林文遠　朱春江　劉馮　陳蓓莉　農(nóng)慶偉　吳賢義

摘要：目的：探討鹽酸普魯卡因?qū)w外培養(yǎng)的人白血病HL-60細胞ID4基因甲基化狀態(tài)的影響。方法：體外培養(yǎng)HL-60細胞，使用不同濃度（2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L）的普魯卡因處理細胞，分別采用MS-HRM、RT-PCR法檢測HL-60細胞ID4基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)和ID4mRNA的表達。結果：HL-60細胞ID4基因在普魯卡因作用下呈現(xiàn)明顯的去甲基化狀態(tài)，ID4mRNA表達明顯增加，且以上改變均隨藥物濃度的增加而增強（P<0.05）。結論：鹽酸普魯卡因?qū)L-60細胞的ID4基因啟動子區(qū)域有去甲基化作用，上調(diào)細胞ID4 mRNA的表達。

關鍵詞：鹽酸普魯卡因；ID4基因；甲基化；HL-60細胞

中圖分類號：R733.7 文獻標志碼：A 文章編號：1008-2409（2016）05-0012-05

白血病是一類造血干細胞來源的惡性克隆性血液系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機制尚不十分明確。研究認為DNA異常甲基化是血液系統(tǒng)惡性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一，尤以抑癌基因的高甲基化最為重要。DNA結合抑制因子4（inhibitor of DNA binding，ID4）是一種新型的抑癌基因，其啟動子區(qū)域異常甲基化可致使該基因的表達沉默，并失去其抑癌作用，從而導致白血病的發(fā)生。鹽酸普魯卡因作為一種非核苷類去甲基化藥物，能夠使已發(fā)生甲基化的CPG島去甲基化，從而使沉默的抑癌基因重新表達，抑制腫瘤細胞增殖，促使其凋亡，進而達到治療腫瘤的目的。本研究主要是體外觀察鹽酸普魯卡因在不同濃度時人類白血病HL-60細胞ID4基因的甲基化狀態(tài)及ID4 mRNA表達的變化，探討普魯卡因?qū)L-60細胞ID4基因甲基化狀態(tài)的影響，為急性白血病的去甲基化治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1主要材料及來源

人類白血病HL-60細胞株購自中國科學院上海細胞庫；IMDM培養(yǎng)基為Gibco公司；CCK8試劑盒購自日本同仁化學社；倒置熒光顯微鏡為Nikon公司；全波長酶標儀為美國MD Company；引物由杭州赫貝生物技術有限公司合成；EpiTect Bisulfite kit（48）Cat.no-59104購自QiaGen公司；MS-HRM檢測試劑SsoFast Eva Green Supermix購自Bio-Rad公司；定量PCR儀為CFX connect Real-Time PCRSystem，配套使用的分析軟件為BIO-RAD CFXManager（用于qPCR分析）及Precision Melt Analysis（用于HRM分析）；動物總RNA快速提取試劑盒購自Generay公司；逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司；qPCR試劑SuperReal Premix Plus（with SYBR Green I）購自TIANGEN公司；PVDF膜為Millipore公司；ECL Plus發(fā)光試劑盒購自碧云天公司；ID4 antibody購于Santa Cruz公司；GAPDH antibody購于Bioworld公司。

1.2細胞培養(yǎng)與用藥分組

HL-60細胞株置于IMDM培養(yǎng)基（含20%胎牛血清），在37℃、5%CO₂、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)。使用普魯卡因2，4，6mmol/L處理細胞，并設0mmol/L為空白對照組。

1.3甲基化敏感性高分辨率溶解曲線分析法（MS-HRM）

分別提取普魯卡因處理前及處理48 h后各組細胞DNA，Merinton SMA4000檢測DNA濃度，按EpiTect Bisulfite kit（Cat.no-59104）說明書進行DNA的亞硫酸鹽修飾及純化，以純化后的DNA為模板進行PCR擴增反應，上游引物：5′GATYATATTTTGGATTTGTAGTTGG3′，下游引物：5′CpG 196R：AAAAAACTATCATFCCTAACCC3′，PCR反應體系：SsoFast Eva Green Supermix 10μl、上下游引物各1μl（10μmol）、雙蒸水6μl、DNA模板1μl。反應條件：95.0℃預變性5 min，95.0℃10 s、59.0℃15 s、72.0℃20 s，進行40個循環(huán)，72.0℃延伸10 min。使用Precision Melt Analysis分析軟件檢測各組ID4甲基化程度。

1.4 RT-PCR法檢測ID4 mRNA表達

Trizol一步法分別提取普魯卡因處理前和處理48 h后各組細胞RNA，分光光度計檢測其濃度及純度，將RNA逆轉錄形成cDNA后進行PCR擴增，用GAPDH進行校正。ID4上游引物：5′CTGTGCCTGCAGTGCGATA3′，下游引物：5′CAGGTCCAGGATGTAGTCGATAA3′，目的產(chǎn)物大小為129 bp；GAPDH上游引物：5′AGAAGGCTGGGGCTCATITG3′，下游引物：5′AGGGGCCATCCACAGTCTTC3′，目的產(chǎn)物大小為258 bp。反應體系：SuperReal Premix Plus10μl、上下游引物各1μl（10 μmol）、cDNA模板8μl。反應條件：95.0℃預變性15 min，95.0℃10 s，60.0℃15 s，72.0℃20 s，45個循環(huán)，最后72.0℃延伸10 min。使用熒光定量PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager進行統(tǒng)計和計算。

1.5統(tǒng)計學方法

使用SPSS 13.0軟件分析處理數(shù)據(jù)，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1普魯卡因?qū)L-60細胞ID4基因甲基化狀態(tài)的影響

用100%和0%的甲基化標準品做MS-HRM分析，所檢測ID4樣本的曲線越靠近100%說明甲基化程度越高，相反越靠近0%說明甲基化程度越低。在普魯卡因處理前，HL-60細胞ID4基因處于完全甲基化狀態(tài)。在經(jīng)普魯卡因處理后，細胞ID4基因呈現(xiàn)去甲基化狀態(tài)，去甲基化程度隨著藥物濃度不斷增大而增加，圖1中2 mmol/L組多在1區(qū)范圍，4 mmol/L及6 mmol/L組多在2區(qū)及3區(qū)范圍，去甲基化程度均明顯強于前者。詳見圖1。

2.2普魯卡因?qū)L-60細胞ID4基因mRNA及蛋白表達的影響

HL-60細胞經(jīng)普魯卡因處理48 h后，細胞ID4基因mRNA及蛋白的表達量均較對照組明顯增加，且兩者的表達量均隨藥物濃度的增大而不斷增加，各濃度組之間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。詳見表1。

3討論

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾，指在DNA甲基轉移酶的作用下，以s腺苷甲硫氨酸為供體將甲基轉移到胞嘧啶第5位碳原子上的過程。它在基因表達、基因組印記、X染色體滅活及維持染色體完整性等多種生物學過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，DNA的異常甲基化可導致癌基因的激活和抑癌基因的沉默，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。近年來，DNA甲基化尤其抑癌基因啟動子區(qū)域的高甲基化的研究在白血病的發(fā)生發(fā)展、診斷、病情預測和指導治療等方面都具有重要意義。

人類ID4基因位于6p21.3-p22號染色體上，其編碼的ID4蛋白屬于螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix，HLH）轉錄因子的成員，因其缺乏富含堿性氨基酸的DNA結合域，本身并不能與DNA結合，但它可以通過與堿性HLH（bHLH）蛋白形成異二聚體而抑制其與DNA的結合，是bHLH轉錄因子的負性調(diào)節(jié)物。bHLH的高表達可促進干細胞向終末細胞分化，低表達則抑制干細胞分化使其處于持續(xù)增殖狀態(tài)。ID4基因廣泛表達于人體正常組織細胞中，并參與細胞增殖、分化的調(diào)控。ID4在不同來源、不同性質(zhì)的腫瘤組織中表達程度不同，既可作為癌基因，又可作為抑癌基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤及卵巢癌中的ID4基因呈現(xiàn)高表達，其能夠抑制細胞分化、促進細胞增殖，對腫瘤的形成起促進作用；而在大部分血液系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等腫瘤中，ID4基因卻表現(xiàn)為抑癌作用。在人類急性白血病細胞中普遍存在ID4基因啟動子區(qū)域的甲基化，檢測ID4基因的甲基化狀態(tài)有助于評估急性白血病預后及復發(fā)。于力等研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠白血病模型中，ID4基因啟動子區(qū)域的DNA呈現(xiàn)出高甲基化的狀態(tài)并導致基因表達沉默，而在正常小鼠的骨髓細胞中該基因處于非甲基化狀態(tài)。應用逆轉錄病毒將ID4基因的蛋白編碼序列轉入小鼠白血病T細胞惡性腫瘤細胞系YAC-1后，在體外細胞培養(yǎng)及在免疫缺陷鼠皮下接種，均發(fā)現(xiàn)白血病細胞ID4基因表達增加，并出現(xiàn)了腫瘤細胞生長受抑和凋亡增加，因此，首次提出了ID4是一種新型的抑癌基因。

由于DNA甲基化并未改變DNA序列及遺傳密碼，因此，該過程具有可逆性。目前，對于去甲基化藥物的研究主要集中在兩個方面：一類是核苷類似物，如5-氮-2-脫氧胞苷等，能參與快速增長的腫瘤細胞的DNA合成，通過占有、消耗DNA甲基轉移酶（DNMTs）特異性地抑制DNA甲基化。另一類是非核苷類似物，如普魯卡因。普魯卡因是一種非共價結合的非核苷類DNMTs抑制劑，其可通過與DNA的CPG島高特異地結合，直接干擾DNMTs與DNA的結合位點，使超甲基化的CPG島去甲基化，從而使沉默的抑癌基因重新表達，發(fā)揮抗腫瘤的作用，同時避免了核苷類DNMTs抑制劑與酶共價結合帶來的骨髓抑制等毒性反應。普魯卡因能使人鼻咽癌CNE-2Z細胞的抑癌基因RASSF1A去甲基化，促其mRNA的表達增加，抑制了CNE-2Z細胞的增殖。鹽酸普魯卡因能夠逆轉人肝癌HepG2細胞Syk基因啟動子區(qū)域CPG島的甲基化，恢復Syk基因的活性并上調(diào)Syk蛋白的表達，抑制了肝癌細胞的增殖。

本實驗結果顯示，未經(jīng)鹽酸普魯卡因處理的HL-60細胞ID4基因處于高甲基化狀態(tài)，ID4mRNA及ID4蛋白的表達均處于低水平狀態(tài)，經(jīng)藥物處理48 h后細胞ID4基因出現(xiàn)明顯的去甲基化狀態(tài)，ID4 mRNA及ID4蛋白表達均明顯增加，隨著藥物濃度的增加，去甲基化的程度和ID4蛋白的表達在不斷增加。上述結果表明HL-60細胞ID4基因的表達受基因啟動子區(qū)域甲基化的調(diào)控，鹽酸普魯卡因能夠使ID4基因啟動子區(qū)域發(fā)生去甲基化，從而恢復基因的活性，上調(diào)ID4蛋白的表達，達到抑制腫瘤細胞的作用，并且這種效應可隨藥物濃度的增加而增強。

急性白血病及淋巴瘤的ID4基因啟動子區(qū)域的異常甲基化可使該基因表達沉默，失去其抑癌作用而導致血液腫瘤的發(fā)生與進展。本研究中，鹽酸普魯卡因能夠逆轉白血病HL-60細胞ID4基因啟動子區(qū)域的高甲基化狀態(tài)，從而恢復ID4基因的表達，并對HL-60細胞的生長起到抑制作用。對于非核苷類藥物鹽酸普魯卡因的去甲基化作用，如何更好地發(fā)揮其抗腫瘤效應需進一步的探索。