孫小年　胡丹妮　盧雪琳　王江濤　李晶

摘要：目的：分析S100-A8在乳腺癌表達及與乳腺癌臨床病理和生存狀況的關(guān)系。方法：用免疫組織化學(xué)方法檢測S100-A8蛋白在乳腺良性疾病（n=15）及乳腺癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（n=83）及109例有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌和配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達，進行Kaplan-Meier生存分析和Cox回歸分析。結(jié)果：S100-A8蛋白在乳腺癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶之間存在差異表達，原發(fā)癌組織和配對的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Kaplan-Meier生存分析和Cox回歸模型提示組織學(xué)分級和淋巴結(jié)狀態(tài)是乳腺癌的危險因素。結(jié)論：S100-A8蛋白與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并與ER表達水平和組織學(xué)類型有關(guān)。

關(guān)鍵詞：乳腺癌；S100-A8；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；免疫組化方法

中圖分類號：R737.9 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-2409（2016）05-0036-04

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤和女性癌癥死亡的第二大原因。乳腺癌在西方國家發(fā)病率和病死率高，而其發(fā)病率在發(fā)展中國家呈上升趨勢。S100家族蛋白是脊椎動物特有的分子量為10～20 kDa的小酸性蛋白質(zhì)，可以與鈣離子以同型二聚體或低聚物形式結(jié)合。許多研究已經(jīng)描述了這些蛋白質(zhì)與炎癥和癌癥的關(guān)系。至少有16個編碼S100家族成員的基因，包括S100-A8基因，聚集在人類染色體lq21，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中這個區(qū)域經(jīng)常出現(xiàn)染色體重排，并與腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)。筆者對S100-A8在乳腺癌中的表達及臨床病理學(xué)意義進行了初步研究?，F(xiàn)報告如下。

1資料與方法

1.1病例資料

選擇1996年5月至2008年5月在湖南省腫瘤醫(yī)院就診207例女性乳腺疾病患者的石蠟組織樣本。其中15例診斷為乳腺良性疾病包括乳腺纖維囊性改變、不典型增生和纖維腺瘤，83例診斷為無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌，109例有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌和配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。所有乳腺癌患者均經(jīng)湖南省腫瘤醫(yī)院病理確診，術(shù)前均未接受放療或化療。原發(fā)性腫瘤患者的平均年齡為45歲（30～73歲），平均總生存時間約為80.07個月。組織標(biāo)本用10%甲醛固定液，石蠟包埋，4μm厚切片。所有病理切片均由湖南腫瘤醫(yī)院病理科兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)生觀察，均為浸潤性導(dǎo)管癌和浸潤性小葉癌。分為4組檢測S100-A8蛋白的表達：①乳腺良性疾?。˙BD）。②無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌原發(fā)灶（NMBT）。③有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌原發(fā)灶（PBT）。④配對的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶（PMLN）。

1.2試劑

兔單克隆免疫球蛋白（IgG）抗體S100-A8購自Abcam公司（英國）。檸檬酸抗原修復(fù)液（粉）（0.01M，pH：6，mvs-0066），0.01M PBS（pH：7.2～7.4）。DAB顯色試劑盒（聚合物kit-0015）和Elivision^TMplus Polyer HRP試劑盒（大鼠和家兔）kit-9902（邁新生物技術(shù)產(chǎn)品，福建）。家用微波爐（格蘭仕）對微波抗原修復(fù)。

1.3免疫組化方法

石蠟切片在烤箱烤60℃ 2 h，然后依次在二甲苯中脫蠟、梯度乙醇洗滌、流水清洗，檸檬酸抗原修復(fù)液中微波修復(fù)20 min。3%過氧化氫孵育15 min，非免疫血清封閉。滴加S100-A8抗體（1：200）4℃過夜。孵育鏈霉親和素一過氧化物酶15 min，然后過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育15 min后，DAB顯色。

1.4免疫組化染色結(jié)果評分

免疫組化染色結(jié)果判斷由兩位高年資病理醫(yī)生進行，將結(jié)果進行比對，對不一致的結(jié)果將重驗并達到一致?？偟拿庖呓M化染色評分（total immuno-staining score，TIS）綜合染色比例和強度進行。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用Wilcoson signed-rank檢驗和MeNemar檢驗分析S100-A8各組乳腺病變中的表達差異。使用X²檢驗分析S100-A8表達與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系。Kaplan-Meier法分析S100-A8陽性和陰性乳腺癌患者的生存狀態(tài)，Multivariat Cox風(fēng)險分析$100-A8在乳腺癌預(yù)后中的作用。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 S100-A8在各組乳腺病變組織中表達

免疫組化結(jié)果顯示S100-A8陽性著色位于細胞質(zhì)。陽性表達率在BBD、NMBT、PBT、PMLN分別為13.3%（2/15）、37.3%（31/83）、34.9%（38/109）、18.3%（20/109）。NMBT、PBT陽性表達率均明顯高于PMLN、BBD（P<0.01），BBD和PMLN，NMBT和PBT之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見圖1～2。

2.2 S100-A8蛋白表達與臨床病理特征之間的相關(guān)性

S100-A8與組織學(xué)類型、雌激素受體（ER）的表達顯著相關(guān)。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的S100-A8陽性率較浸潤性小葉癌，ER陰性乳腺癌的S100-A8陽性率較ER陽性乳腺癌更高。詳見表1。

此外，Kaplan-Meier分析（圖3）表明，蛋白S100-A8陽性乳腺癌病例可能有更好的生存狀態(tài)，但目前的研究顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.094）。此外，Cox回歸分析結(jié)果顯示組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與乳腺癌總生存率的預(yù)后相關(guān)。詳見表2。

3討論

乳腺癌是一種系統(tǒng)性疾病，100%～15%乳腺癌患者在3年內(nèi)有侵襲性疾病和發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的原發(fā)腫瘤，轉(zhuǎn)移仍是乳腺癌總生存率的重要危險因素，因此，必須明確乳腺癌的轉(zhuǎn)移機制。區(qū)域性腋窩淋巴結(jié)總是首先受累的轉(zhuǎn)移。在Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者中保乳手術(shù)的復(fù)發(fā)率是根治術(shù)的2.8倍，淋巴結(jié)復(fù)發(fā)在保守治療中高兩倍多。精確有效的腋窩淋巴結(jié)狀況評價是乳腺癌患者預(yù)后判斷的重要方法。

本研究結(jié)果提示S100-A8與乳腺癌區(qū)域腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與乳腺癌總體生存率無顯著相關(guān)性。S100-A8陽性表達率偏低可能是其中的原因，需要增大樣本數(shù)量進一步研究。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)該蛋白表達與雌激素受體（ER）水平有關(guān)，可能是ER相關(guān)作用過程中的一個效應(yīng)分子。而它在浸潤性導(dǎo)管癌和小葉癌中表達的差異沒有過類似報道，還有待進一步研究確定其意義。本組乳腺癌病例Cox回歸分析顯示組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與乳腺癌總生存率的預(yù)后相關(guān)，雖然S100-A8陽性表達與總生存期差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但鑒于其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的顯著相關(guān)性，故其仍可能與乳腺癌預(yù)后有關(guān)。

S100-A8也稱為粒細胞相關(guān)蛋白8，有報道這種小細胞內(nèi)鈣結(jié)合蛋白可被分泌以及在前列腺癌細胞外間質(zhì)中表達。S100-A8蛋白在多種腫瘤如食管鱗癌和喉癌參與細胞周期、分化、趨化作用和炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。此外，蛋白質(zhì)S100-A8是NF-KB信號通路的新成員。Fu等發(fā)現(xiàn)S100-A8通過NF-KB信號通路與人類白細胞抗原（HLA-B）相互作用參與喉癌的發(fā)生發(fā)展。另有研究表明，鋅可以通過激活和抑制蛋白S100 A8-rage互動和下游NF信號促進和拮抗腫瘤發(fā)生。

綜上所述，蛋白S100-A8是預(yù)測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個潛在的生物標(biāo)志物。目前關(guān)于該蛋白在惡性腫瘤中功能的研究報道不多，本研究只是對其臨床病理學(xué)意義進行初步研究，還需進一步深入研究S100-A8蛋白如何參與乳腺癌轉(zhuǎn)移過程。