宋星桔，胡丹丹，鐘秀琴，陽愛國，郭　莉，毛光瓊，王　凝，閆　敏，汪　濤，古小彬，楊光友*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611130；2.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，成都 610041)

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細粒棘球絳蟲銅鋅超氧化物歧化酶基因的表達與特征分析

宋星桔1，胡丹丹1，鐘秀琴1，陽愛國2，郭莉2，毛光瓊2，王凝1，閆敏1，汪濤1，古小彬1，楊光友1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611130；2.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，成都 610041)

摘要：旨在探討Eg-SOD基因的特征及其在細粒棘球絳蟲上的抗氧化作用。通過原核表達得到重組Eg-SOD，對其進行酶活性測定、免疫印跡、ELISA以及免疫熒光定位分析。經(jīng)原核表達出的重組Eg-SOD蛋白為可溶性蛋白，以羥胺法測定其酶學活性，可達(464.55±19.99)U·mg-1。免疫印跡結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)能夠被實驗室人工感染細粒棘球蚴的小鼠陽性血清所識別，具有較強的反應(yīng)原性；ELISA分析顯示，重組Eg-SOD對人工感染細粒棘球蚴的小鼠血清和自然感染包蟲病的綿羊血清檢出率均為100%，而對細頸囊尾蚴的交叉反應(yīng)為37.5%，提示該蛋白質(zhì)可以作為潛在的診斷候選分子。免疫熒光定位顯示該蛋白質(zhì)廣泛分布于成蟲和原頭蚴的組織間隙，以及少量分布于表皮。本研究對Eg-SOD的特點進行了初步的探討，并揭示該蛋白質(zhì)與蟲體的抗氧化損傷有著密切的聯(lián)系。

關(guān)鍵詞：細粒棘球絳蟲；銅鋅超氧化物歧化酶；熒光定位

細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)的中絳期幼蟲(細粒棘球蚴)寄生于人和動物的肝和肺等器官內(nèi)，引起人和動物的細粒棘球蚴病(又稱為囊型包蟲病)。在中國，有25個省、市、自治區(qū)有包蟲病病例的報道，其中以西部牧區(qū)發(fā)病最為嚴重[1-2]。該病給我國畜牧業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，同時也為人類帶來了諸多公共衛(wèi)生安全問題。

目前已有多種寄生蟲的Cu/Zn SOD已被深入研究。研究者以曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)Cu/Zn SOD DNA疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)該疫苗對曼氏血吸蟲感染有顯著的抵抗作用[11]。此外，在大片吸蟲(Fasciolagigantica)、豬帶絳蟲(Taeniasolium)和盤尾絲蟲(Onchocercavolvulus)等蟲種的研究表明，Cu/Zn SOD具有較強的免疫原性[12-15]。在Cu/Zn SOD酶活性的研究上，發(fā)現(xiàn)多種抗寄生蟲藥物，如苯并咪唑類藥物，能夠?qū)ζ洚a(chǎn)生特異性的抑制作用，而不傷害宿主Cu/Zn SOD的活性[16-17]。然而，在細粒棘球絳蟲上，對Cu/Zn SOD的研究還非常有限[18]。因此，本研究擬對細粒棘球絳蟲Cu/Zn SOD(Eg-SOD)的抗氧化作用，免疫原性以及它在各時期蟲體中的分布情況進行研究，期望通過了解Eg-SOD的這些基本特征，為該蛋白質(zhì)的進一步深入研究奠定基礎(chǔ)，并為包蟲病的防控提供基礎(chǔ)參考資料。

1材料與方法

1.1蟲體

細粒棘球蚴包囊采自青海省西寧市屠宰場的綿羊肝或肺，在實驗室無菌條件下進行手術(shù)分離。用一次性注射器對囊液進行反復(fù)抽送后吸出囊液，并分離生發(fā)層。囊液經(jīng)3 000 r ·min-1離心5 min，取沉淀用滅菌生理鹽水洗滌3次即得細粒棘球蚴原頭蚴。

為了獲取細粒棘球絳蟲成蟲，對兩只來自非棘球蚴病疫區(qū)的犬(約5月齡，雌性)提前1周投喂吡喹酮(praziquantel)和阿苯達唑(albendazole)。在四川農(nóng)業(yè)大學生物安全二級實驗室條件下，分別將約20 000個原頭蚴飼喂犬，35 d后剖殺犬只，取其小腸部分，置于37 ℃溫熱的生理鹽水中，并用木片輕輕刮取其黏膜表面，自然沉降得到殘渣，用放大鏡從中挑取成蟲。

1.2血清

對12只6～8周齡雌性ICR小鼠進行腹腔接種，每只接種200 μL含有約2 000個原頭蚴的PBS混懸液(含100 U·mL-1青霉素和 100 μg·mL-1鏈霉素)。9個月后，對小鼠進行斷尾采血，并剖殺小鼠，在其腹腔中發(fā)現(xiàn)了棘球蚴包囊的小鼠血清視為陽性血清；陰性血清為未接種原頭蚴的小鼠血清。14份自然感染細粒棘球蚴的綿羊血清以及健康綿羊血清采自新疆某屠宰場；8份感染細頸囊尾蚴的綿羊血清來自四川某屠宰場。

1.3生物信息學分析

從細粒棘球絳蟲基因組數(shù)據(jù)庫中下載得到細粒棘球絳蟲Eg-SOD基因全序列，以DNAStar軟件推測其對應(yīng)的氨基酸序列。以在線軟件SignalP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、Transmembrane Prediction server(http：//www.sbc.su.se/～miklos/DAS/)和TargetP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分別對其信號肽、跨膜區(qū)以及亞細胞定位進行分析。以推導出的氨基酸序列找出同源基因，并以Clustal W2在線軟件(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)對氨基酸序列進行比對分析。以DNAMAN比較同源基因之間的相似性。最后用MEGA 5.05軟件以鄰接法構(gòu)進行系統(tǒng)進化分析，并構(gòu)建進化樹。

1.4Eg-SOD的表達、純化與酶活性測定

取約2 000個原頭蚴，以動物組織總RNA提取試劑盒(Tiangen，China)提取總RNA，并以反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計一對特異性的PCR引物(上游：5′-CGGGGTACCATGAAGGCTGTCTGTGTTA-TGC-3′，下劃線為KpnⅠ酶切位點；下游：5′-CCG-CTCGAGGCTTTTAGCGATTCCGATGA-3′，下劃線為XhoⅠ酶切位點)，從cDNA中擴增出Eg-SOD基因全長CDs區(qū)域。經(jīng)TA克隆后，將擴增產(chǎn)物以酶切鏈接的方式導入pET32a載體中；經(jīng)測序驗證連接正確后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，以IPTG誘導重組蛋白質(zhì)的表達。超聲裂解重組菌后，取裂解產(chǎn)物上清，以Ni2+親和層析的方法進行純化。按超氧化物歧化酶分型測試試劑盒(羥胺法)(南京建成生物工程研究所)的操作步驟對重組Eg-SOD蛋白的酶活性進行測定。

1.5重組蛋白質(zhì)多克隆抗體的制備

以重組蛋白質(zhì)對2只約15周齡的雄性新西蘭大白兔進行3次皮下免疫，每次免疫間隔2周。首次免疫為50 μg·mL-1重組蛋白質(zhì)與等體積弗氏完全佐劑混合，加強免疫為50 μg·mL-1重組蛋白質(zhì)與等體積弗氏不完全佐劑混合。免疫結(jié)束后第2周，對大白兔進行采血，并分離血清。將分離后的血清在Protein A親和層析柱(Bio-Rad，USA)中進行純化，得到血清中的多克隆抗體。對照組大白兔即把重組蛋白質(zhì)替換為等體積的PBS，抗體制備過程與試驗組相同。

1.6免疫印跡

將重組蛋白質(zhì)和原頭蚴裂解液分別進行SDS-PAGE凝膠電泳，再將凝膠分別轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶封閉后，分別以綿羊和小鼠棘球蚴陽性、陰性血清(均為1∶200稀釋)對重組蛋白質(zhì)進行孵育；以重組蛋白質(zhì)高免血清和對照血清(均為1∶1 000稀釋)對原頭蚴裂解液進行孵育。經(jīng)洗滌后，以HRP標記的山羊抗小鼠或兔抗綿羊二抗對重組蛋白質(zhì)進行孵育；再以HRP標記的山羊抗兔二抗對原頭蚴裂解產(chǎn)物進行孵育。最后在顯色底物作用下進行顯色觀察。

1.7ELISA

向96孔板中加入100 μL含有2 μg·mL-1重組蛋白質(zhì)的包被液(0.1 mol·L-1碳酸鈉溶液pH 9.6)，4 ℃包被過夜。經(jīng)5%脫脂牛奶包被后，向孔中分別加入12份小鼠棘球蚴陽性血清和陰性血清(1∶200稀釋)進行孵育；然后加入HRP標記的山羊抗小鼠二抗進行孵育；洗滌后以可溶性TMB顯色底物進行顯色，并以2 mol·L-1H2SO4終止顯色。在酶標儀紫外波長450 nm處測定吸光度值。以相同的抗原和血清反應(yīng)濃度分別對14份細粒棘球蚴綿羊陽性和陰性血清以及8份細頸囊尾蚴綿羊血清進行孵育，再以HRP標記的兔抗綿羊二抗孵育，并進行顯色，測定OD值。

1.8免疫熒光定位

取新鮮蟲體樣品(包括原頭蚴、生發(fā)層和成蟲)于4%多聚甲醛溶液中固定36 h；樣本經(jīng)一系列的脫水、透明處理后包埋入石蠟內(nèi)，并以切片機切片備用。經(jīng)脫蠟和水化處理后，將切片用3% H2O2處理10 min，然后置于約95 ℃的0.01 mol·L-1枸櫞酸緩沖液中5～10 min，進行熱修復(fù)抗原；經(jīng)洗滌后，分別以多克隆抗體和健康兔IgG對切片進行4 ℃孵育過夜；隨后，反復(fù)洗滌切片，以FITC標記的山羊抗兔熒光二抗(Bethyl Laboratories)對蟲體進行顯色，并在熒光顯微鏡下進行觀察。

2結(jié)果

2.1Eg-SOD基因的生物信息學分析

細粒棘球絳蟲基因組中Cu/ZnSOD基因全長2 356 bp，含兩個較長的內(nèi)含子和三個外顯子，與其他帶科絳蟲或蠕蟲的基因結(jié)構(gòu)相似。該基因CDs序列含459個堿基，編碼152個氨基酸，與其他物種SOD氨基酸序列之間的保守性較高，與帶科絳蟲之間的相似性達到92.76%～98.68%，與其寄生宿主(哺乳動物)之間的相似性為57.89%～59.21%(圖1)。經(jīng)氨基酸序列預(yù)測，SOD蛋白沒有信號肽和跨膜區(qū)，其相對分子質(zhì)量約為15.6 ku，等電點為5.95，分布于細胞周質(zhì)之中。Eg-SOD二級結(jié)構(gòu)具有典型的Cu/Zn SOD酶活性區(qū)域，八個折疊區(qū)以及兩個二硫鍵形成位點可供形成二聚體?；趧游锝鏑u/ZnSOD基因氨基酸序列的進化分析顯示，所有序列主要歸為四大分支，即蠕蟲分支、昆蟲分支、線蟲分支以及脊椎動物分支，Eg-SOD歸為蠕蟲分支(圖2)。

2.2重組Eg-SOD的表達及其識別

經(jīng)凝膠電泳顯示，由特異性引物PCR擴增的產(chǎn)物為一條459 bp左右的條帶，與基因組數(shù)據(jù)中的Eg-SOD基因大小一致。經(jīng)測序得到的序列與基因組中的序列相似性達到100%，即表明該片段為Eg-SOD基因CDs全序列。

經(jīng)親和層析后的重組蛋白質(zhì)在SDS-PAGE下顯示為單一條帶，大小約為35 ku，符合預(yù)期大小(加上pET32a載體上的Trx標簽約20 ku)。通過與小鼠和綿羊棘球蚴陽性血清進行免疫印跡反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)重組Eg-SOD能夠被陽性血清特異性的識別(圖3)，說明Eg-SOD具有較好的反應(yīng)原性。以羥胺法針對Cu/Zn SOD酶活性進行測試，顯示rEg-SOD具有較強的酶活性，經(jīng)NaN3處理后活性依然不減，達到(464.55±19.99)U·mg-1(表1)，說明rEg-SOD不是Mn SOD而是Cu/Zn SOD。

2.3ELISA

表1重組Eg-SOD酶活性的測定

Table 1Enzyme activity analysis of recombinant Eg-SOD

酶活力計算公式為：酶活力(U·mg-1)=(對照組OD值-試驗組OD值)÷對照組OD值÷50%×反應(yīng)稀釋倍數(shù)÷蛋白質(zhì)濃度Computational formula：Enzyme activity (U·mg-1) =[OD value (Con)-OD value (Exp)]÷OD value (Con)÷50%×Dilution ratio÷Protein concentration

2.4Eg-SOD在細粒棘球絳蟲各生活史階段的定位

免疫熒光定位所用多克隆血清經(jīng)Western blot驗證，能夠特異性的識別蟲體中的Eg-SOD蛋白(圖3)，故可以用作下一步試驗。經(jīng)熒光免疫定位試驗顯示，Eg-SOD大量且廣泛地存在于蟲體的各個生活時期，在原頭蚴皮層下部、整個生發(fā)層和蟲卵卵殼外層有大量表達；在原頭蚴皮層外部、成蟲皮層外部有少量表達(圖5)。

3討論

銅鋅超氧化物歧化酶作為超氧自由基清除劑，廣泛地分布于各種生物器官之中，清除細胞內(nèi)的氧自由基，避免其形成對機體有毒害作用的氧自由基(如過氧化氫，次氯酸鹽以及過氧亞硝酸鹽等)，從而保護機體細胞[19]。正常情況下，在機體有氧代謝過程中即會產(chǎn)生少量的ROS，它們會被自身的SOD酶及時地還原。在微生物感染過程中，宿主往往通過中性粒細胞、嗜酸性粒細胞或者嗜堿性粒細胞等通過NADPH氧化酶等產(chǎn)生氧自由基來對病原微生物進行殺傷[20]。在寄生蟲的寄生過程中，它們能夠成功地逃避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷，有一部分原因就是因為它們自身具有發(fā)達的抗氧化酶系統(tǒng)(如：SOD、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶、硫氧還原蛋白等)[9]。在此體系中SOD具有重要的作用，它能將超氧自由基歧化為水和過氧化氫，后者在過氧化氫酶等的作用下進一步分解為對機體無害的水，從而化解氧化壓力。

在本研究中，作者對細粒棘球絳蟲的Cu/ZnSOD基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)活性進行了分析。Eg-SOD基因與其他絳蟲的基因在結(jié)構(gòu)和序列上相似度較高，Cu2+和Zn2+離子結(jié)合位點、二硫鍵結(jié)合位點、以及超氧自由基結(jié)合位點與其它動物Cu/Zn SOD完全保守，提示Eg-SOD基因是一個非常保守的基因。對其他寄生蟲Cu/Zn SOD的研究表明，阿苯達唑和噻苯達唑等苯并咪唑類抗寄生蟲藥物能夠特異性地抑制寄生蟲SOD酶活性，而不損害宿主SOD酶活性[16]。系統(tǒng)進化樹分析顯示，絳蟲Cu/ZnSOD基因能夠與其哺乳動物宿主基因明顯地區(qū)分開來，說明了它們之間存在著較大的差異，這使得寄生蟲Cu/Zn SOD作為藥物靶點成為可能。

G.Salinas等[18]曾對細粒棘球絳蟲各時期蟲體及組分中SOD酶活性進行了分析，顯示大部分的酶活性來自于Cu/Zn SOD，而Mn SOD只有少部分組織中才有，且活性較低，說明Cu/Zn SOD在細粒棘球絳蟲抗氧化系統(tǒng)中的重要地位。本研究通過免疫組織化學的方法也發(fā)現(xiàn)Cu/Zn SOD酶在細粒棘球絳蟲各時期蟲體和組織中廣泛分布，并且在原頭蚴和蟲卵中的含量也相對較高。G.Salinas等的研究也曾指出在原頭蚴中的Cu/Zn SOD酶活性最高。結(jié)合本研究結(jié)果，推測當細粒棘球蚴在寄生于中間宿主體內(nèi)時經(jīng)受的氧化壓力最強，當某些包囊中的原頭蚴不能再承受這種壓力以后，就可能會產(chǎn)生細胞凋亡等過程而被殺死，從而產(chǎn)生了不育包囊。

免疫印跡和ELISA結(jié)果顯示rEg-SOD具有良好的反應(yīng)原性，對小鼠陽性血清以及自然感染細粒棘球蚴的綿羊血清識別率均為100%，提示其可作為一個候選的診斷抗原。但是，由于陽性血清的種類和數(shù)量還比較欠缺，還需要來自更多患病動物或人類的陽性血清對其敏感性進行分析；同時還需要其他動物寄生蟲病(如腦多頭蚴病等)陽性血清對其特異性進行分析。本研究通過原核表達純化出具有較高酶活性和反應(yīng)原性的重組蛋白質(zhì)，為后續(xù)將rEg-SOD作為人和動物包蟲病診斷抗原的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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(編輯白永平)

Prokaryotic Expression and Characterization of Cu/Zn Superoxide Dismutase ofEchinococcusgranulosus

SONG Xing-ju1，HU Dan-dan1，ZHONG Xiu-qin1，YANG Ai-guo2，GUO Li2，MAO Guang-qiong2，WANG Ning1，YAN Min1，WANG Tao1，GU Xiao-bin1，YANG Guang-you1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China；2.SichuanCentersforAnimalDiseaseControlandPreventive，Chengdu610041，China)

Key words:Echinococcusgranulosus；Cu/Zn superoxide dismutase；immunolocalization

Abstract:The aim of this study was to characterise the Cu/Zn superoxide dismutase ofEchinococcusgranulosus(Eg-SOD)，and analyze its role in the parasite antioxidant system.The recombinant Eg-SOD was expressed inE.coli，and the enzymatic activity was measured，and analyses including western blotting，ELISA and immunofluorescence localization were also performed.The recombinant Eg-SOD was expressed as soluble protein，and its activity was up to (464.55 ±19.99) U·mg-1measured by hydroxylamine method.As showed by the result of western blot，the recombinant Eg-SOD could be recognized by the serum of mice secondary experimentally infected withE.granulosusprotoscolexes，and showed a high immunogenicity；ELISA tests showed that recombinant Eg-SOD could recognize all the sera from mice experimentally infected with protoscolexs and from sheep naturally infected withE.granulosus，and have 37.5% cross-reactions with sera from sheep infected withCysticercustenuicollis，which indicates Eg-SOD might be a potential diagnose antigen.The immunolocalization of Eg-SOD showed a wide extent of distribution，mostly in the tissue clearance of adult worms and protoscolexes，and fewer on the tegument.These results provide the fundamental understanding of Eg-SOD，and revealed its capable of antioxidation effect.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.018

收稿日期：2015-06-03

基金項目：四川省科技支撐計劃項目(2015NZ0041)

作者簡介：宋星桔(1991-)，女，四川資陽人，碩士，主要從事動物寄生蟲病學研究，E-mail：18728153735@163.com *通信作者：楊光友，教授，博導，從事動物寄生蟲病學研究，E-mail：guangyou1963@aliyun.com

中圖分類號：S852.734

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0346-08