劉群++吳然+呂超+張衛(wèi)東+柳潤輝

[摘要]麝香保心丸（SBP）是治療冠心病的經(jīng)典復(fù)方，其中人參皂苷類化合物是其發(fā)揮藥效的主要成分之一。該文采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS）的方法，研究心梗大鼠多次灌胃麝香保心丸、人參提取物（GE）及5種人參皂苷類單體化合物后人參皂苷類化合物的藥代動(dòng)力學(xué)特性。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷類化合物總體吸收較差，各組Cmax均小于200 μg·L-1。比較各組分析物的Tmax發(fā)現(xiàn)人參提取物組和麝香保心丸組中人參皂苷類化合物均比各單一化合物組吸收快，提示人參提取物及復(fù)方中均存在促進(jìn)人參皂苷成分吸收的成分。麝香保心丸組中的各人參皂苷成分的給藥劑量在所有給藥組中最小，但相應(yīng)的AUC0t和AUCINF數(shù)值最大，表明配伍后麝香保心丸中人參皂苷類成分吸收最好，說明復(fù)方是中醫(yī)藥用的最佳形式。

[關(guān)鍵詞]麝香保心丸； 人參提取物； 人參皂苷類； 心肌梗死； 藥代動(dòng)力學(xué)

麝香保心丸（SBP）源于南宋《太平惠民和劑局方》中收載的蘇合香丸，由麝香、蟾酥、人參提取物、蘇合香、牛黃、肉桂、冰片組成，具有芳香溫通、益氣強(qiáng)心之功效。近40年來，麝香保心丸廣泛應(yīng)用于臨床治療冠心病、心絞痛及心肌梗死等疾病[12]，療效顯著。現(xiàn)代藥理研究表明麝香保心丸具有舒張血管[3]、穩(wěn)定易損斑塊[4]、縮小心肌梗死面積[5]、抑制血管鈣化[6]和促進(jìn)血管新生[7]等作用。為了闡釋麝香保心丸組方的科學(xué)內(nèi)涵，自上市以來對其進(jìn)行藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制方面的研究從未間斷。本課題組前期采用現(xiàn)代分離分析手段結(jié)合血清藥化的方法對麝香保心丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了全面研究[89]，進(jìn)一步采用藥理學(xué)及代謝組學(xué)方法對其作用機(jī)制進(jìn)行了研究[1013]。

近年來，中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究在闡釋中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制方面的應(yīng)用越來越廣泛。中藥藥代動(dòng)力學(xué)是利用動(dòng)力學(xué)原理與處理方法，定量地描述中藥有效成分、有效部位、單味中藥和復(fù)方中藥通過各種途徑進(jìn)入機(jī)體后吸收、分布、代謝和排泄等過程的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，在闡明中藥作用機(jī)制及其科學(xué)內(nèi)涵、設(shè)計(jì)及優(yōu)選給藥方案、促進(jìn)新藥研發(fā)和劑型改進(jìn)等方面起著重大作用[14]。目前，課題組已對麝香保心丸中的主要藥效成分人參皂苷類[1516]、蟾蜍甾體二烯類[17]以及揮發(fā)性成分（異龍腦、龍腦、麝香酮和肉桂醛）[18]在正常大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。眾所周知，藥物最終用于病人治療疾病，因此研究疾病狀態(tài)下的中藥藥代動(dòng)力學(xué)更有意義，且與臨床更相關(guān)[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠心肌梗死后胃腸功能[20]、內(nèi)分泌水平[21]及血漿纖維蛋白含量[22]均會(huì)發(fā)生改變，這些由心功能受損引起血流動(dòng)力學(xué)的變化和病理變化都可導(dǎo)致藥物血漿藥動(dòng)學(xué)和組織分布的改變，影響藥物的體內(nèi)過程。因此本文對麝香保心丸中人參皂苷類成分在心肌梗死模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了研究。

本文在前期血清藥化及藥代動(dòng)力學(xué)研究的基礎(chǔ)上選取5種人參皂苷類化合物（Rg1，Re，Rb3，Rc，Rb1）作為目標(biāo)分析物，比較分析心肌梗死大鼠分別多次灌胃5種人參皂苷類單體化合物、人參提取物（GE）和麝香保心丸后5種人參皂苷類化合物的藥代動(dòng)力學(xué)特性差異，探討麝香保心丸中人參皂苷類成分在病理狀態(tài)下的體內(nèi)代謝過程，為闡釋麝香保心丸的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1材料

11儀器及試劑安捷倫1200系列高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent Technologies，USA）；G6410B三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測器，ESI離子源（Agilent Technologies，USA）；MassHunter軟件采集和處理數(shù)據(jù)（B0301版本，Agilent Technologies，USA）。人參皂苷Rg1，Re，Rb3，Rc，Rb1及地高辛（內(nèi)標(biāo)，IS）對照品均購自上海鼎瑞化工有限公司（中國上海），純度>98%。待測化合物及內(nèi)標(biāo)的結(jié)構(gòu)，見圖1。人參提取物（批號(hào)150412）和麝香保心丸制劑（批號(hào)150603）由上海和黃藥業(yè)（中國上海）提供。乙腈為質(zhì)譜純，購自Merck公司（Germany）；甲醇和甲酸分別購自百靈威科技有限公司（中國北京）；SigmaAldrich公司（USA），均為色譜級(jí)；其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)中所用的超純水是由Milli Q50 SP純水系統(tǒng)制備。

解于10 mL量瓶，超聲提取30 min，14 000 r·min-1離心10 min，取上清液。022 μm微孔濾膜過濾，得供試液。分別配制麝香保心丸和人參提取物樣品3份，采用LCMS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析，進(jìn)樣體積為10 μL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，并取平均濃度。最后測得Rg1，Re，Rb3，Rb1，Rc在麝香保心丸中質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為247，251，423，671，268 mg·g-1；在人參提取物中質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1001，1074，1719，2648，1218 mg·g-1。

24血漿樣品制備采用液液萃取法，取100 μL血漿樣品置于15 mL離心管中，加入1 mL正丁醇（含內(nèi)標(biāo)地高辛25 μg·L-1）。將此混合物渦旋10 min，14 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，45 ℃ N2流下?lián)]干，50 μL甲醇復(fù)溶，渦旋10 min，14 000 r·min-14 ℃下離心10 min，取上清液，即得樣品溶液。10 μL樣品溶液進(jìn)LCMS/MS系統(tǒng)分析。

25給藥及采血實(shí)驗(yàn)前所有心梗大鼠禁食12 h，可自由飲水。給藥后4 h即可飲水。分別稱取麝香保心丸細(xì)粉，人參皂苷提取物細(xì)粉，Rg1，Re，Rb3，Rb1和Rc，用05%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）水溶液配制成混懸液。42只心梗大鼠隨機(jī)分組后，分別灌胃7種藥物，包括麝香保心丸組（180 mg kg-1·d-1，n=6），人參皂苷提取物組（80 mg·kg-1·d-1，n=6），Rg1組、Re組、Rb3組、Rc組、Rb1組給藥劑量與樣本數(shù)均相同（40 mg·kg-1·d-1，n=6）。所有大鼠稱重，連續(xù)灌胃5 d。第5天灌胃后，分別在5，15，30，45 min，1，15，2，4，6，8，10，24 h眼眶靜脈取血，每次采血量約250 μL，采集的樣品收集在預(yù)先涂有肝素鈉的15 mL 離心管中。所有樣本立即在4 ℃，3 500 r·min-1下離心10 min，取上清液，血漿樣品保存在-20 ℃冰箱中待分析。

3結(jié)果

31色譜行為及專一性地高辛（IS），Rg1，Re，Rb3，Rc，Rb1相應(yīng)用于定量的transitions分別為m/z 7794/4752，8452/6371，9455/188，1 0775/1488，1 0777/1907，1 1073/1188。空白大鼠血漿、空白血漿添加各待測物及內(nèi)標(biāo)所得的最低定量限（LLOQ）處的血漿樣品及大鼠灌胃麝香保心丸后實(shí)際的血漿樣本，得到的典型MRM色譜圖，見圖2。IS，GRg1，GRe，GRb3，GRc，GRb1的保留時(shí)間分別為339，537，533，696，668，653 min。各待測物及內(nèi)標(biāo)無明顯干擾，該方法選擇性良好，見圖3。

32血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線通過分析標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，每一濃度平行5份。每條標(biāo)準(zhǔn)曲線是由6個(gè)非零濃度點(diǎn)組成。橫坐標(biāo)為待測物的血

4討論

本文應(yīng)用LCMS/MS分析了心肌梗死大鼠連續(xù)5 d灌胃麝香保心丸、人參提取物及單體化合物后各時(shí)間點(diǎn)的5種人參皂苷化合物的血藥濃度，并計(jì)算其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和時(shí)間平均血藥濃度曲線。

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax反映了藥物在血漿中的最大濃度，所有給藥組中人參皂苷的Cmax均小于200 μg·L-1，說明人參皂苷類化合物灌胃給藥吸收較差，可能是由于人參皂苷類化合物在吸收過程中被胃酸破壞、腸道菌降解、腸壁吸收差及肝首過作用所致[2425]。各人參皂苷化合物在麝香保心丸組和人參提取物組的Cmax均大于相應(yīng)的單體化合物給藥組，且麝香保心丸組Cmax高于人參提取物組。血漿蛋白結(jié)合率為藥代動(dòng)力學(xué)重要參數(shù)之一，對血漿蛋白結(jié)合率的協(xié)同作用可以影響到藥物游離體的血漿濃度，文獻(xiàn)報(bào)道，人參皂苷Rg1與Rb1合并應(yīng)用氯吡格雷后二者血漿蛋白結(jié)合率均下降約10%，使得游離皂苷濃度增加[26]。中藥復(fù)方及中藥提取物中均含有多種成分，因此服用中藥制劑相當(dāng)于藥物聯(lián)合應(yīng)用。麝香保心丸及人參皂苷提取物中可能含有一些成分，可與人參皂苷類成分競爭性結(jié)合血漿蛋白，導(dǎo)致其Cmax升高。心肌缺血后藥物可以透過受損血管更多地分布于缺血區(qū)，同時(shí)，由于缺血區(qū)血流減少，使得透過藥物在缺血區(qū)的滯留時(shí)間延長。這種因缺血導(dǎo)致的心肌區(qū)藥物分布變化稱為透過增強(qiáng)與滯留效應(yīng)，是目前普遍認(rèn)同的心肌缺血區(qū)被動(dòng)靶向的主要機(jī)制[27]。正常大鼠灌胃相近劑量的5種人參皂苷單體化合物后Cmax為1996 ～7014 μg·L-1 [2831]，大于模型動(dòng)物灌胃相應(yīng)的單體人參皂苷化合物的Cmax，提示在心肌缺血模型大鼠體內(nèi)，人參皂苷類化合物可能存在心肌缺血區(qū)被動(dòng)靶向的現(xiàn)象，使得心肌缺血區(qū)藥物分布多，而血藥濃度較低。

心梗大鼠灌胃全方、提取物和人參皂苷類單體化合物后，各組Rb1和Re藥時(shí)曲線均有雙峰現(xiàn)象，這與正常大鼠的相關(guān)報(bào)道一致[2829]。藥物的雙峰現(xiàn)象通常由肝腸循環(huán)、成分間轉(zhuǎn)化或藥物再分布導(dǎo)致。文獻(xiàn)報(bào)道人參皂苷Rd在大鼠體內(nèi)經(jīng)代謝可生成Rb1[32]；同時(shí)，人參皂苷Rb1在空腸的吸收量、吸收速率及累積吸收率，較回腸和十二指腸顯著提高[33]，提示人參皂苷Rb1的雙峰現(xiàn)象可能由人參皂苷Rd轉(zhuǎn)化及其自身在不同腸斷吸收不同導(dǎo)致。

Tmax反映了藥物達(dá)到最大血藥濃度所需要的時(shí)間。比較各組相應(yīng)分析物的Tmax發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸組及人參皂苷提取物組中5種人參皂苷與相應(yīng)的單體化合物組相比較小，且麝香保心丸組中人參皂苷的Tmax小于人參提取物組，說明提取物組和麝香保心丸組中人參皂苷均比各單一化合物吸收快，提示不僅各人參皂苷類化合物可以互相促進(jìn)吸收速率，而且復(fù)方中的其他成分對人參皂苷的吸收速率具有促進(jìn)作用。

所有給藥組的T1/2和MRT均較長，可能由于人參皂苷類化合物的膽汁及腎臟的排泄率低、腸道排泄慢、血漿蛋白結(jié)合率高導(dǎo)致[24，34]。比較各組相應(yīng)分析物的T1/2和MRT發(fā)現(xiàn)，麝香保心丸組中各分析物的T1/2最大，說明復(fù)方配伍后5種人參皂苷在體內(nèi)起效時(shí)間可能會(huì)延長。正常大鼠灌胃麝香保心丸后5種人參皂苷成分的T1/2在2053～3634 h[16]，大于其灌胃于心梗大鼠后各分析物相應(yīng)的T1/2，可能由于心梗大鼠較正常大鼠小腸推進(jìn)率增加導(dǎo)致[35]。

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)AUC和AUCINF是評價(jià)藥物吸收程度的重要指標(biāo)，反映藥物在體內(nèi)的暴露特性。正常大鼠灌胃相近給藥濃度的5種人參皂苷單體化合物后AUC和AUCINF分別為13 3637～63 5000，14 9909 ～ 66 8000 μg·L-1·h[2831]，遠(yuǎn)大于心梗大鼠灌胃各單體化合物的AUC和AUCINF，提示正常大鼠對于這5種人參皂苷類化合物吸收優(yōu)于心梗大鼠。該現(xiàn)象可能由于大鼠心梗后胃排空減慢[20]、血漿中纖維蛋白含量增加[22]及小腸推進(jìn)率增加[35]導(dǎo)致。在各給藥組中，麝香保心丸組中的各人參皂苷成分的給藥劑量均最小，但其對應(yīng)的AUC0t和AUCINF的數(shù)值最大，人參提取物組中各人參皂苷的AUC0t和AUCINF其次，結(jié)果說明人參皂苷提取物中存在促進(jìn)人參皂苷單體吸收的成分，同時(shí)全方中其他配伍組分也能促進(jìn)人參皂苷成分的吸收，與之前的研究結(jié)果一致[36]。通過藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較可以發(fā)現(xiàn)，中藥有效成分在配伍后的復(fù)方中發(fā)揮藥效的能力最強(qiáng)，體現(xiàn)了中藥復(fù)方配伍的科學(xué)性，由此說明復(fù)方是中醫(yī)用藥的最佳形式。

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[責(zé)任編輯曹陽陽]