楊　慧，方紹明，黃曉暢，陳從英，張志燕

(省部共建豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045)

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母豬殺嬰行為的全基因組關(guān)聯(lián)分析

楊慧，方紹明，黃曉暢，陳從英*，張志燕*

(省部共建豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045)

摘要：本研究測(cè)定了288頭來自白色杜洛克×二花臉F2群體的母豬殺嬰行為表型，旨在定位出影響母豬殺嬰行為的QTL。基于整個(gè)家系及已經(jīng)掃描個(gè)體的60K SNP芯片信息推測(cè)出本試驗(yàn)288頭個(gè)體60K的基因型。隨后，我們利用R語言GenABEL軟件包的廣義混合線性模型對(duì)母豬殺嬰行為表型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，定位影響母豬殺嬰行為的顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)。結(jié)果，在SSC2和SSC8上共發(fā)現(xiàn)50個(gè)與母豬殺嬰顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位點(diǎn)，其中有21個(gè)SNPs位于SSC8：35.05～47.54 Mb區(qū)域達(dá)到基因組顯著水平，在SSC2上只有1個(gè)SNP位點(diǎn)達(dá)到染色體顯著水平。通過搜尋顯著相關(guān)SNP所在區(qū)域內(nèi)的注釋基因，發(fā)現(xiàn)了12個(gè)可能影響母豬殺嬰行為的重要位置候選基因。該研究為進(jìn)一步鑒別影響母豬殺嬰行為的主效基因和因果突變位點(diǎn)提供了研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬；全基因組關(guān)聯(lián)分析；母豬殺嬰；候選基因

母豬母性性能的好壞是影響?zhàn)B豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的重要因素。母豬殺嬰行為即母豬在分娩期間或產(chǎn)后24 h之內(nèi)咬傷甚至咬死新生仔豬的行為，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。M.J.Harris等[1]通過對(duì)大規(guī)模的商業(yè)母豬群體調(diào)查發(fā)現(xiàn)約5.3%的初產(chǎn)母豬表現(xiàn)出不同程度的殺嬰行為。在歐洲商業(yè)群體中調(diào)查發(fā)現(xiàn)母豬殺嬰發(fā)生頻率達(dá)到7%～12%，初產(chǎn)母豬發(fā)生頻率更高達(dá)10%～13%[2]。本研究前期在288頭白色杜洛克×二花臉F2母豬中觀察發(fā)現(xiàn)初產(chǎn)母豬殺嬰行為發(fā)生率達(dá)12.8%，分娩前發(fā)生殺嬰行為的母豬會(huì)比母性好的母豬表現(xiàn)得更活躍[1，3-4]，且在產(chǎn)前爬欄行為及產(chǎn)后仔豬照料行為等方面也與正常母豬存在顯著差異[3]。

許多國(guó)內(nèi)外專家致力于母性行為的研究，但是對(duì)母豬殺嬰行為的產(chǎn)生機(jī)制和影響因素還不是很清楚。除了受環(huán)境、激素水平和產(chǎn)仔經(jīng)驗(yàn)等因素影響外，遺傳因素也起很大作用[2]。P.W.Knap等[5]計(jì)算出了母豬殺嬰行為的遺傳力，母女遺傳力為0.4～0.9。H.A.van der Steen等[2]計(jì)算得到相似的母豬殺嬰行為遺傳力，母女遺傳力為0.5～0.9，且具有加性效應(yīng)。E.F.Knol等[6]研究發(fā)現(xiàn)，選擇母性好的母豬能增加仔豬的成活率，并對(duì)仔豬的生長(zhǎng)性狀沒有負(fù)影響。因此，通過對(duì)母豬母性行為的遺傳背景研究，找出影響母豬殺嬰行為的主效基因或相關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記，從而選育出母性優(yōu)良的母豬對(duì)當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)具有重要意義。但目前從豬QTL 數(shù)據(jù)庫(kù) (http：//www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/index/) 可知，定位的與母豬殺嬰相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)較少，不到20個(gè)。C.Y.Chen等[7]通過非參數(shù)連鎖分析(NPL)在白色杜洛克×二花臉F2資源群體中將母豬殺嬰行為QTL定位于2、6、14、15、16和 X號(hào)染色體上，其中X染色體上QTL解釋的表型變異最大，且X染色體上的10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中有7個(gè)達(dá)顯著水平(P<0.01)。此外，在老鼠2號(hào)和7號(hào)染色體上也發(fā)現(xiàn)了與母性殺嬰行為相關(guān)的QTL，且通過比較基因組可知，鼠2號(hào)染色體QTL區(qū)域正好與A.C.Peripato等定位到的6號(hào)染色體QTL區(qū)域一致[8]。C.R.Quilter等[9]通過80個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的全基因組掃描法，利用來自11個(gè)不同商業(yè)品系的119個(gè)殺嬰行為全同胞個(gè)體，定位到4個(gè)與母豬殺嬰行為顯著相關(guān)的QTLs，分別位于豬 2、10 和 X 號(hào)染色體的4個(gè)區(qū)域。隨后C.R.Quilter等[10]利用豬下丘腦和垂體構(gòu)建的cDNA芯片檢測(cè)殺嬰行為的母豬下丘腦基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了52個(gè)差異表達(dá)基因，而這些基因大部分位于之前定位到的QTL置信區(qū)間內(nèi)。但是，基于低密度的微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)成連鎖圖譜在QTL定位上有著很大的不足，它只能鑒別出一些表型效應(yīng)較大的數(shù)量性狀，且發(fā)現(xiàn)QTL的置信區(qū)間往往有數(shù)十個(gè)厘摩之大[11]。近年來，由于高通量基因分型平臺(tái)的技術(shù)迅速發(fā)展，利用高通量SNP芯片進(jìn)行QTL定位在人類、動(dòng)物和植物研究中得以廣泛應(yīng)用[12]。自從豬60K SNP芯片推出以來，已大量采用此項(xiàng)技術(shù)在豬的血液性狀[13-14]、血脂性狀[15]、脂肪酸性狀[16]、胴體性狀[17]、繁殖性狀[18]等進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)性研究。

本研究基于整個(gè)家系信息及60K SNP芯片信息推測(cè)出來自83個(gè)全同胞家系的288頭F2母豬的基因型進(jìn)行母豬殺嬰行為的全基因組關(guān)聯(lián)性分析，為進(jìn)一步鑒別影響母豬殺嬰行為的主效基因和因果突變位點(diǎn)提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

本研究試驗(yàn)動(dòng)物為白色杜洛克×二花臉F2資源家系[19]，二花臉是產(chǎn)仔數(shù)高和母性性能好的中國(guó)地方豬種，而杜洛克是母性性能較差的西方豬種。該資源群體以2頭白色杜洛克豬為父本，17頭二花臉豬為母本，雜交產(chǎn)生F1代，隨機(jī)選取9頭F1公豬和59頭F1母豬自群繁育產(chǎn)生1 912頭F2個(gè)體。本試驗(yàn)的研究對(duì)象是來自83個(gè)全同胞家系的288頭F2母豬。所有動(dòng)物自由采食飲水，并按統(tǒng)一條件飼養(yǎng)。每千克日糧營(yíng)養(yǎng)水平為：粗蛋白16%，消化能13.1 MJ，賴氨酸 0.78%，鈣0.6%，磷0.5%。

1.2殺嬰行為表型測(cè)定

從妊娠后期開始，每個(gè)欄位只養(yǎng)1頭母豬，母豬出現(xiàn)分娩跡象后提供適量的稻草，觀察母豬從分娩開始到分娩結(jié)束24 h內(nèi)咬死或咬傷仔豬的行為。采用0/1法進(jìn)行記錄，在分娩開始后24 h內(nèi)發(fā)生殺嬰行為則記錄為1。

1.3DNA提取及基因型預(yù)測(cè)

采集來自F0、F1和F2個(gè)體的耳組織或尾尖組織，采用常規(guī)的酚/氯仿方法提取DNA。用NANODROP 1000 (Thermo Scientific，USA)測(cè)定DNA濃度和質(zhì)量，質(zhì)檢合格的樣品于-20 ℃冰箱保存。

F0、F1及F2共1 020個(gè)樣本進(jìn)行了60K SNP芯片掃描，但本試驗(yàn)288個(gè)樣品沒有做60K SNP芯片掃描，所以基于整個(gè)家系及掃描個(gè)體的SNP芯片信息推測(cè)出這288個(gè)個(gè)體缺失基因型。定義掃描了60K SNP芯片加微衛(wèi)星的990個(gè)個(gè)體為參考群體，只有微衛(wèi)星的288個(gè)個(gè)體為目標(biāo)群體。首先利用Link PHASE軟件[20]構(gòu)建參考個(gè)體和目標(biāo)個(gè)體192個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的單倍型；其次再利用Beagle[21]和 DAGPHASE[20]軟件構(gòu)建出參考個(gè)體微衛(wèi)星和60K SNP的單倍型；最后，基于微衛(wèi)星間目標(biāo)群體和參考群體之間的IBD，這些缺失個(gè)體的基因型通過CHROMIBD軟件推斷出來。CHROMIBD是基于連鎖和隱馬爾可夫模型預(yù)測(cè)后代和祖先染色體之間IBD的概率[22]，利用祖先的高密度單倍型和后代的IBD概率可推測(cè)出后代缺失個(gè)體的基因型。再運(yùn)用PLINK軟件對(duì)推測(cè)出的基因型結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控，剔除哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)P≤10-6和次等位基因型頻率MAF<0.05的SNP位點(diǎn)。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

本研究采用Bonferroni校正多重檢驗(yàn)確定關(guān)聯(lián)顯著性閾值，染色體顯著性閾值和基因組顯著性閾值分別為1/有效SNP位點(diǎn)數(shù)量和0.05/有效SNP位點(diǎn)數(shù)量。單倍型框的構(gòu)建是用 Haploview version 4.2軟件分析顯著性SNP位點(diǎn)所在的QTL區(qū)域[27]。

1.5位置候選基因搜尋

結(jié)合生理生化及遺傳信息，利用NCBI (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/) 或Ensembl (http：//pre.ensembl.org/Susscrofa/Info/Index/)豬參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋顯著SNP左右5 Mb范圍內(nèi)的候選基因。DAVID (http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)和GenCards (http：//www.genecards.org/)網(wǎng)站用來查找候選基因功能。

2結(jié)果

2.1表型測(cè)定

本研究共觀察了288頭F2母豬的母性行為，其中47頭母豬從分娩開始到分娩結(jié)束24 h內(nèi)有咬死或咬傷仔豬的行為，另241頭母豬有正常母性。

2.2全基因組關(guān)聯(lián)分析

本試驗(yàn)基于整個(gè)家系及60K SNP芯片信息推測(cè)出目標(biāo)個(gè)體的基因型，進(jìn)行豬的全基因組關(guān)聯(lián)性分析，經(jīng)過質(zhì)控后有效的SNPs數(shù)是34 591。在8號(hào)染色體共檢測(cè)到49個(gè)SNPs位點(diǎn)與母豬殺嬰行為顯著相關(guān)(P<2.89E-05，圖1A)，其中達(dá)到基因組顯著水平的SNPs有21個(gè)，位于染色體35.05～47.54 Mb內(nèi)(P<1.45E-06)。針對(duì)SSC8顯著區(qū)域，構(gòu)建了2 Mb (35～37 Mb)大小的單倍型框，結(jié)果，11個(gè)達(dá)到基因組顯著水平的位點(diǎn)落于1.25 Mb大小的一個(gè)單倍型框中(圖2)。此外在2號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了1個(gè)SNP (ASGA0010781) 位點(diǎn)達(dá)到染色體顯著水平(P=1.19E-05)，位于該染色體89.5 Mb區(qū)域(圖1A)。當(dāng)固定8號(hào)染色體顯著性位點(diǎn)ALGA0047534做關(guān)聯(lián)性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)8號(hào)染色體QTL效應(yīng)全部消失(圖1B)，說明這些顯著SNP位于1個(gè)QTL區(qū)域。

2.3位置候選基因

通過NCBI或Ensembl網(wǎng)站，搜尋顯著 SNP左右5 Mb范圍內(nèi)的候選基因，利用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)等分析手段挑選候選基因。在2號(hào)染色體區(qū)域找到2個(gè)候選基因分別是OTP和COX7C。在8號(hào)染色體上35～109 Mb區(qū)域搜尋到10個(gè)位置候選基因分別是SLC30A9、ATP8A1、GABRG1、GABRA2、GABRA4、GABRB1、TDO2、AREG、DCLK2和FGF2 (表1)。

3討論

自從R.J.Klein 等[28]在Science上報(bào)道了關(guān)于視網(wǎng)膜黃斑變性的GWAS研究以來，一系列復(fù)雜疾病的GWAS研究相繼被報(bào)道。豬高密度60K SNP芯片的應(yīng)用為母豬殺嬰行為等復(fù)雜性狀分子機(jī)理的探索提供了重要的方法和途徑。

本研究基于整個(gè)家系信息及60K SNP芯片信息推測(cè)出288頭來自83個(gè)全同胞家系的F2母豬的基因型進(jìn)行母豬殺嬰行為的全基因組關(guān)聯(lián)分析，在SSC2和SSC8上共發(fā)現(xiàn)50個(gè)SNPs與母豬殺嬰行為顯著關(guān)聯(lián)。本研究前期C.Y.Chen等[7]利用194個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)該288頭F2資源家系母豬微衛(wèi)星掃描時(shí)也在SSC2上定位到顯著區(qū)域，但是兩者的位置相差很遠(yuǎn)(>5 Mb)，并且在SSC8上也未定位到顯著區(qū)域。在同一個(gè)群體中不能夠相互驗(yàn)證的原因可能有幾點(diǎn)：其一，分析模型不同，QTL定位分析是基于QTL基因型在兩個(gè)始祖品系中固定且基因型相異這個(gè)假設(shè)基礎(chǔ)上進(jìn)行的，而實(shí)際群體中QTL基因型可能不固定，導(dǎo)致QTL定位無法檢測(cè)到顯著性位點(diǎn)，全基因組關(guān)聯(lián)分析無此假設(shè)，因此GWAS分析能檢測(cè)到QTL基因型在始祖品系中未固定的位點(diǎn)；其二，分析方法不同，GWAS分析中僅考慮的是加性效應(yīng)，而在QTL定位中同時(shí)考慮了加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)；其三，采用的標(biāo)記類型不同，QTL采用的是數(shù)量少、密度低的微衛(wèi)星標(biāo)記，而本研究采用的是高密度豬60K SNP 芯片；最后，本研究是利用整個(gè)家系信息及60K SNP芯片信息推測(cè)出這288頭F2母豬的基因型，雖然準(zhǔn)確率可達(dá)95%[29]，但仍然存在一定的錯(cuò)誤率。

8號(hào)染色體QTL區(qū)域是首次被報(bào)導(dǎo)與母豬殺嬰顯著相關(guān)，達(dá)到基因組顯著水平的有21個(gè)SNPs。針對(duì)SSC8顯著區(qū)域，構(gòu)建了2 Mb大小的單倍型框，在此2 Mb區(qū)域搜尋到兩個(gè)位置候選基因分別是SLC30A9和ATP8A1(表1)。SLC30A9基因是鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白編碼基因，通過GenCards了解到它會(huì)與ESR1基因作用于雌激素受體信號(hào)通路中。ESR1編碼雌激素受體蛋白，在性發(fā)育和生殖功能中起到重要作用。并由于女性雌激素水平比男性更高，這可能也是導(dǎo)致女性焦慮頻率增加的原因[30]。ATP8A1是ATP酶家族成員之一，能夠水解ATP產(chǎn)生能量驅(qū)動(dòng)離子跨膜運(yùn)輸，并且在神經(jīng)細(xì)胞的氨離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性中也有重要作用，能夠降低緊張感[31]。在SSC8：38.7～39.5 Mb區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了GABRG1-GABRA2-GABRA4-GABRB1基因簇(表1)。它們編碼的蛋白是氨基丁酸的不同類型受體，都屬于配體門控離子通道家族，在抑制神經(jīng)傳遞過程中起重要作用。氨基丁酸的受體基因發(fā)生變異會(huì)引起情感性分裂癥和躁郁癥[32-34]。在8號(hào)染色體47 Mb區(qū)域附近，TDO2是一個(gè)強(qiáng)的候選基因(表1)。TDO是色氨酸參與的犬尿氨酸代謝途徑中的限速酶，這種酶能夠控制血漿中色氨酸的濃度，且色氨酸又是5-羥色胺的前體，5-羥色胺是一種神經(jīng)遞質(zhì)，會(huì)參與行為、情緒和沖動(dòng)等過程[35]。如果5-羥色胺發(fā)生機(jī)能障礙會(huì)導(dǎo)致血清素的生物合成發(fā)生變化，這種改變會(huì)引起消極情緒甚至沖動(dòng)行為[36-37]。我們?cè)?號(hào)染色體75和83 Mb區(qū)域附近分別找到兩個(gè)候選基因AREG和DCLK2，但是在SSC8：91.8～95.6 Mb區(qū)域沒有找到有關(guān)母性殺嬰行為的候選基因。在8號(hào)染色體109 Mb區(qū)域，F(xiàn)GF2基因可能與母豬殺嬰行為有關(guān)。FGF2(纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子2)能夠調(diào)節(jié)緊張感，在神經(jīng)細(xì)胞再生和膠質(zhì)細(xì)胞再生過程中起到重要作用，并且FGF2也已被作為治療抑郁癥和焦慮癥潛在的新目標(biāo)[38-39]。

表1F2資源家系母豬殺嬰行為的全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

Table 1The genome-wide association study result of maternal infanticide behavior in F2resource population

此外，2號(hào)染色體顯著區(qū)域與C.R.Quilter等[9]報(bào)導(dǎo)的QTL區(qū)域是一致的，在此區(qū)域發(fā)現(xiàn)OTP和COX7C是強(qiáng)的候選基因。OTP是一個(gè)蛋白編碼基因，參與下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的分化[40]。下丘腦能有效地調(diào)節(jié)控制垂體前葉各種激素的合成和分泌，如調(diào)節(jié)促甲狀腺激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、促性腺激素、生長(zhǎng)激素、催乳素等蛋白質(zhì)和肽類激素的生成和釋放。COX7C(細(xì)胞色素C氧化酶)是COX的第二個(gè)細(xì)胞核內(nèi)基因，受轉(zhuǎn)錄因子YY1的調(diào)控。在神經(jīng)元變化過程中，YY1是一個(gè)與壓力相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的核內(nèi)靶分子[41]。此外，肌肉中細(xì)胞色素C的缺乏也已被證明是與精神分裂癥有關(guān)[42]。

4結(jié)論

本試驗(yàn)記錄了288頭來自全同胞家系F2母豬的殺嬰行為，利用整個(gè)家系信息及60K SNP芯片信息推測(cè)出這些F2母豬的基因型并進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在SSC2和SSC8上共發(fā)現(xiàn)50個(gè)與母豬殺嬰顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位點(diǎn)，其中有21個(gè)SNPs達(dá)到基因組顯著水平。通過搜尋顯著SNP區(qū)域內(nèi)的候選基因及其功能注釋，發(fā)現(xiàn)SLC30A9、ATP8A1、COX7C和OTP等基因是影響母豬殺嬰行為的重要候選基因。

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(編輯郭云雁)

Genome-Wide Association Study on Maternal Infanticide Behavior in Pigs

YANG Hui，F(xiàn)ANG Shao-ming，HUANG Xiao-chang，CHEN Cong-ying*，ZHANG Zhi-yan*

(TheStateKeyLaboratoryforPigGeneticImprovementandProductionTechnology，Nanchang330045，China)

Key words:pig；genome-wide association study；maternal infanticide；candidate gene

Abstract:Maternal infanticide behavior in 288 sows from a White Duroc × Erhualian F2resource population was measured.The aim of the study was to identify the QTL affecting maternal infanticide behavior.According to pedigree information and genotyped samples with 60K chip，we speculated the 60K genotypes of the 288 tested individuals.Furthermore，a genome-wide association study was carried out to identify the significant genomic loci associated with maternal infanticide behavior using GenABEL packages in R software.We detected a total of 50 significant SNPs associated with maternal infanticide behavior on SSC2 and SSC8.Totally 21 SNPs on SSC8：35.05-47.54 Mb reached the genome-wide significant level.Only 1 SNP on SSC2：89.5 Mb reached the suggestive significance.The candidate genes around significant SNPs were searched based on its functional annotations.A total of 12 genes were found to be the most important candidate genes for maternal infanticide behavior.This study provided a foundation for identification of major gene or causative mutation influencing the maternal infanticide behavior.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.005

收稿日期：2015-03-06

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(30760164)；江西省自然科學(xué)基金(2008GQN0031)

作者簡(jiǎn)介：楊慧(1989-)，女，江西彭澤人，博士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：389846652@qq.com *通信作者：陳從英，研究員，E-mail：chcy75@hotmail.com；張志燕，博士，Tel/Fax：0791-83813080，E-mail：bioducklily@hotmail.com

中圖分類號(hào)：S828；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)02-0241-08