李　莉，柳夢琪，胡佩瑩，張勤文，俞紅賢，荊海霞

(青海大學農(nóng)牧學院，西寧810016)

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大通牦牛胎盤與胎兒組織線粒體SDH基因分析

李莉，柳夢琪，胡佩瑩，張勤文，俞紅賢*，荊海霞

(青海大學農(nóng)牧學院，西寧810016)

摘要：旨在探討高原低氧環(huán)境下大通牦牛發(fā)育早期線粒體標志酶-琥珀酸脫氫酶(SDH)在不同組織中的表達模式。本研究以大通牦牛妊娠4月齡牦牛及出生1日齡犢牦牛為研究對象，采用實時熒光定量PCR技術對牦牛胎盤組織，4月齡胎兒和出生1日齡犢牦牛的心肌、骨骼肌、肝和大腦組織中SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個亞基mRNA定量表達進行測定，研究不同組織線粒體中SDHmRNA表達量與其組織器官能量代謝的相關性。結果顯示：出生1日齡犢牦牛心肌組織線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個亞基mRNA表達量均顯著高于4月齡胎兒；4月齡胎兒大腦組織線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個亞基mRNA表達量均顯著高于出生1日齡犢牦牛。綜上表明：SDH基因表達模式表現(xiàn)為4月齡胎兒大腦組織和出生1日齡犢牦牛心肌組織中SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個亞基轉錄水平均表現(xiàn)為上調(diào)表達，表明4月齡胎兒大腦組織和出生1日齡犢牦牛心肌組織能量代謝調(diào)控活動旺盛。

關鍵詞：大通牦牛；線粒體；SDH；mRNA表達模式

大通牦牛是利用青海省特有野牦牛遺傳資源培育成功的第一個國家級牦牛新品種，具有生長發(fā)育速度快、生產(chǎn)性能高、繁殖性能好、遺傳性能穩(wěn)定和抗逆性能較強等特點，突出表現(xiàn)為越冬死亡率低[1]。動物在胎兒早期的發(fā)育中就可受到環(huán)境因素的影響，此時胎兒會采取“預測適應反應”(Predictive adaptive responses)。胎兒對其將來生存環(huán)境的預測正確與否，決定健康與否或疾病的發(fā)生[2]。環(huán)境對胎兒期造成的影響直接影響著生物體將來對環(huán)境的適應能力，因此，對牦牛發(fā)育早期適應高原低氧機制進行研究顯得尤為重要。線粒體是細胞呼吸和產(chǎn)生ATP 的主要部位，在維持細胞正常能量代謝結構和功能方面具有重要作用。琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase，SDH)是線粒體內(nèi)膜的標志酶，與黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)共價結合的復合酶，是三羧酸循環(huán)與電子傳遞鏈的功能性成分，由SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個亞基構成[3]。SDH的活性和線粒體數(shù)目平行升降，與能量的生成有著密切的關系，并可間接反映線粒體功能和組織的供氧情況[4]。本試驗對大通牦牛母體胎盤、妊娠4月齡胎兒和出生1日齡犢牦牛心肌、骨骼肌、肝及大腦組織線粒體中SDHmRNA進行定量表達測定，分析其基因SDHA、SDHB、SDHC和SDHD的mRNA表達量與其組織器官發(fā)育能量代謝調(diào)控活動的關系，為探討大通牦牛高原低氧環(huán)境適應的生長調(diào)控機理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料來源及處理

由青海省大通種牛場(海拔3 600 m左右)繁育中心提供臨床健康牦牛(妊娠4月齡)和犢牦牛(出生1日齡)各5頭份，屠宰后迅速采集牦牛胎盤組織，胎兒和犢牦牛的心肌、骨骼肌、肝和大腦組織，樣品液氮速凍，-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要儀器和試劑

UV-1600型紫外可見分光光度計(上海美普達儀器有限公司)，PCR擴增儀(BIO-RAD)，紫外凝膠成像儀(Bio-Rad Gel Doc XR+)，iQTM5 Multicolor Real-Time PCR Detection System(BIO-RAD)。Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit，Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)，pMDTM19-TVector Cloning Kit，Quick CutTMEcoR I和SYBR Green PremixTaq酶(TaKaRa公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，Solarbio瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(索萊寶公司)。

1.3方法

1.3.1熒光定量PCR引物設計合成根據(jù)美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)查詢得到牛(Bostaurus)線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHD基因的mRNA序列(4個亞基基因登錄號依次為NM_174178.2、 NM_001040483.1、NM_175814.3和NM_174179.2)，利用primer 5.0和DNAMAN在序列保守區(qū)設計引物，交由上海生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物合成(表1)。

表1熒光定量PCR引物序列

Table 1Primer sequences for fluorescent quantitative PCR

1.3.2總RNA的提取及cDNA第一鏈合成用Trizol 法抽提總RNA，紫外分光光度法測定其濃度及純度，并用變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。參照Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit指導說明進行cDNA第一鏈合成。

1.3.3常規(guī)PCR獲取目的基因序列以反轉錄產(chǎn)物為模板進行PCR擴增反應。25 μL反應體系：模板1.0 μL，上游引物(10 μmol·L-1) 1.0 μL，下游引物(10 μmol·L-1) 1.0 μL，滅菌ddH2O 9.5 μL，PremixTaq酶12.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃3 min；98 ℃10 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃1 min，進行30個循環(huán)；72 ℃5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4重組標準品質(zhì)粒制備按照Solarbio瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的操作說明，對PCR擴增片段進行PCR產(chǎn)物純化，將純化產(chǎn)物與pMDTM19-T在 16 ℃條件下連接1 h。后經(jīng)42 ℃熱擊及冰浴等反應與E.coilDH5α感受態(tài)細胞進行連接，將菌液均勻涂布于Amp、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃溫箱中培養(yǎng)12 h進行藍白斑篩選，在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)12 h。利用PMD?19-T vector通用引物對菌液進行PCR初步鑒定后，對陽性轉化子進行測序以進一步驗證。

1.3.5Real-time PCR將標準品重組質(zhì)粒進行10倍系列稀釋作為標準品，參照SYBR Green Premix Taq試劑指導說明，在專用的 PCR板(96孔)中加樣體系：SYBR Premix TaqII 12.5 μL 上、下游引物各1.0 μL 模板2.0 μL ddH2O 8.5 μL。在Real-time PCR擴增儀上擴增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，78 ℃ 1 s。首先將反轉錄產(chǎn)物cDNA上機后進行1個循環(huán)，使cDNA由單鏈變?yōu)殡p鏈，后與標準品進行30個循環(huán)。其中待測樣品設置3個重復，反應結束后，計算機自動得到標準曲線。

1.3.6數(shù)據(jù)處理根據(jù)標準曲線獲得SDHA、SDHB、SDHC和SDHDmRNA表達量數(shù)據(jù)，采用SPSS 17.0 版Duncan’s多重比較 (P=0.05)。所有結果均以“平均值±標準差 (Mean±SD)”表示。

2結果

2.1RT-PCR獲得目的基因片段

通過RT-PCR獲得目的基因片段，擴增后的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得大約100～300 bp的目的條帶，序列測定結果驗證獲得的目的條帶同原始序列的同源性。如圖1、圖2、圖3和圖4分別是SDHA、SDHB、SDHC和SDHD基因擴增條帶。

2.2熒光定量標準曲線

表2結果顯示，SDHA重組質(zhì)粒標準曲線：y=-3.396 8x+51.543，相關系數(shù)R2=99.96%，SDHB重組質(zhì)粒標準曲線：y=-3.225 7x+47.546，相關系數(shù)R2=99.83%。SDHC重組質(zhì)粒標準曲線：y=-3.357 4x+49.138，相關系數(shù)R2=99.57%，SDHD重組質(zhì)粒標準曲線：y=-3.352 3x+53.440，相關系數(shù)R2=99.96%。說明產(chǎn)物特異性擴增的重復性較好。

表2重組質(zhì)粒的標準曲線及相關系數(shù)

Table 2The standard curve and the correlation coefficient of recombinant plasmid

2.3大通牦牛組織線粒體中SDHA、SDHB、SDHC和SDHDmRNA表達量分析

妊娠4月齡母體胎盤組織、4月齡胎兒和出生1日齡犢牦牛骨骼肌、心肌、肝和大腦組織線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHDmRNA表達量分析結果見表3。妊娠4月齡胎盤組織線粒體SDH4個亞基mRNA表達量由高到低依次為SDHA、SDHB、SDHC和SDHD；4月齡胎兒大腦組織線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHDmRNA表達量均顯著高于出生1日齡犢牦牛；出生1日齡犢牦牛心肌線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHDmRNA表達量均顯著高于4月齡胎兒。

3討論

實時定量PCR是快速定量mRNA轉錄水平的可靠方法。為了準確比較不同樣本mRNA轉錄水平，在不同樣本之間一般用內(nèi)參基因調(diào)整mRNA水平，比較牛在不同發(fā)育階段不同基因在不同組織中的表達穩(wěn)定性，不同組織的合適內(nèi)參基因不同[5-7]，因此制作了標準曲線來比較大通牦牛不同組織SDH基因表達情況。

SDH是三羧酸循環(huán)與電子傳遞鏈的功能性成分，是有氧代謝的標志酶，對于研究低氧環(huán)境下動物適應性氧化呼吸代謝等具有重要意義。其結構亞基SDHC和SDHD將催化亞基SDHA和SDHB錨定在線粒體內(nèi)膜上，催化琥珀酸氧化為延胡索酸。胎盤在低氧環(huán)境下會發(fā)生形態(tài)學變化[8-9]，牛可以通過多種方式影響胎盤轉運功能，如在妊娠中期牛子宮阜DNA含量保持相對平衡，胎盤轉運血液的供應[10-11]。本試驗結果顯示妊娠4月齡胎盤組織線粒體SDH4個亞基mRNA表達量由高到低依次為SDHA、SDHB、SDHC和SDHD。

高海拔低氧對線粒體的影響已有研究[12]，短期處于高海拔低氧環(huán)境降低參與三羧酸(TCA)循環(huán)的酶濃度，但不影響骨骼肌線粒體功能的完整程度[13]，而永久低氧刺激的高海拔人群(藏族和克丘亞族)中已經(jīng)形成了大量有效的進化性適應[14-16]。李莉等[17]研究表明：隨著海拔梯度的升高，高海拔地區(qū)牦牛心肌、骨骼肌中SDH 酶活性明顯升高，表明牦牛肌組織線粒體中SDH 的增加加速了細胞三羧酸循環(huán)的速度以適應低氧環(huán)境中的有氧代謝及能量供應，肌組織有氧代謝能力均增強。林偉山等[18]對大通牦牛胎盤-胎兒組織線粒體SDH、CCO 和ATP 酶活性的測定結果顯示，牦牛在發(fā)育早期組織線粒體中SDH活性保持相對穩(wěn)定的水平。4月齡胎兒生長發(fā)育到出生1日齡犢牦牛階段，外界的生存環(huán)境對心肌是重要的刺激因素，本試驗結果表明：出生1日齡犢牦牛心肌組織線粒體SDH4個亞基mRNA表達量均顯著高于4月齡胎兒，這可能與出生后氧應激對心肌組織的供氧供能作用有關。4月齡胎兒大腦組織線粒體SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個亞基mRNA表達量均顯著高于出生1日齡牦牛，表明妊娠4月齡胎兒大腦能量代謝調(diào)控活動旺盛。

表3大通牦牛胎盤與胎兒組織cDNA樣品中SDHA、SDHB、SDHC、SDHD基因表達量

Table 3SDHA，SDHB，SDHCandSDHDgenes expression quantity in Datong yak placenta and fetus tissue cDNA samples

上標不同字母表示差異顯著(P<0.05)，小寫字母代表大通牦牛處于同一時期不同組織基因表達量比較，大寫字母代表大通牦牛不同時期相同組織基因表達量比較(P<0.05)，同時有兩個相同字母表示差異極顯著(P<0.01)

Different letters in the same row means significant difference between the treatments(P<0.05)，Different capital letter are represented expression quantity of the same tissue in different stages(P<0.05).Writing 2 same letters to represent treatments are extremely remarkable(P<0.01)

4結論

在高原低氧環(huán)境下，大通牦牛在不同發(fā)育階段不同組織線粒體SDH亞基mRNA轉錄水平不同，SDH基因模式表現(xiàn)為4月齡胎兒大腦組織和出生1日齡心肌組織中SDHA、SDHB、SDHC和SDHD4個亞基轉錄水平均表現(xiàn)為上調(diào)表達，表明4月齡胎兒大腦組織和出生1日齡犢牦牛心肌組織能量代謝調(diào)控活動旺盛。

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(編輯程金華)

The Succinate Dehydrogenase Genetic Analysis of Placenta and Fetus Tissue Mitochondria in Datong Yak

LI Li，LIU Meng-qi，HU Pei-ying，ZHANG Qin-wen，YU Hong-xian*，JING Hai-xia

(AgricultureandAnimalHusbandryCollegeofQinghaiUniversity，Xining810016，China)

Key words:Datong yak；mitochondria；SDH；mRNA expression pattern

Abstract:The expression patterns of mitochondrial marker-succinate dehydrogenase(SDH) in different tissues of Datong yak at early development stage were investigated under the plateau hypoxia environment.Pregnant yaks at 4-month-old and yaks at 1-day-old were sampled，genetic mRNA expression quantities (SDHA，SDHB，SDHCandSDHD) of placental tissues，cardiac muscle，skeletal muscle，liver and brain tissues of fetuses at 4-month-old and yaks at 1-day-old were determined using qRT-PCR，the correlation between mitochondrialSDHmRNA expression qualities and energy metabolism in different organs and tissues were researched.The results showed that cardiac muscle mitochondrial genetic mRNA expression quantities (SDHA，SDHB，SDHCandSDHD) of yaks at 1-day-old were significantly higher than those of fetuses at 4-month-old，cerebral mitochondrial genetic mRNA expression quantities (SDHA，SDHB，SDHCandSDHD) of fetuses at 4-month-old were significantly higher than those of yaks at 1-day-old.SDHgene expression patterns suggested that gene (SDHA，SDHB，SDHCandSDHD) transcription levels were up-regulated expression between the brain of fetus at 4-month-old and cardiac muscle of yak at 1-day-old，which was reflected on exuberant energy metabolism regulation activities between the brain of fetus at 4-month-old and cardiac muscle of yak at 1-day-old.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.010

收稿日期：2015-06-25

基金項目：國家自然科學基金項目資助(31160489；31460643)；青海省科技廳項目資助(2013-Z-712)

作者簡介：李莉(1969-)，女，青海西寧人，教授，碩士，主要從事高原動物低氧適應性研究，E-mail：llqhdx@163.com *通信作者：俞紅賢，E-mail：yhx@qhu.edu.cn

中圖分類號：S823.8+5.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0284-06