曹　林，曾秋鳳，張克英，丁雪梅，白世平，羅玉衡，王建萍，玄　玥，宿卓薇

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，教育部動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014)

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維生素C對(duì)肉雞缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α轉(zhuǎn)錄水平的影響

曹林，曾秋鳳*，張克英，丁雪梅，白世平，羅玉衡，王建萍，玄玥，宿卓薇

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，教育部動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014)

摘要：旨在體外培養(yǎng)肉雞肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)的基礎(chǔ)上利用氯化鈷(CoCl2)建立細(xì)胞缺氧模型，探討維生素C(VC)對(duì)缺氧肉雞PASMCs中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)及其下游靶基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。選用21 d健康A(chǔ)A肉公雞，分離、培養(yǎng)并鑒定PASMCs，利用CoCl2建立細(xì)胞缺氧模型，再用7個(gè)濃度的VC(0、50、100、200、500、1 000和1 500 μmol·L-1)，5個(gè)培養(yǎng)時(shí)間(6、12、24、48和72 h)處理，試驗(yàn)共設(shè)35個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明，利用組織塊法可成功培養(yǎng)出肉雞PASMCs；與對(duì)照組相比，不同濃度CoCl2均可使細(xì)胞缺氧基因(HIF-1α、VEGF、VEGFR2)轉(zhuǎn)錄量顯著增加(P<0.05)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，250 μmol·L-1CoCl2處理48 h可成功建立肉雞PASMCs缺氧模型；500或1 000 μmol·L-1VC處理48或72 h可顯著降低缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGFR2 mRNA的轉(zhuǎn)錄(P<0.05)，而1 500 μmol·L-1VC則顯著增加缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA的轉(zhuǎn)錄(P<0.05)。結(jié)果提示，缺氧會(huì)導(dǎo)致肉雞肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞缺氧基因表達(dá)量與細(xì)胞增殖增加，而VC能降低細(xì)胞對(duì)缺氧信號(hào)的敏感性，使缺氧基因的相對(duì)表達(dá)量降低。

關(guān)鍵詞：肉雞肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；二氯化鈷；缺氧；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；維生素C

肉雞腹水綜合征(ascites syndrome，AS)又稱肉雞肺動(dòng)脈高壓綜合征(pulmonary hypertension syndrome，PHS)，是快大型肉雞三大主要營(yíng)養(yǎng)代謝性病之一，己嚴(yán)重威脅到各國(guó)肉雞的健康養(yǎng)殖及其福利，年經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)10億美元。研究發(fā)現(xiàn)缺氧是引發(fā)肉雞AS的一個(gè)關(guān)鍵啟動(dòng)因子，缺氧導(dǎo)致肉雞肺動(dòng)脈血管重構(gòu)[1]、肺動(dòng)脈壓升高、右心室肥大、自由基損傷等病理變化[2-3]。缺氧誘導(dǎo)因子-1 (hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是機(jī)體感受缺氧信號(hào)傳導(dǎo)的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其是由HIF-1α與HIF-1β兩個(gè)亞基組成的異二聚體。HIF-1α是HIF-1所特有，受細(xì)胞氧濃度的密切調(diào)控，決定HIF-1的水平與活性。2006年，曾秋鳳[4]研究證實(shí)，HIF-1α基因表達(dá)與肉雞AS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2014年，楊夏(X.Yang)等[5]進(jìn)一步利用低溫誘導(dǎo)肉雞AS的研究證實(shí)，HIF-1α及其下游目的基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2/Flk-1)參與了腹水肉雞的肺動(dòng)脈血管重構(gòu)，而飼糧添加VC能夠下調(diào)AS肉雞肺HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA 轉(zhuǎn)錄，降低肺動(dòng)脈血管重構(gòu)。但其分子機(jī)制目前尚未見(jiàn)研究報(bào)道。

肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)增殖導(dǎo)致的肺動(dòng)脈重構(gòu)是肉雞AS發(fā)生的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)肉雞肺血管重構(gòu)與肺細(xì)小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增殖和凋亡減少有關(guān)[7]。缺氧是誘發(fā)肉雞肺血管重構(gòu)與肺細(xì)小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖的關(guān)鍵啟動(dòng)因子。氯化鈷(CoCl2)作為一種誘導(dǎo)劑，可與HIF-1α中的氧依賴降解區(qū)結(jié)合誘發(fā)細(xì)胞缺氧，從而用于體外培養(yǎng)細(xì)胞缺氧模型的構(gòu)建[8]。大量研究已利用CoCl2建立缺氧環(huán)境并應(yīng)用于體外神經(jīng)細(xì)胞[9]、癌細(xì)胞、血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞的研究[10]及奶牛子宮內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞[11]研究。2014年，李彬彬[11]研究發(fā)現(xiàn)，CoCl2的作用時(shí)間和作用濃度與HIF-1α mRNA轉(zhuǎn)錄量呈現(xiàn)正相關(guān)。因此，本試驗(yàn)旨在體外原代培養(yǎng)肉雞PASMCs，利用CoCl2建立細(xì)胞缺氧模型，初步探討維生素C對(duì)肉雞缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響，為進(jìn)一步研究VC調(diào)控HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試驗(yàn)試劑與儀器

生物安全柜(Thermo1300Series)、倒置顯微鏡(Nikon TS100)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo3111)、照相系統(tǒng)(Nikon DS-Ri1)、ABI 7900型熒光定量PCR儀、DMEM-F12培養(yǎng)基(HyClone)、南美洲胎牛血清(Sigma)、胰蛋白酶(HyClone)、青鏈霉素(HyClone)、D-hanks液(武漢博士德)、TritonX-100(Sigma)、鼠抗α-actin抗體(武漢博士德)、羊抗鼠抗體(武漢博士德)、CoCl2·6H2O(Sigma)、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(武漢博士德)。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物

30只21日齡健康A(chǔ)A肉公雞。

1.3肉雞肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定

1.3.1原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)和純化(組織貼塊法)試驗(yàn)參照2002年董世山等[12]和2009年李錦春等[13]的方法并加以摸索改進(jìn)。原代培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)組織塊貼上培養(yǎng)瓶瓶底4 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入3 mL完全培養(yǎng)液(20%胎牛血清+1%青鏈霉素+79%DMEM-F12)培養(yǎng)。每2～3 d換液一次。

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿瓶底80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)和純化。加入1 mL·瓶-10.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA室溫消化3 min，然后立即加入5 mL完全培養(yǎng)液，終止消化。再用移液槍輕輕吹打細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)使細(xì)胞完全脫離瓶底。然后按照1∶2(每瓶3 mL細(xì)胞懸液)接種至新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。一般傳至3代可以得到純凈的PASMCs，最多可傳至6～7代。

1.3.2細(xì)胞鑒定

1.3.2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定：用倒置顯微鏡，在100倍和200倍下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察。

1.3.2.2 細(xì)胞免疫熒光染色鑒定：試驗(yàn)參照2009年李錦春等[13]方法進(jìn)行。添加抗體孵育時(shí)，先滴加一抗(鼠抗α-actin抗體，1∶200稀釋)，室溫孵育1～2 h，D-hank’s液洗3次，每次5 min。再滴加二抗(生物素標(biāo)記羊抗小鼠抗體，1∶100稀釋)，室溫靜置30 min，D-hank’s液洗3次，每次5 min。滴加SABC-Cy3(1∶100稀釋)，濕盒室溫靜置30 min，D-hank’s液洗3次，每次5 min。梯度酒精脫水。熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.4CoCl2缺氧模型的建立

1.4.1CoCl2處理試驗(yàn)設(shè)計(jì)6×4因子設(shè)計(jì)，即6個(gè)CoCl2濃度(0、100、200、250、500和1 000 μmol·L-1)，將CoCl2溶于滅菌的超純水中，配成100 mmol·L-1的母液，0.22 μm濾膜過(guò)濾，再用培養(yǎng)基(DMEM-F12，1∶1)調(diào)節(jié)CoCl2母液為以上濃度；4個(gè)時(shí)間水平(6、12、24和48 h)，試驗(yàn)共計(jì)24個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

1.4.2CoCl2處理樣品收集相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)按照Trizol試劑說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，-80 ℃保存，用于缺氧基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)。

1.4.3肉雞PASMCs細(xì)胞增殖檢測(cè)細(xì)胞增殖檢測(cè)方法參考2012年陶紹能等[14]和王靜等[15]進(jìn)行。重復(fù)對(duì)細(xì)胞做CoCl2處理后，待測(cè)孔在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入10 μL 5 mg·mL-1的MTT溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL formanzan溶解液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，直到在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)formazan全部溶解，約4 h。利用SpectraMax M2 在570 nm測(cè)定吸光度。

1.5VC對(duì)肉雞缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

1.5.1VC處理試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)采用7×5因子設(shè)計(jì)，7個(gè)VC濃度(0、50、100、200、500、1 000和1 500 μmol·L-1)，將VC溶于滅菌的超純水中，配成10 mmol·L-1的母液，0.22 μm過(guò)濾，再用培養(yǎng)基(DMEM-F12，1∶1)調(diào)節(jié)VC母液為以上濃度，5個(gè)培養(yǎng)時(shí)間(6、12、24、48和72 h)，試驗(yàn)共計(jì)35個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

1.5.2VC處理樣品收集同CoCl2處理試驗(yàn)。

1.6RT-PCR檢測(cè)

利用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒和ABI Prism7900 sequence detection system進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)采用10 μL體系，冰上操作，體系包括：5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ+0.4 μL Forward Primer+ 0.4 μL Reverse Primer+0.2 μL ROX Reference+3 μL dH2O+1μL cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，再40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s)，最后進(jìn)行熔解曲線檢測(cè)(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s)。引物序列見(jiàn)表1。

表1引物序列

Table 1The sequence of primers

1.7數(shù)據(jù)處理

缺氧基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法[16]計(jì)算：ΔCt(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)；ΔΔCt=Ct(試驗(yàn)組)-Ct(對(duì)照組)。目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。用GraphPad Prism 5作圖。用SAS 9.0做單因素分析，分析CoCl2和VC對(duì)缺氧基因轉(zhuǎn)錄的影響，以P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2結(jié)果

2.1肉雞肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定在倒置相差顯微鏡下觀察，組織塊貼壁5～6 d后，逐漸有細(xì)胞從組織塊周圍爬出貼壁伸展，多數(shù)細(xì)胞伸展呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞質(zhì)豐富。細(xì)胞平行排列成單層，或部分區(qū)域多層重疊生長(zhǎng)，高低起伏，表現(xiàn)為PASMCs典型的“峰-谷”狀生長(zhǎng)特點(diǎn)(圖1)。

2.1.2免疫熒光染色鑒定肉雞PASMCs染色

后，α-SM-actin的免疫熒光顯示，細(xì)胞質(zhì)中有較多與細(xì)胞縱軸相平行的絲狀物，呈現(xiàn)紅色熒光，即為平滑肌細(xì)胞特有的肌動(dòng)蛋白(圖2)。肉雞PASMCs的染色陽(yáng)性率占95%以上。

2.2CoCl2誘導(dǎo)肉雞PASMCs缺氧對(duì)HIF-1α mRNA轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞增殖的影響

2.2.1HIF-1α mRNA轉(zhuǎn)錄量不同濃度CoCl2在不同時(shí)間處理下肉雞PASMCs的HIF-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄見(jiàn)圖3。時(shí)間和CoCl2濃度對(duì)HIF-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄的主效應(yīng)顯著(P<0.05)。CoCl2各濃度處理6 h，其HIF-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄均很低，0、100、200 μmol·L-1CoCl2處理12和24 h，其HIF-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄也較低。用250、500和1 000 μmol·L-1CoCl2處理12、24、48 h后，其HIF-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄均顯著增加(P<0.05)，其中以250 μmol·L-1CoCl2處理48 h最高。

2.2.2細(xì)胞增殖不同濃度CoCl2不同處理時(shí)間下，肉雞PASMCs的細(xì)胞增殖情況如圖4。時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖的主效應(yīng)極顯著(P<0.01)。隨著CoCl2濃度增大，細(xì)胞增殖降低。隨著處理時(shí)間增加，細(xì)胞增殖增加，48 h最大(P<0.01)。

2.2.3CoCl2處理肉雞PASMCs中VEGF和Flk-1基因的轉(zhuǎn)錄CoCl2濃度為0、250和1 000 μmol·L-1下處理48 h，細(xì)胞VEGF和Flk-1的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量如圖5和6。當(dāng)CoCl2濃度250和1 000 μmol·L-1下處理48 h時(shí)，細(xì)胞VEGFmRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量均有高于CoCl2濃度為0 μmol·L-1處理的趨勢(shì)；細(xì)胞Flk-1 mRNA轉(zhuǎn)錄量均高于CoCl2濃度為0 μmol·L-1的處理，但差異不顯著。CoCl2處理時(shí)缺氧基因(HIF-1α、VEGF、Flk-1)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量及細(xì)胞增殖變化表明，建立肉雞PASMCs缺氧模型的最佳 CoCl2處理?xiàng)l件為250 μmol·L-148 h。

2.3VC對(duì)肉雞缺氧PASMCsHIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

CoCl2誘導(dǎo)肉雞肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞缺氧后添加不同濃度VC，不同時(shí)間處理下肉雞PASMCsHIF-1α 、VEGF、VEGFR2 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量交互效應(yīng)見(jiàn)圖7，主效應(yīng)見(jiàn)圖8和圖9。

由圖7可看出，隨著VC濃度和處理時(shí)間增加，HIF-1α與VEGFR2 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量下降。與0 μmol·L-1+6 h處理組相比，VEGFR2的全部處理組以及HIF-1α除50、100 μmol·L-1+6 h和0、1 500 μmol·L-1+24 h處理組mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量都極顯著降低 (P<0.01)。但與0 μmol·L-1+6 h處理組相比，VEGFmRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量，200、500、1 000 μmol·L-1+6、12 h組和1 500 μmol·L-1+72 h組極顯著升高(P<0.01)，而50 μmol·L-1+24 h組、 0、50、100 μmol·L-1+48 h組、1 000 μmol·L-1+72 h組顯著降低(P<0.05)，0、50、100 μmol·L-1+72 h組降低水平達(dá)到極顯著(P<0.01)，與其他處理組差異不顯著。

由圖8可以看出，隨著處理時(shí)間的增加HIF-1α mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量降低，在12 h時(shí)最低，達(dá)到顯著水平(P<0.05)，其次是48和72 h，也顯著低于6和24 h(P<0.05)，其靶基因VEGF、VEGFR2 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量呈現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)，都隨著處理時(shí)間的增加而降低，在72 h時(shí)達(dá)到最低值，但較48 h不顯著，較其他處理時(shí)間顯著(P<0.05)。表明，VC最佳的處理時(shí)間為48或72 h。

由圖9可以看出，當(dāng)VC濃度為500或1 000 μmol·L-1，HIF-1α mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量較低，與其他濃度組相比達(dá)到顯著差異(P<0.05)，其靶基因VEGFR2 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量呈現(xiàn)出與HIF-1α較為一致的趨勢(shì)。但是VEGFmRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在VC濃度為50 μmol·L-1時(shí)略有降低，之后隨著VC濃度的升高總體上升高，在200 μmol·L-1時(shí)達(dá)到顯著升高的水平 (P<0.05)。與其他VC濃度組相比，1 500 μmol·L-1VC顯著增加了HIF-1α、VEGFR2 mRNA轉(zhuǎn)錄量(P<0.05)。表明，VC最佳的處理濃度為500 或1 000 μmol·L-1。

3討論

3.1肉雞PASMCs原代細(xì)胞的培養(yǎng)

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，組織塊貼壁5～6 d后，逐漸有細(xì)胞從周圍爬出，呈長(zhǎng)梭形，7～10 d后細(xì)胞鋪滿80%瓶壁。這與2002年董世山等[12]應(yīng)用組織貼塊法、貼塊配合差速貼壁法培養(yǎng)不同日齡雞的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致。

本試驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞免疫熒光法對(duì)平滑肌細(xì)胞特有的α-actin肌動(dòng)蛋白染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中有較多與細(xì)胞縱軸相平行的絲狀物呈現(xiàn)紅色熒光，即為平滑肌細(xì)胞特有的肌動(dòng)蛋白。這與2009年李錦春等[13]利用組織貼塊法培養(yǎng)1～10 d肉雞PASMCs的結(jié)果一致。證明本試驗(yàn)成功培養(yǎng)出21 d肉雞PASMCs。

3.2CoCl2誘導(dǎo)缺氧模型的建立及HIF-1α、VEGF、VEGFR2基因的轉(zhuǎn)錄

目前，細(xì)胞缺氧模型的建立通常有物理缺氧法和化學(xué)缺氧法。通過(guò)調(diào)節(jié)三氣培養(yǎng)箱中氧氣和氮?dú)獾谋壤?一般為5%CO2+3%O2+92%N2或5%CO2+95%N2)來(lái)造成缺氧環(huán)境效果比較理想，但培養(yǎng)箱價(jià)格昂貴?；瘜W(xué)法主要是通過(guò)添加化學(xué)試劑(如氰化物或CoCl2)誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧。氯化鈷通過(guò)影響HIF-1α亞基的表達(dá)來(lái)影響HIF-1的表達(dá)，從而建立缺氧環(huán)境并與HIF-1的表達(dá)形成濃度依賴性[17，18]。2003年，K.Zhang等[19]研究進(jìn)一步指出，利用CoCl2模擬細(xì)胞缺氧時(shí)HIF-1α基因表達(dá)上調(diào)表明細(xì)胞缺氧環(huán)境的成功建立。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過(guò)CoCl2可以明顯提高肉雞PASMCs中HIF-1α基因的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)用250 μmol·L-1CoCl2處理48 h時(shí)，肉雞PASMC的HIF-1α mRNA轉(zhuǎn)錄量最大，細(xì)胞增殖狀態(tài)良好。因此將250 μmol·L-1CoCl2處理48 h作為建立肉雞PASMCs缺氧模型的可靠條件。

研究發(fā)現(xiàn)，肉雞發(fā)生AS時(shí)肺動(dòng)脈血管發(fā)生細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移[1]。VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量在平滑肌細(xì)胞缺氧后數(shù)小時(shí)內(nèi)明顯提高，在恢復(fù)供氧后又降低到正常水平，說(shuō)明缺氧導(dǎo)致細(xì)胞VEGF基因表達(dá)量提高，造成細(xì)胞增殖與遷移[20]。G.T.Stavri等[21]報(bào)道缺氧能顯著上調(diào)氧濃度和時(shí)間依賴的兔血管平滑肌細(xì)胞VEGFmRNA的穩(wěn)態(tài)水平，0%O2處理12～24 h后達(dá)到峰值，與對(duì)照組相比增加了30倍。1998年，H.Christou等[22]報(bào)道指出缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞VEGF及其受體VEGFR2的基因表達(dá)顯著增加。

同樣，在本研究中CoCl2濃度為250和1 000 μmol·L-1處理48 h后，細(xì)胞VEGFR2 mRNA轉(zhuǎn)錄量均高于CoCl2濃度為0 μmol·L-1的處理。該結(jié)果與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)低溫組肉雞肺缺氧相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄規(guī)律基本一致[5]，表明缺氧導(dǎo)致肉雞PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA的轉(zhuǎn)錄量增加。

3.3VC對(duì)缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

VC作為一種強(qiáng)抗氧化劑和脯氨酸羥化酶的輔助因子，對(duì)人類或鼠類腫瘤細(xì)胞HIF-1α基因及其活性有著較強(qiáng)的調(diào)控作用。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，50～500 μmol·L-1VC使缺氧PASMCs中HIF-1α mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著降低，對(duì)VEGF、VEGFR2 mRNA轉(zhuǎn)錄量的影響也呈現(xiàn)出一致的趨勢(shì)。這與2003年H.J.Knowles等[23]的研究報(bào)道相一致。眾多體外試驗(yàn)結(jié)果表明，HIF-1α的表達(dá)及活性受細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和脯氨酸羥化酶活性的影響[24]。用50 μmol·L-1H2O2可刺激人肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞HIF-1α蛋白和mRNA表達(dá)增加，而用抗氧化劑N-乙酰胱氨酸(5 mmol·L-1)處理，可使HIF-1α蛋白和mRNA表達(dá)量分別下降85.8%和94.4%[25]。正常給氧條件下培養(yǎng)PC3 細(xì)胞中加入1 mmol·L-1MMOG (dimethyloxalylglycine，一種脯氨酸羥化酶的抑制劑)可上調(diào)HIF-1α蛋白的表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)VC缺乏會(huì)使脯氨酸羥化酶活性喪失，HIF-1α蛋白降解受到抑制，從該酶的Km值推測(cè)出細(xì)胞內(nèi)VC濃度在140～260 μmol·L-1之間時(shí)該酶的活性最佳[26-27]。

VC是否通過(guò)抗氧化和提高脯氨酸羥化酶活性來(lái)調(diào)控肉雞缺氧PASMCs中HIF-1α及其下游靶基因的表達(dá)，有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著VC濃度的提高，VEGF的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量總體上呈上升趨勢(shì)。這可能是由于VEGF表達(dá)受上游轉(zhuǎn)錄因子，如HIF-1α、癌基因Ras等，以及諸多其他因素，如細(xì)胞因子，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(EGF)、肝素等共同調(diào)控[28]，但其具體原因也有待進(jìn)一步探討。

此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，1 500 μmol·L-1的VC則使HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著增加，尤其是HIF-1α和VEGFR2 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量極顯著地高于其他處理組。這可能是由于過(guò)高劑量VC的添加對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒性作用，增加了細(xì)胞對(duì)缺氧刺激的敏感性[29]，反饋性地促進(jìn)了缺氧相關(guān)基因的表達(dá)。

4結(jié)論

利用組織塊貼壁法可成功培養(yǎng)21 d肉雞肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。250 μmol·L-1CoCl2處理48 h可成功建立肉雞PASMCs缺氧模型；缺氧導(dǎo)致肉雞PASMCs 顯著增殖和HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量增加。濃度為500、1 000 μmol·L-1的VC處理48、72 h，可降低缺氧狀態(tài)下肉雞PASMCsHIF-1α、VEGF、VEGFR2基因的轉(zhuǎn)錄；而高劑量(1 500 μmol·L-1)VC可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，反饋性地上調(diào)上述基因的表達(dá)。

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(編輯白永平)

Effects of Vitamin C on the Transcription of Hypoxia Inducible Factor-1α of Broiler Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells under Hypoxia

CAO Lin，ZENG Qiu-feng*，ZHANG Ke-ying，DING Xue-mei，BAI Shi-ping，LUO Yu-heng，WANG Jian-ping，XUAN Yue，SU Zhuo-wei

(KeyLaboratoryofAnimalNutritionforDiseaseResistanceintheMinistryofEducation，InstituteofAnimalNutrition，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

Key words:broiler pulmonary artery smooth muscle cells；CoCl2；hypoxia；HIF-1α；VC

Abstract:This study was conducted to investigate the effects of Vitamin C (VC) on hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α)，vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor 2 (VEGFR2) mRNA transcription of broiler pulmonary artery smooth muscle cells(PASMCs)under hypoxia induced by CoCl2.PASMCs from healthy AA broilers at 21 days of age were isolated，cultured and identified.A cell model of hypoxia was established by using CoCl2.On this basis，PASMCs were treated by 7 different concentrations of VC (0，50，100，200，500，1 000 and 1 500 μmol·L-1) and 5 processing time (6，12，24，48 and 72 h)，total 35 treatments with six replicates.The results indicated that the PASMCs of broilers were successfully separated and culturedinvitro.As for hypoxia model of PASMCs，the relative transcription ofHIF-1α，VEGF，VEGFR2 and cell proliferation capacity significantly increased when PASMCs were after 48 h treatment by CoCl2with 250 μmol·L-1(P<0.05).The relative transcription ofHIF-1α，VEGFR2 in hypoxia PASMCs were significantly decreased by VC with 500 or 1 000 μmol·L-1after 48 or 72 h (P<0.05).Whereas 1 500 μmol·L-1VC significantly increased the relative transcription ofHIF-1α，VEGF，VEGFR2 in hypoxia PASMCs (P<0.05).These results suggested that anoxia could up-regulate the relative expression of hypoxia related genes and induce abnormally proliferation of PASMCs.While VC could reduce the sensitivity to oxygen signals of hypoxia PASMCs，and further down-regulate the relative expression of hypoxia related genes.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.024

收稿日期：2015-07-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)青年基金(31101733)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)211雙支計(jì)劃

作者簡(jiǎn)介：曹林(1990-)，男，四川綿陽(yáng)人，碩士生，主要從事家禽營(yíng)養(yǎng)與飼料研究，E-mail：1315522048@qq.com *通信作者：曾秋鳳，研究員，博士，主要從事家禽營(yíng)養(yǎng)與飼料研究，E-mail：zqf@sicau.edu.cn

中圖分類號(hào)：S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)02-0388-09