞低濃度/高濃度給藥組髂內(nèi)動脈及髂內(nèi)靜脈內(nèi)血藥濃度

藥動學(xué)參數(shù)單位髂內(nèi)靜脈低濃度組高濃度組髂內(nèi)動脈低濃度組高濃度組AUCμg/L*min8478.9729658.3517136.7564698.5Cmaxμg/L142.81446.01161.50631.50AUC：藥時曲線下面積，Cmax：峰濃度。

3討論

雷替曲塞為治療結(jié)腸癌和直腸癌的一線藥物[7]，主要經(jīng)腎臟排泄[8,9]。靜脈滴注雷替曲塞后常見副作用為血液毒性及消化道反應(yīng)，一般患者耐受性良好[10]。雷替曲塞被組織攝取之后轉(zhuǎn)化為多谷氨酸類化合物，從血液內(nèi)快速清除，造成腫瘤組織攝取不足及全身毒性；為了改變這種狀況，我們利用介入治療的技術(shù)進(jìn)行動脈灌注化療，通過導(dǎo)管到達(dá)腫瘤供血動脈，使藥物直接到達(dá)腫瘤區(qū)域，使盡可能多的藥物直接為腫瘤組織攝取。

本實驗采用接近人體的豬作為實驗對象，按照人體給藥方案3 mg/m2設(shè)定為高濃度組，1/4量設(shè)定為低濃度組；從實驗結(jié)果可以看出，給藥動脈內(nèi)的血藥濃度在給藥期間大致保持穩(wěn)定，給藥結(jié)束后迅速降低，而回流靜脈內(nèi)血藥濃度呈緩慢升高，在動脈給藥結(jié)束后，降低幅度明顯低于動脈，顯示出局部組織對雷替曲塞高攝取及低排泄的特點。

雷替曲塞的IC50長期給藥為1.3-3.9 nmol/L(0.6-1.79 μg/L)，短期給藥為80 nmol/L(36.64 μg/L)，我們實驗的結(jié)果為：低濃度組124.6-161.5 μg/L，高濃度組514.7-631.5 μg/L，且整個給藥期間均維持在這一水平，即使是低濃度組也足以保證臨床用藥要求。本實驗中低濃度組動脈內(nèi)血藥的AUC為285.6 μg/L·h，高濃度組的AUC為1 078.3 μg/L·h；低濃度組靜脈內(nèi)血藥的AUC為141.3 μg/L·h，高濃度組的AUC為494.3 μg/L·h，回流靜脈內(nèi)血藥的AUC均不足動脈內(nèi)血藥AUC的一半，顯示一半的藥物為局部組織攝取并滯留于局部。

采用濃縮法，以及用更低的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以檢測到95 μg/L的濃度，仍舊沒有檢測到外周血內(nèi)的血藥，考慮這與生物體對雷替曲塞的高攝取有關(guān)，由于本實驗給藥時間長，持續(xù)2 h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于靜脈給藥的15 min，且一半以上的藥物為組織攝取，進(jìn)入下游的藥物經(jīng)過肝臟及肺臟攝取及全身血液稀釋后濃度極低。

總之，經(jīng)動脈給予雷替曲塞可以達(dá)到滿意的局部血藥濃度以及極低的外周血藥濃度，這保證了雷替曲塞發(fā)揮其抗腫瘤作用的同時可以明顯減輕全身不良反應(yīng)。

本實驗單純于動物模型中檢測了雷替曲塞動脈持續(xù)灌注化療的藥代動力學(xué)，僅僅檢測了2 h給藥方案，沒有進(jìn)一步的時間分組；此外，該種給藥方式下局部組織的高濃度對局部組織的損傷、高濃度化療藥對腫瘤組織的殺傷作用需要進(jìn)一步的研究。

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關(guān)鍵詞：雷替曲塞；動脈灌注化療；藥代動力學(xué)

Pharmacokinetic study of Raltitrexed under continuing transarterial infusionZHANGXin,ZHULin-zhong,ZHUXu,etal.(KeylaboratoryofCarcinogenesisandTranslationalResearch(MinistryofEducation/Beijing),Interventionaltherapydepartment,PekingUniversityCancerHospital&Institute,Beijing100029,China)

Abstract:ObjectiveTo determine the pharmacokinetics of raltitrexedunder transarterial infusion in administrating artery/veins and peripheral venous,to lay the foundation for clinical application.Methods8 miniature swines were randomly divided into groups of low concentration and a high concentration group,the agent was administrated from proximal of internal iliac artery,and blood samples were draw from distal of internal iliac artery and internal iliac vein,peripheral venous.Blood samples were extracted by solid phase,raltitrexed was analysised by HPLC.ResultsWith the extension of transarterial continuous administration,the plasma concentrations of internal iliac arteries are quickly reached the highest value,and continued with the extension of arterial administration,the peak changed within little range,AUC were 285.6 μg/L*h and 1 078.3 μg/L*h.The peak values was 161.5 μg/L and 631.5 μg/L.With the extension of administrating time,concentration in internal iliac blood were gradually arise,reached the highest value at the end of the administration,the blood concentration decreased rapidly after the intraarterial administration.Peripheral Blood Blood concentration was not detected.ConclusionTransarterial infusion can retain enough high concentration within the local tissue blood and very low peripheral blood concentration,which help to improve local tumor drug concentration while reduce systemic adverse reactions.

Key words:Raltitrexed;arterial infusion;pharmacokinetics

(收稿日期：2015-09-16)

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R969.1

文章編號：1007-4287(2016)01-0008-04

*通訊作者

基金項目：首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項基金(自主創(chuàng)新項目)(2014-2-2154)