胡　萍,王　英,金艷玲,楊海燕,許文晶,徐韶琳*

(1.吉林大學第二醫(yī)院，吉林 長春130041；2.北京市延慶縣醫(yī)院，北京 延慶102100)

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甲酸鈉誘導視網(wǎng)膜光感受器細胞凋亡

胡萍1,王英1,金艷玲1,楊海燕2,許文晶1,徐韶琳1*

(1.吉林大學第二醫(yī)院，吉林 長春130041；2.北京市延慶縣醫(yī)院，北京 延慶102100)

摘要：目的甲醇具有選擇性神經(jīng)毒性作用,世界各地因飲用假酒所致甲醇中毒事件時有發(fā)生,甚至有人因此而失明。我們將研究甲酸鈉對視網(wǎng)膜光感受器細胞(661W細胞)的作用。方法將不同濃度的甲酸鈉加入培養(yǎng)基的661W細胞中作用6-24 h，通過MTT法檢測各組細胞相對存活率，然后，將661W細胞暴露于15 mM和30 mM濃度的甲酸鈉中24 h，通過Hoechst 33342/PI染色法在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡，用流式細胞儀檢測細胞凋亡，用Western blotting法檢測Bax，bcl-2，cleaved-caspase-3，cleaved-caspase-9的蛋白活性。結(jié)果MTT結(jié)果顯示:甲酸鈉可以誘導661w細胞濃度和時間依賴性生存率下降；細胞染色、流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：甲酸鈉可以誘導661W細胞發(fā)生凋亡；Western blotting結(jié)果顯示:15 mM和30 mM的甲酸鈉作用661W細胞24 h后，細胞Bax， cleaved-caspase-3，cleaved-caspase-9蛋白表達水平增加，而bcl-2蛋白表達水平降低。結(jié)論甲酸鈉可以誘導光感受器細胞發(fā)生濃度和時間依賴性生存率下降，并且誘導661w細胞發(fā)生caspase依賴性細胞凋亡。

(ChinJLabDiagn,2016,20:0015)

甲醇具有選擇性神經(jīng)毒性作用,飲用假酒可以引起甲醇中毒，而甲醇中毒后常常導致較高的致盲率、致殘率甚至致死率[1]。甲醇的代謝主要在肝臟內(nèi)進行,通過連續(xù)的氧化反應后形成甲酸、甲醛和二氧化碳[2，3]。有研究提出，甲醇中毒后，視網(wǎng)膜發(fā)生的病理生理變化是由于甲酸鹽誘導的線粒體功能障礙所致[4]。甲酸鹽通過抑制細胞色素氧化酶的活性和電子傳遞鏈終端電子受體從而破壞線粒體的電子傳遞和能量產(chǎn)生[5]。甲酸鹽抑制細胞色素氧化酶引起細胞ATP的大量消耗從而降低細胞能量水平并且導致細胞功能的破壞,甚至導致細胞死亡[6]。此外，有研究證實,視網(wǎng)膜和玻璃體中的甲酸鹽濃度水平與血液中的甲酸鹽濃度水平相一致[7]。

有研究報道濃度為5-30 mM的甲酸鹽在體外和體內(nèi)都可以抑制細胞色素氧化酶活性[8]。并且,在甲醇中毒的人類和猴子的血液、玻璃體、腦脊液中都可以檢測到相似濃度的甲酸鹽[9]。不同組織對甲醇中毒的敏感性不同，視網(wǎng)膜由于持續(xù)存在視覺功能和高代謝活動極易因視網(wǎng)膜ATP的消耗而受到影響，但是，由甲醇中毒所致的視網(wǎng)膜病變的具體病理生理機制尚未明確。

本研究檢測甲酸鈉對661W細胞的的作用，從而研究甲醇中毒所致的細胞死亡的分子機制。

1材料與方法

1.1抗體和反應物

多克隆抗體Bax、bcl-2購自美國Santa Cruz公司。cleaved-caspase-9，cleaved-caspase-3的抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。GAPDH購自上海康晨生物技術(shù)公司。超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(ECL-Plus Kit)購自上海碧云天公司。Annexin-V- FLUOS Staining Kit購自德國Roche Diagnostics公司。甲酸鈉購自上?；瘜W試劑國藥控股有限公司。Hoechst33342，碘化丙啶(PI),MTT，購自美國sigma-aldrich公司。

1.2細胞培養(yǎng)

在含有10%的胎牛血清，100 u/ml的青霉素，100 g/ml的鏈霉素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)661W細胞。將含有661W細胞的培養(yǎng)液置于37℃含有95%的空氣和5%的CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中。每3-4 d應用胰蛋白酶消化傳代1次。

1.3661W細胞生存能力分析

661W細胞以5×103接種于96孔板，細胞培養(yǎng)24 h后，將不同濃度的甲酸鈉(0,15,30,60和120 mM)加到培養(yǎng)基中。在對照組的培養(yǎng)基中加入等體積、等濃度的氯化鈉。將平行細胞培養(yǎng)分別孵育6 h，12 h，和24 h。然后每孔加入5 g·L-1MTT20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄培養(yǎng)液，然后每孔加入150 μl的二甲亞礬(DMSO)，振動10 min。采用酶標儀檢測藍色甲在570 nm波長處的吸光度(A570)值。

1.4細胞染色檢測細胞凋亡

用Hoechst33342和PI雙染檢測661W細胞的凋亡。將661W細胞加入15,30 mM濃度甲酸鈉孵育24 h后，用10 μg/ml的Hoechst33342和PI染色30 min。用PBS液洗滌2次后，用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍攝。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡

661w細胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將661W細胞中加入15,30 mM濃度甲酸鈉孵育24 h，細胞用不含EDTA胰酶消化、離心、PBS洗滌兩次。然后將加入PBS(pH 7.4)緩沖液充分混勻，加入5 μl異硫氰酸熒光素(FITC)標記連接素(Annex in)和5 μl 20 mg/L普匹碘氨(PI)?；靹?避光室溫孵育15 min,流式用細胞儀進行分析。

1.6Western blotting法檢測661w細胞中各蛋白的表達水平

661w細胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將661W細胞中加入15,30 mM濃度甲酸鈉孵育24 h。收集細胞，離心，加入裂解液于冰上裂解30 min。細胞懸液在4℃,12 000 r/min離心10 min。在上清液中加入1/4容積的4×SDS樣本液后煮沸5 min。 經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜至聚二氟乙烯膜上，用含有5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入Bax、bcl-2、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9和GAPDH一抗(1∶1 000)，于4℃過夜孵育。用TBST洗滌膜3次后，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育30 min。充分洗滌后，用ECL液化學發(fā)光方法檢測蛋白。

統(tǒng)計分析

應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，差異的檢測是通過對兩組間的t檢驗，或多組間的方差分析得出的。有意義的基準設(shè)定為P<0.05和P<0.01。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測各組細胞生存率

661w細胞與120 mM濃度甲酸鈉作用24 h后的細胞生存率與實驗中其他濃度甲酸鈉(15,30和60 mM)作用后的細胞生存率相比，前者明顯下降。在與對照組進行比較中得出，將661w細胞分別加入15,30 mM濃度甲酸鈉，作用24 h后的細胞生存率分別為78.5%與60.4%。因此，在接下來的試驗中我們使用的是15,30 mM濃度的甲酸鈉。MTT結(jié)果顯示甲酸鈉可以導致661w細胞活性的急性下降，與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。如圖1所示：甲酸鈉可以以時間依賴性和劑量依賴性方式降低細胞生存率。

圖1　MTT法檢測各組細胞生存率， 隨甲酸鈉濃度增加，細胞生存率降低，并且甲酸鈉與細胞作用時間增加，細胞生存率降低

2.2甲酸鈉誘導661w細胞凋亡

用Hoechst33342和PI雙染色檢測甲酸鈉對661w細胞凋亡的作用。如圖2中所示：661w細胞與30 mM濃度的甲酸鈉作用24 h后，可以導致Hoechst陽性細胞和PI陽性細胞增多。表明15,30 mM濃度的甲酸鈉可以導致661w細胞凋亡。

圖2　Hoechst33342和PI雙染色檢測甲酸鈉對661w細胞凋亡的作用，661w細胞與15 mM，30 mM濃度的甲酸鈉作用后，細胞凋亡率增加。A：對照；B：15 mM的甲酸鈉；C：30 mM的甲酸鈉

我們用Annexin V-FI TC/PI雙標記流式細胞分析法檢測661w細胞的凋亡率，將活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞區(qū)分開。將661w細胞與不同濃度(15,30 mM)的甲酸鈉作用24 h后，甲酸鈉作用組與對照組未加入甲酸鈉的661w細胞相比，前者出現(xiàn)大量的早期凋亡與晚期凋亡，早期凋亡百分比由2.88%增至18.43%,晚期凋亡由0.63%增至6.3%。15,30 mM濃度的甲酸鈉組與正常對照組相比661w細胞早期凋亡率顯著增加(P<0.01),總凋亡率亦顯著增加(P<0.05,見圖3)。結(jié)果顯示，甲酸鈉可以誘導661w細胞凋亡。

A：對照；B：15 mM的甲酸鈉；C：30 mM的甲酸鈉

2.3甲酸鈉影響661w細胞內(nèi)Bax與Bcl-2蛋白的表達

已證實Bcl-2蛋白家族在線粒體依賴性凋亡中有重要的作用，我們檢測甲酸鈉對抗凋亡蛋白Bcl-2和前凋亡蛋白Bax表達的影響。如圖4示：將661 w細胞加入15,30 mM甲酸鈉后，細胞內(nèi)的Bcl-2水平明顯下降而Bax水平增加，這表明暴露于甲酸鈉中的661w的Bax/Bcl-2比值增加可能與線粒體依賴性凋亡途徑相關(guān)。

2.4甲酸鈉引起661w細胞內(nèi)半胱天冬酶依賴性凋亡

凋亡是由兩種細胞凋亡蛋白酶引起的，起始凋亡蛋白酶(caspases-2，-8，-9和-10)和效應凋亡蛋白酶(caspases-3，-6和-7)，起始凋亡蛋白酶分裂并激活效應凋亡蛋白酶中不活躍的部分，活化的效應凋亡蛋白酶分裂其他蛋白底物導致凋亡過程的發(fā)生[10]。如圖5示,免疫印跡顯示將細胞予甲酸鈉處理后cleaved-caspase-3水平增加，此外，甲酸鈉使細胞cleaved-caspase-9顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明在661w細胞內(nèi)，甲酸鈉可以誘導661w細胞凋亡，并且凋亡通路至少部分通過凋亡蛋白酶依賴性途徑。

圖4　Western blotting法檢測Bax、bcl-2蛋白水平

圖5　Western blotting法檢測cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白水平

3討論

甲醇是引起急性酒精中毒的一個重要原因。急性酒精中毒的病人會有神經(jīng)系統(tǒng)、視覺、胃腸道的相應癥狀。視力障礙一般表現(xiàn)為輕微畏光，視力模糊，視敏度明顯下降甚至失明。即使患者進行有效的治療，甲醇中毒仍有較高的死亡率[1，11]。

有研究報道,甲醇中毒后,視網(wǎng)膜ATP合酶減少。蛋白質(zhì)學組分析大鼠視網(wǎng)膜發(fā)現(xiàn)甲酸鈉可以引起光感受器細胞內(nèi)的ATP明顯減少[6，12]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)661w細胞中加入甲酸鈉可以使細胞活力急性下降。

細胞內(nèi)的Bax/Bcl-2比值可以調(diào)節(jié)細胞凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過15,30 mM濃度的甲酸鈉處理過的661w細胞內(nèi)的Bcl-2蛋白的表達水平顯著降低而Bax的水平增加。此外，經(jīng)甲酸鈉處理后，661w細胞內(nèi)cleaved-caspase-3與cleaved-caspase-9的水平明顯增加。這些結(jié)果表明，Bax/Bcl-2比值與cleaved-caspase的增加可能與甲酸鈉誘導的線粒體依賴性凋亡途徑相關(guān)。

細胞遭受到輕微的刺激可以通過選擇性去除損傷的線粒體和促進凋亡的線粒體來達到保護作用。然而，重大的刺激可以導致大量的線粒體損傷，這超過了細胞的自救能力，使細胞ATP的產(chǎn)生大量減少，并釋放細胞色素C，最終導致光感受細胞的凋亡。因此，甲酸鈉引起661w細胞線粒體功能障礙甚至細胞凋亡的發(fā)生。

很多研究認為，多種視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機制存在著視網(wǎng)膜能量代謝障礙和氧化應激能力的下降，如年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病變等，甲酸鈉誘導661w細胞的功能障礙的研究可能會為其他獲得性或者遺傳性視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機制的研究提供有價值的依據(jù)。

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關(guān)鍵詞：甲醇中毒；甲酸鈉；凋亡；661W細胞

Sodium formate induces photoreceptor cells apoptosisHUPing,WANGYing,JINYan-ling,etal.(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

Abstract:ObjectiveMethanol intoxicated accidents caused by drinking fake wine take place now and then in the world.Some people become blindness due to methanol selective neurotoxicity.This study was to investigate the effects of sodium formate exposure on photoreceptor cells (661W cells).Methods661W cells were exposed to dfferent concentrations of sodium formate for 6-24 h.The cell viability was determined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assays.Then,661W cells were exposed to 15mM and 30 mM sodium formate for 24 h.Apoptosis was determined by Hoechst 33342/propidium iodide (PI) staining,visualized under a fluorescence microscope,and annexin V-FITC staining using flow cytometry.The activation of Bax,Bcl-2,cleaved-caspase-3 and cleaved-caspase-9,was evaluated by western blotting.ResultsMTT assay showed that,sodium formate treatment induced a decrease in 661W cell viability in a time- and dose-dependent manner；DCFH-DA staining and flow cytometry showed that ,sdium formate induces 661W cells apoptosis.Western blotting showed that,661W cells exposed to sodium formate for 24 h increased levels of Bax,cleaved-caspase-3 and cleaved-caspase-9,but decreased levels of Bcl-2.ConclusionThese results suggest that sodium formate treatment reduced the cell viability in a time- and dose-dependent manner and triggers caspase-dependent apoptosis of 661W cells.

Key words:methanol intoxication;sodium formate;apoptosis;661W cells

(收稿日期：2015-03-20)

作者簡介：胡萍(1990-),女，在讀醫(yī)學碩士，主要從事青光眼及視神經(jīng)疾病方面的研究。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R774.1

文章編號：1007-4287(2016)01-0015-05

*通訊作者