李　凱，高　立，祁小樂，高宏雷，高玉龍，王永強，王笑梅

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，禽免疫抑制病研究團隊，哈爾濱 150001)

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禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒感染對SPF雞免疫器官和疫苗免疫效果的影響

李凱，高立，祁小樂，高宏雷，高玉龍，王永強，王笑梅*

(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，禽免疫抑制病研究團隊，哈爾濱 150001)

摘要：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(RE)是禽類的一種重要免疫抑制性疾病，目前對其造成免疫抑制的機制尚不十分清楚。本研究對實驗室分離的一株REV流行毒株(HLJR0901株)感染1日齡SPF雞后對感染雞免疫器官和免疫功能造成的影響進行研究。結(jié)果表明，1日齡SPF雞感染REV后出現(xiàn)生長遲緩，法氏囊、胸腺萎縮，脾腫大的癥狀。感染雞出現(xiàn)法氏囊濾泡淋巴細胞大量壞死減少，間質(zhì)結(jié)締組織增生；胸腺出血，胸腺小體增多；脾小結(jié)明顯萎縮，淋巴細胞減少等病理變化。熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，病毒在感染雞法氏囊、胸腺和脾內(nèi)均有分布，且持續(xù)存在。SPF雞感染REV后出現(xiàn)嚴重的免疫抑制，使AIV滅活疫苗和NDV弱毒疫苗的免疫效果顯著下降。本研究為闡明REV的免疫抑制機制提供了重要的實驗數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生??；致病性；免疫器官；免疫抑制

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(reticuloendotheliosis，RE)是由網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)群的反轉(zhuǎn)錄病毒引起的雞、鴨、火雞和其他禽類的一群病理綜合征[1-2]。近年來，REV已在全球范圍內(nèi)流行，國內(nèi)雞群中REV的感染也非常嚴重，分布日益廣泛[3-5]。其中，在出現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)的雞群REV的檢出率要比正常雞群高很多。本實驗室在之前研究中成功在黑龍江省分離到一株REV流行毒株——HLJR0901株[6]。該毒株除與中國早期分離株HA9901親緣關(guān)系較遠外，與中國其他分離株、美國分離株以及從污染疫苗中分離的REV毒株均具有很高的同源性[7]。本研究對1日齡SPF雞以不同劑量人工感染REV(HLJR0901株)，通過對感染雞生長發(fā)育、免疫器官、免疫功能以及體內(nèi)病毒分布進行檢測，系統(tǒng)分析了REV早期感染造成的影響，為REV引起的免疫抑制機制的研究提供了重要的數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株和實驗動物

REV HLJR0901株由本實驗室分離鑒定；SPF雞購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.2主要試劑

Hot Start ExTaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司，組織DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司，引物和探針由Invitrogen公司合成。

1.3REV感染試驗

取1日齡SPF雞120只，分為3組，每組40只。組1攻毒REV HLJR0901株102TCID50·只-1，組2攻毒REV HLJR0901株104TCID50·只-1，組3為PBS對照組。攻毒途徑為腹腔注射，0.1 mL·只-1。試驗前采血檢測REV抗體滴度。攻毒后每周每組取5只雞，稱重，剖檢并采集法氏囊、胸腺、脾，稱取各器官重量，計算器官指數(shù)。器官體重比=(器官重量/體重)×1 000；器官指數(shù)=試驗組雞的器官體重比/對照組雞器官體重比的平均值。當器官指數(shù)≥1.3時判為該器官腫大，器官指數(shù)≤0.7時判為萎縮，0.7<器官指數(shù)<1.3時判為此器官無明顯變化。采集的各器官分為兩部分，一部分用于檢測病理變化，另一部分保存于-70 ℃，用于DNA提取和病毒載量檢測。

1.4免疫抑制試驗

取1日齡SPF雞60只，分為3組，每組20只。組1攻毒REV HLJR0901株102TCID50·只-1，組2攻毒REV HLJR0901株104TCID50·只-1，組3為PBS對照組。攻毒后感染雞分別于7日齡、21日齡免疫NDV LaSota弱毒疫苗(購自哈爾濱維科公司)，于14日齡免疫AIV H5滅活疫苗(購自哈爾濱維科公司)，根據(jù)說明書劑量和操作進行。免疫后各周采血，檢測NDV和AIV HI抗體效價，直到免疫后8周。

1.5病理變化

采集的各組織經(jīng)固定和石蠟包埋后制作病理切片，HE染色鏡檢，觀察組織病理學變化。根據(jù)各器官病理變化的不同程度，對其進行組織病理學打分：0，沒有任何病變；1，散在的或部分濾泡病變；2，小于或等于25%的細胞發(fā)生病變；3，小于或等于50%的細胞發(fā)生病變；4，50%～75%的細胞發(fā)生病變；5，75%～100%的細胞發(fā)生病變。每周對每個試驗組采集的5只試驗雞的法氏囊、胸腺、脾分別制備切片觀察、打分，最后統(tǒng)計每周各器官病變的平均值。

1.6病毒載量測定

提取組織DNA，用本實驗室建立的Real-time PCR方法檢測各試驗組雞各器官的病毒載量[8]。對于每一份提取DNA樣品，同時檢測gp90目的基因和β-actin內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，所得結(jié)果換算為每克組織中所含有的病毒載量。

1.7統(tǒng)計學分析

2結(jié)果

2.1REV感染對SPF雞體重和器官指數(shù)的影響

1日齡SPF雞感染REV后，從第2周開始表現(xiàn)生長遲緩的癥狀，而且日趨明顯，與對照組相比差異顯著(P<0.05)；104TCID50感染組雞在第4、6、7、8周體重均低于102TCID50感染組，差異顯著(P<0.05)。與對照組相比，感染雞從第2周開始法氏囊出現(xiàn)明顯萎縮，104TCID50感染組自第5周開始法氏囊指數(shù)顯著低于102TCID50感染組(P<0.05)。胸腺于感染后1周出現(xiàn)腫大癥狀，第2周開始呈現(xiàn)明顯萎縮(P<0.05)，104TCID50組自第6周開始胸腺指數(shù)顯著低于102TCID50組(P<0.05)。脾于感染后第2周開始出現(xiàn)腫大癥狀(P<0.05)，不同劑量組之間差異不顯著(P>0.05)(圖1)。

2.2REV感染對SPF雞的病理損傷

如圖2所示，102TCID50感染組法氏囊實質(zhì)內(nèi)淋巴細胞出現(xiàn)輕度減少；胸腺局部出血、輕度淤血、髓質(zhì)內(nèi)的胸腺小體擴張、內(nèi)有均質(zhì)嗜酸性染色的崩解產(chǎn)物(箭頭所示)；脾無明顯病理變化。法氏囊較嚴重病變出現(xiàn)在感染4周以后，胸腺的嚴重病變出現(xiàn)在感染6周以后(表1)。對104TCID50劑量組的病理學檢測發(fā)現(xiàn)，法氏囊部分濾泡的淋巴細胞大量壞死、減少，間質(zhì)結(jié)締組織增生；胸腺出現(xiàn)局部出血，輕度淤血，胸腺小體增多(箭頭所示)；脾內(nèi)脾小結(jié)明顯萎縮，淋巴細胞減少。法氏囊和胸腺的嚴重病變分別出現(xiàn)在感染后4周和5周之后。

表1感染REV的SPF雞免疫器官病變打分

Table 1Pathological score of immune organs from the chickens infected with REV

2.3REV感染SPF雞后各免疫器官的病毒載量

1日齡SPF雞感染不同劑量REV后，從第1周開始即可在法氏囊、胸腺和脾內(nèi)檢測到病毒，不同組織的病毒載量在各時間點無顯著差異(P>0.05)(圖3)。感染后1周，102和104TCID50試驗組的組織平均病毒載量分別為106.82copies·g-1和108.54copies·g-1，差異顯著(P<0.05)；從感染后2周至試驗結(jié)束，兩感染劑量組的病毒載量差異不顯著(P>0.05)。

2.4REV感染對NDV和AIV疫苗免疫效果的影響

1日齡SPF雞感染REV后，對感染雞免疫NDV LaSota弱毒疫苗和AIV H5滅活疫苗，免疫后檢測HI抗體滴度。從圖4可以看出，NDV弱毒疫苗免疫后1周，兩個REV感染組的NDV HI抗體滴度就顯著低于未感染組(P<0.05)，隨免疫后時間的延長，免疫抑制作用更為顯著。AIV滅活疫苗免疫后2周，REV感染組的AIV抗體滴度顯著低于未感染組(P<0.05)，兩個感染組的免疫抑制狀態(tài)一直持續(xù)至試驗結(jié)束。104TCID50感染組與102TCID50感染組相比，NDV和AIV抗體滴度降低得更加明顯(P<0.05)。

3討論

REV是禽類除馬立克病病毒、禽白血病病毒之外的第三種重要的致瘤性病毒，同時也是一種重要的禽免疫抑制性病毒[1]。世界上第一個REV分離株T株是1958年在英國分離達到的[1]。中國于1986年在南京分離到了第一株REV毒株C45株[9]。隨后，REV在中國的分布日益廣泛，呈現(xiàn)持續(xù)流行的趨勢。目前該病已成世界性分布，在各大洲都有流行[1]。研究表明，馬立克病病毒、雞傳染性貧血病毒和REV等免疫抑制性病毒在生產(chǎn)雞群中的混合感染是導致當前養(yǎng)禽業(yè)免疫失敗和生產(chǎn)性能下降的重要因素之一[10]。

免疫抑制是指由于各種因素作用，使機體對抗原的應(yīng)答能力低下甚至喪失的現(xiàn)象[11]。REV本身對禽的致死力不明顯，但其能夠損害機體的免疫系統(tǒng)，使機體的免疫功能下降，從而易遭受其他病原的侵襲。當REV與其他病毒發(fā)生混合感染時，病毒間可相互發(fā)生作用，加重病情[12]。近年來，中國的雞群為預防NDV和AIV的發(fā)生采取了非常強化的免疫程序，但是仍有少數(shù)雞群發(fā)病，免疫失敗的現(xiàn)象也時有發(fā)生，這在一定程度上是由于雞群中免疫抑制性病毒的感染造成的。

REV是禽類的一種重要免疫抑制性病毒，目前對其造成免疫抑制的機制尚不十分清楚。研究發(fā)現(xiàn)，REV感染1日齡SPF雞可以造成T、B淋巴細胞數(shù)目的顯著下降[13]。本研究也表明，SPF雞感染REV后兩周開始，法氏囊和胸腺就開始呈現(xiàn)萎縮，脾呈現(xiàn)腫大癥狀，并可見淋巴細胞壞死減少等組織病理損傷。對REV-A和雞合胞體病毒形成的嵌合病毒研究表明，REV-A的gag和env兩個基因片段與其較強的免疫抑制能力有關(guān)[14]。感染REV-T株的雞，其脾細胞對促有絲分裂原和植物血凝素的應(yīng)答能力受到抑制，這種抑制與REV-A有關(guān)，而且是由抑制性細胞群所介導的[15]。

本研究結(jié)果表明，REV早期感染導致NDV弱毒疫苗和AIV滅活疫苗的免疫效果顯著降低；感染雞不僅平均抗體水平較低，而且個體間差異明顯，個別雞甚至檢測不到抗體反應(yīng)；而且這種免疫抑制狀態(tài)可以持續(xù)存在，即使加強免疫也無法消除。對病毒載量的檢測發(fā)現(xiàn)，REV感染1日齡SPF雞后一周，就可以在其主要免疫器官中檢測到大量的病毒，并可以持續(xù)存在，這可能是其造成持續(xù)的免疫抑制的原因之一。研究進一步表明，100個TCID50低劑量的REV感染就可以導致上述顯著的免疫抑制，高劑量(104TCID50)REV感染造成的癥狀、病理損傷和免疫抑制現(xiàn)象更為顯著。以上數(shù)據(jù)揭示了當前REV在現(xiàn)地的廣泛流行可能是造成多種疫苗免疫失敗的重要因素，從而表明中國雞群中A類病毒性疾病的預防不僅需要改進這些病的疫苗和加強免疫程序，還需要進一步控制雞群中免疫抑制性病毒的感染。同時，本研究也為進一步闡明REV的免疫抑制機制提供了重要的試驗數(shù)據(jù)。

參考文獻(References)：

[1]SAIF Y M.禽病學[M].蘇敬良，高福，索勛，譯.12版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012：578-591.

SAIF Y M.Avain disease[M].SU J L，GAO F，SUO X，translated.12ed.Beijing：China Agrichulture Press，2012：578-591.(in Chinese)

[2]CHENG W H，HUANG Y P，WANG C H.Serological and virological surveys of reticuloendotheliosis in chickens in Taiwan[J].JVetMedSci，2006，68(12)：1315-1320.

[3]胡北俠，黃艷艷，路希山，等.肉種禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥、雞傳染性貧血和禽白血病血清學調(diào)查[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2009，34(1)：25-27.

HU B X，HUANG Y Y，LU X S，et al.Serological surveys on antibodies against avian reticuloendotheliosis virus，chicken anemia virus and avian leucosis virus in meat-type breeding chickens[J].GuangdongJournalofAnimalandVeterinaryScience，2009，34(1)：25-27.(in Chinese)

[4]姜世金，孟珊珊，崔治中，等.我國自然發(fā)病雞群中MDV、REV和CAV共感染的檢測[J].中國病毒學，2005，20(2)：164-167.

JIANG S J，MENG S S，CUI Z Z，et al.Epidemic investigation of co-infection of MDV，CAV and REV in spontaneous diseased chicken flocks in China[J].VirologicaSinica，2005，20(2)：164-167.(in Chinese)

[5]CHENG Z，SHI Y，ZHANG L，et al.Occurrence of reticuloendotheliosis in Chinese partridge[J].JVetMedSci，2007，69(12)：1295-1298.

[6]鄧小蕓，祁小樂，高玉龍，等.禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的分離鑒定及其體外復制研究[J].中國動物傳染病學報，2010，18(1)：23-27.

DENG X Y，QI X L，GAO Y L，et al.Identification and replication of reticuloendotheliosis virus[J].ChineseJournalofAnimalInfectiousDiseases，2010，18(1)：23-27.(in Chinese)

[7]鄧小蕓，祁小樂，高宏雷，等.網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒HLJR0901株全基因組的克隆及序列分析[J].中國獸醫(yī)科學，2010，40(7)：667-672.

DENG X Y，QI X L，GAO H L，et al.Cloning and sequence analysis of full-length genome of reticuloendotheliosis virus HLJR0901 strain[J].ChineseVeterinaryScience，2010，40(7)：667-672.(in Chinese)

[8]LI K，GAO H L，GAO L，et al.Development of TaqMan real-time PCR assay for detection and quantitation of reticuloendotheliosis virus[J].JVirolMethods，2012，179(2)：402-408.

[9]何宏虎，陳溥言，蔡寶祥.禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病病毒的分離鑒定[J].中國畜禽傳染病，1988(2)：1-3.

HE H H，CHEN F Y，CAI B X.Isolation and identification of reticuloendotheliosis virus[J].ChineseAnimalInfectiousDiseases，1988(2)：1-3.(in Chinese)

[10]李延鵬，崔治中，姜世金，等.CAV與REV共感染SPF雞對疫苗免疫反應(yīng)的抑制作用[J].中國獸醫(yī)學報，2008，28(11)：1243-1246.

LI Y P，CUI Z Z，JIANG S J，et al.Synergic inhibitory effect of co-infection of CAV and REV on immune responses to vaccines in SPF chickens[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2008，28(11)：1243-1246.(in Chinese)

[11]馬春霞，鄭世民.禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒分子生物學特性及其免疫抑制機理[J].中國家禽，2007，29(22)：35-37.

MA C X，ZHENG S M.Molecular characteristics and the mechanisms of the immunosuppression of reticuloendotheliosis virus[J].ChinaPoultry，2007，29(22)：35-37.(in Chinese)

[12]孟珊珊，崔治中，孫淑紅.REV和ALV-J共感染雞病毒血癥及抗體反應(yīng)的相互影響[J].中國獸醫(yī)學報，2006，26(4)：363-366.

MENG S S，CUI Z Z，SUN S H.Interaction of virema and antibody in chickens coinfected with REV and ALV-J[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2006，26(4)：363-366.(in Chinese)

[13]阿合買提·買買提，劉忠貴，楊麗萍.感染REV 雛雞免疫器官中抗體生成細胞的動態(tài)變化[J].中國獸醫(yī)雜志，2001，37(11)：15-16.

AHMT M，LIU Z G，YANG L P.Dramatic changes of the antibody producing cells in the immune organs of chickens infected with reticuloendotheliosis virus[J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine，2001，37(11)：15-16.(in Chinese)

[14]FILARDO E J，LEE M F，HUMPHRIES E H.Structural genes，not the LTRs，are the primary determinants of reticuloendotheliosis virus A-induced runting and bursal atrophy[J].Virology，1994，202(1)：116-128.

[15]CARPENTER C R，BOSE H R，RUBIN A S.Contact-mediated suppression of mitogen-induced responsiveness by spleen cells in reticuloendotheliosis virus-induced tumorigenesis[J].CellImmunol，1977，33(2)：392-401.

(編輯白永平)

The Influence of Reticuloendotheliosis Virus Infection on Immune Organs and Immune Efficacy in SPF Chickens

LI Kai，GAO Li，QI Xiao-le，GAO Hong-lei，GAO Yu-long，WANG Yong-qiang，WANG Xiao-mei*

(PoultryImmunosuppressiveDiseaseTeam，StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China)

Key words:reticuloendotheliosis；pathogenicity；immune organs；immunosuppression

Abstract:Reticuloendotheliosis(RE) is an important avian immunosuppressive disease with the mechanism of the immunosuppression barely known.In this study，the influence of a REV strain，HLJR0901 isolated in our lab，infection on the immune organs and immunology competence in SFP chickens was examined.Decline in body weight，atrophy in bursa of Fabricius and thymus，and tumefaction in spleen were detected after REV infection.Histopathology study observed several pathological changes in the main immune organs，including the necrosis and number decline of the immune cells and the hyperplasia of the connective tissues in the bursa of Fabricius，the haemorrhagia and increasing of the thymic corpuscle in the thymus，and atrophy of the splenic follicle in the spleen.High proviral loads were detected in the bursa of Fabricius，thymus and spleen with a long persistence.Additionally，the antibody responses to AIV and NDV vaccines were significantly inhibited by REV early infection compared with the control chickens.This study provided important data for illuminating the mechanism of the REV-induced immunosuppression.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.017

收稿日期：2015-03-20

基金項目：國家國際科技合作專項項目(2011DFA32210)；農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2013GB23260577)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(nycytx-42-G3-01)

作者簡介：李凱(1986-)，男，山東泰安人，助理研究員，博士，主要從事動物病毒學研究，E-mail：likai01@caas.cn *通信作者：王笑梅，E-mail：xmw@hvri.ac.cn

中圖分類號：S852.659.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)02-0340-06