臧衛(wèi)軍+高穎慧+向志雄+張樂(lè)多
摘 要 目的:對(duì)比上海新亞藥業(yè)與羅氏制藥生產(chǎn)的兩種注射用頭孢曲松鈉產(chǎn)品(簡(jiǎn)稱為新亞和羅氏芬)在SD大鼠和食蟹猴的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)差異。方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在靜脈注射和肌肉注射后,采用UPLC-MS/MS測(cè)定血漿中頭孢曲松濃度,通過(guò)Kinetica 5.1計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果:靜脈注射后,新亞和羅氏芬在SD大鼠體內(nèi)的AUC0-t分別為483.4±179.5 μg·h/ml、542.4±166.0 μg·h/ml、在食蟹猴體內(nèi)分別為1 703.6±564.4 μg·h/ml、1 811.7±601.7 μg·h/ml。肌肉注射后,新亞和羅氏芬在SD大鼠體內(nèi)的AUC0-t分別為412.6±153.4 μg·h/ml、451.7±147.1 μg·h/ml、在食蟹猴體內(nèi)分別為1 454.9±592.9 μg·h/ml、1 367.3±772.0 μg·h/ml。相對(duì)于羅氏芬,新亞在SD大鼠體內(nèi)靜脈和肌肉注射的相對(duì)生物利用度分別為(89.1±98.6)%、(91.3±55.4)%、在食蟹猴體內(nèi)分別為(94.0±9.6)%、(106.4±103.0)%。結(jié)論:兩種制劑在大鼠和食蟹猴上的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)類似,未見(jiàn)顯著差異。
關(guān)鍵詞 注射用頭孢曲松鈉 藥代動(dòng)力學(xué) 相對(duì)生物利用度
中圖分類號(hào):R978.11; R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1006-1533(2016)21-0070-06
Study on the pharmacokinetics of ceftriaxone sodium for injection and its relative bioavailability in SD rat and cynomolgus monkey
ZANG Weijun*, GAO Yinghui, XIANG Zhixiong, ZHANG Leduo(Central Research Institute, Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd., Shanghai 201203, China)
ABSTRACT Objective: To compare pharmacokinetic properties of two kinds of ceftriaxone sodium which were produced by Shanghai New Asia pharmaceutical and Roche pharmaceuticals (New Asia and Rocephin for short). Methods: SD rats and cynomolgus monkeys were intravenously or intramuscularly injected with one of the two preparations, respectively. Their concentrations in plasma were determined by UPLC-MS/MS. The pharmacokinetic parameters were calculated by Kinetica 5.1. Results: The areas under the curve (AUC0-t) of New Asia and Rocephin were 483.4±179.5 and 542.4±166.0 μg·h/ml in SD rats and 1 703.6±564.4 and 1 811.7±601.7μg·h/ml in cynomolgus monkeys via intravenous injection and 412.6±153.4 and 451.7±147.1 μg·h/ml in SD rats and 1 454.9±592.9 and 1 367.3±772.0 μg·h/ml in cynomolgus monkeys via intramuscular injection, respectively. The relative bioavailability of New Asia was(89.1±98.6)% and (94.0±9.6)% in SD rat and cynomolgus monkeys via intravenous injection and (91.3±55.4)% and (106.4±103.0)% in SD rat and cynomolgus monkeys via intramuscular injection, respectively. Conclusion: The pharmacokinetic properties of both preparations in SD rats and cynomolgus monkeys are similar and the significant differences are not found.
KEY WORDS ceftriaxone sodium for injection; pharmacokinetic; relative bioavailability
注射用頭孢曲松鈉屬于頭孢第三代廣譜抗生素,具有廣譜、高效、長(zhǎng)效及不良反應(yīng)少等特點(diǎn),臨床常用于控制格蘭陰性菌引起的感染[1]。目前國(guó)內(nèi)外有眾多企業(yè)生產(chǎn)該產(chǎn)品,上海新亞藥業(yè)為其中之一。本文研發(fā)了一種應(yīng)用UPLC-MS/MS檢測(cè)頭孢曲松鈉的方法,它具有高靈敏度、高選擇性的特點(diǎn)。運(yùn)用此方法研究了上海新亞藥業(yè)產(chǎn)品(簡(jiǎn)稱新亞)和原研企業(yè)羅氏制藥產(chǎn)品(羅氏芬)在大鼠和食蟹猴體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性,并進(jìn)行等效性分析[2-3],以期為新亞產(chǎn)品的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 儀器
API 4000 QTRAP 型串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst 1.5.1數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó)Applied Biosystem公司);Waters Acquity UPLC系統(tǒng),包括二元輸液泵,自動(dòng)進(jìn)樣器,(美國(guó)Waters公司);Valco 2-Position 型切換閥(美國(guó)Valco Instruments公司)。Thermo-X3R離心機(jī)(德國(guó)Thermo公司)、Eppendorf 熱封儀(美國(guó)Eppendorf公司)。
1.2 藥品與試劑
大鼠藥代動(dòng)力學(xué)注射用頭孢曲松鈉藥品(上海新亞藥業(yè),批號(hào)1411128);原研藥羅氏芬(上海羅氏制藥有限公司,批號(hào)SH1793)。食蟹猴藥代動(dòng)力學(xué)注射用頭孢曲松鈉藥品(上海新亞藥業(yè),批號(hào)1509138);原研藥羅氏芬(上海羅氏制藥有限公司,批號(hào)SH1800)。頭孢曲松鈉標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)130480-200903,含量83.7%)。內(nèi)標(biāo):替硝唑(上海醫(yī)藥合成研究室提供);甲醇(Merck KGaA,色譜純);肝素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20131017);醋酸銨(德國(guó)CNW,色譜純);去離子水(由Milli-Q純水儀制備)。
1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SD大鼠:24只,雌雄各半,180~200 g,生產(chǎn)許可證號(hào):BK-SCXK(滬)2013-0016,動(dòng)物合格證號(hào):2008001655333。來(lái)源:上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。
食蟹猴:12只,雄性,2~4 kg,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK桂2011-0002,動(dòng)物合格證號(hào):0002849。來(lái)源:廣西雄森靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)有限公司。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 溶液配制
1)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液 精密稱取24.75 mg頭孢曲松鈉標(biāo)準(zhǔn)品,置于1 ml離心管中,加水定容至414 μl,配制成濃度為50 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。
2)標(biāo)準(zhǔn)曲線用溶液 取50 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,用水依次稀釋儲(chǔ)備液配制成15 000、13 500、5 000、1 500、500、150、50、10、5 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液1。取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液1各10 μl,加入到190 μl空白血漿中,配制成750,675,250,75,25,7.5,2.5,0.5,0.25 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品[4-7]。
3)質(zhì)控血漿樣品 精密稱取頭孢曲松鈉標(biāo)準(zhǔn)品21.94 mg,置于1 ml離心管中,加水定容至367 μl,配制成濃度為50 mg/ml的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。先用水稀釋成12 000、2 250、5 μg/ml的3個(gè)溶液,然后各取10 μl加入到190μl空白血漿中,配制成600、112.5、0.25 μg/ml的高、中、低濃度質(zhì)控血漿樣品。
1.4.2 給藥劑量和方法
參照羅氏芬產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),將新亞和羅氏芬頭孢曲松鈉分別配制成:①SD大鼠靜脈注射用藥液10 mg/ml,給藥劑量為100 mg/kg、體積為10 ml/kg;②SD大鼠肌肉注射用藥液20 mg/ml,給藥劑量為100 mg/kg、體積為5 ml/kg;③食蟹猴靜脈注射用藥液25mg/ml,給藥劑量為50 mg/kg、體積為2 ml/kg;④食蟹猴肌肉注射用藥液50 mg/ml,給藥劑量為50 mg/kg、體積為1 ml/kg。
1.4.3 實(shí)驗(yàn)方案
SD大鼠24只雌雄各半,分為4組,分別為羅氏芬和新亞靜脈注射組和肌肉注射組,每組3雌3雄。在給藥前,所有動(dòng)物禁食過(guò)夜(10~18 h),給藥后4 h給食。分別于給藥前和給藥后0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12 h于大鼠眼底靜脈叢取血0.4 ml。
健康雄性食蟹猴12只,采用交叉設(shè)計(jì),分別靜脈或肌肉注射新亞產(chǎn)品及羅氏芬,間隔1周后給藥。受試動(dòng)物在試驗(yàn)日前3~7 d應(yīng)在試驗(yàn)場(chǎng)所進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。在給藥前,所有動(dòng)物禁食過(guò)夜(10~18 h),給藥后4 h給食。給藥后0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12 h經(jīng)股靜脈采集血樣1.0 ml。
血樣采集后加入5 mg/ml肝素鈉10 μl抗凝,放置冰上,于4 ℃、4 300×g離心5 min,取血漿至離心管中于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4.4 血漿樣品處理
取血漿樣品50 μl,加入200 μl含內(nèi)標(biāo)(10 ng/ml替硝唑)的甲醇溶液沉淀蛋白。渦旋10 min,6 000×g離心10 min,取上清用起始流動(dòng)相稀釋10倍后于96孔板中進(jìn)樣分析。
1.4.5 樣品測(cè)定方法
色譜條件:BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm,美國(guó)Waters公司);流動(dòng)相A為2 mmol/L醋酸銨水溶液,流動(dòng)相B為甲醇溶液,梯度洗脫程序如下:0→0.5 min 流動(dòng)相A和B 的比例為95∶5,0.5→1.0 min線性變至5∶95,1.0→2.2 min 維持5∶95,2.2→2.5 min 線性恢復(fù)至95∶5,2.5→3 min 保持95∶5。流速0.35 ml/min,進(jìn)樣器溫度4 ℃,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量5 μl。
質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧電離源(Turbo Ionspray,ESI);源噴射電壓為5 500 V;溫度為500 ℃;離子源氣體1(N2)壓力為50 psi;離子源氣體2(N2)壓力為50 psi;氣簾氣體(N2)壓力為20 psi;碰撞氣壓力(CAD)為Medium;掃描時(shí)間為100 ms;正離子方式檢測(cè);掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),監(jiān)測(cè)離子對(duì)m/z 555.2→m/z 396.2(頭孢曲松鈉),m/z 248.1→m/z 121.0(替硝唑);頭孢曲松鈉和替硝唑的去簇電壓(DP)分別為60 V和85 V;碰撞能量(CE)分別為19 V和23 V[8-10]。
2 結(jié)果
2.1 方法學(xué)驗(yàn)證
2.1.1 方法的專屬性
分別取6只大鼠和食蟹猴的空白血漿,除不加內(nèi)標(biāo)外,按1.4.4項(xiàng)下方法處理并分析,得到空白樣品的色譜圖;將一定量的頭孢曲松鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入上述大鼠和食蟹猴空白血漿中,依同法操作,獲得相應(yīng)的色譜圖;同樣方法得到大鼠和食蟹猴給藥后4 h樣品色譜圖(圖1)。結(jié)果表明,大鼠和食蟹猴血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾頭孢曲松鈉及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。
2.1.2 線性關(guān)系
以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)X (ng/ml),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)Y,用加權(quán)(W =1/X2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得大鼠標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=0.040 7X+0.0178(r =0.992 7);食蟹猴標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=0.028 9X+0.002 28(r=0.996 5)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,本法頭孢曲松鈉的線性范圍均為0.25~750 μg/ml,定量下限為0.25 μg/ml。結(jié)果表明,2標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程間斜率相差近一倍,原因可能是大鼠與食蟹猴種屬間存在一定基質(zhì)效應(yīng)。
2.1.3 準(zhǔn)確度與精密度
取SD大鼠和食蟹猴質(zhì)控血漿樣品每個(gè)濃度各6份,并用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)定的質(zhì)控樣品濃度,與配制濃度對(duì)照,求得本法的準(zhǔn)確度和精密度(表1)。結(jié)果表明,它們的RSD均小于12%。
2.2 SD大鼠PK試驗(yàn)結(jié)果
在SD大鼠體內(nèi)靜脈或肌肉注射羅氏芬和新亞產(chǎn)品的藥時(shí)曲線見(jiàn)圖2。采用Kinetica 5.1軟件非房室方法計(jì)算新亞和羅氏芬在大鼠給藥后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù):相對(duì)生物利用度F =受試藥AUC0-t/參比藥AUC0-t×100%。采用配對(duì)t檢驗(yàn),比較新亞和羅氏芬的頭孢曲松鈉藥動(dòng)學(xué)參數(shù)在給藥后的差異,Tmax采用非參數(shù)檢驗(yàn),其他參數(shù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行檢驗(yàn)。
SD大鼠藥藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、AUC0-t、AUC0-∞和t1/2在新亞和羅氏芬間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,表2)。
2.3 食蟹猴PK試驗(yàn)結(jié)果
在食蟹猴體內(nèi)靜脈和肌肉注射羅氏芬或新亞產(chǎn)品的藥時(shí)曲線見(jiàn)圖2。根據(jù)Kinetica 5.1軟件非房室方法計(jì)算新亞和羅氏芬在食蟹猴給藥后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、AUC0~t、AUC0~∞和t1/2在新亞產(chǎn)品和羅氏芬間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,表3)。
3 討論
本研究建立了定量測(cè)定SD大鼠及食蟹猴血漿中頭孢曲松鈉的UPLC-MS/MS方法。分別在ESI源和APCI源下,對(duì)頭孢曲松鈉采用正、負(fù)離子兩種檢測(cè)模式進(jìn)行研究,比較響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),頭孢曲松鈉在兩種離子化源的負(fù)離子掃描方式下,不易裂解,加大裂解能量后,雖然可產(chǎn)生碎片離子,但豐度很低而且不穩(wěn)定,不適合做定量分析。而在正離子模式下,ESI源較APCI源可產(chǎn)生更高的靈敏度和更穩(wěn)定的碎片。因此本研究選擇ESI源,發(fā)現(xiàn)在正離子檢測(cè)模式下質(zhì)核比為396的離子峰豐度最高,而且穩(wěn)定,與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符合[11]。
為了提高分析靈敏度,改善峰形并縮短分析時(shí)間,分別嘗試用甲醇和乙腈作為流動(dòng)相中的有機(jī)相,結(jié)果表明添加甲醇可降低背景噪音,提高待測(cè)物的響應(yīng)度;嘗試了在水相中加入醋酸銨和甲酸溶液對(duì)峰形的影響,發(fā)現(xiàn)加入2 mmol/L醋酸銨可以改善峰形,而加入甲酸溶液后峰形變差;故選用2 mmol/L醋酸銨水溶液作為水相,甲醇溶液作為有機(jī)相。
在大鼠實(shí)驗(yàn)中,將大鼠隨機(jī)分為兩組,采用了配對(duì)t檢驗(yàn)的方式進(jìn)行計(jì)算,但大鼠之間存在一定的個(gè)體差異,因此生物利用度的標(biāo)準(zhǔn)偏差偏大。在食蟹猴實(shí)驗(yàn)中,采用交叉實(shí)驗(yàn),有可能是前后兩次肌肉注射位置存在差異,導(dǎo)致肌肉群的吸收會(huì)存在一定的差異性,因此其最大濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差偏大。
本方法的專屬性好,靈敏度高,符合生物樣品的定量分析要求,分析時(shí)間僅為3 min,可為快速、準(zhǔn)確地測(cè)定生物樣品中頭孢曲松鈉的血藥濃度提供有意義的參考。研究結(jié)果顯示,新亞和羅氏芬頭孢曲松鈉靜脈和肌肉注射給藥后,在SD大鼠和食蟹猴體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)接近,藥時(shí)曲線一致,主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、AUC0~t、AUC0~∞和t1/2未見(jiàn)顯著性差異。相對(duì)于羅氏芬,新亞在SD大鼠體內(nèi)靜脈和肌肉注射的相對(duì)生物利用度分別為(89.1±98.6)%、(91.3±55.4)%、在食蟹猴體內(nèi)分別為(94.0±9.6)%、(106.4±103.0)%。兩制劑在SD大鼠和食蟹猴體內(nèi)生物等效。
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