武彥昭,張 蘭，熊 晨

·論著·

鈉泵α2亞基介導低濃度哇巴因影響大鼠心室肌細胞收縮力的作用研究

武彥昭,張 蘭，熊 晨

【摘要】背景強心苷類(CGs)藥物臨床治療心力衰竭因其治療窗窄使應用受到很大限制。心肌鈉泵是CGs藥物作用的靶點，然而CGs藥物與鈉泵相互作用的機制仍有待闡明。目前認為，鈉泵的第一個膜外區(qū)H1-H2是哇巴因可能的結(jié)合位點。目的利用作用在抗心肌鈉泵α2亞基H1-H2膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域的多克隆WJS為工具，封閉該結(jié)合位點，有效拮抗哇巴因?qū)︹c泵的抑制作用，比較封閉前后哇巴因?qū)π氖壹〖毎c泵活性的影響及心室肌細胞收縮力、細胞內(nèi)鈣的變化，探討鈉泵與哇巴因的作用機制。方法2013年1月—2015年1月急性分離大鼠心室肌細胞，將心室肌細胞分為4組，1 μmol/L哇巴因組、WJS+1 μmol/L哇巴因組、1 mmol/L哇巴因組、WJS+1 mmol/L哇巴因組。1 μmol/L哇巴因組給予哇巴因(1 μmol/L)進行灌流；WJS+1 μmol/L哇巴因組以WJS(稀釋濃度1∶1 000)孵育心室肌細胞0.5 h后，再給予哇巴因(1 μmol/L)進行灌流；1 mmol/L哇巴因組給予哇巴因(1 mmol/L)進行灌流；WJS+1 mmol/L哇巴因組以WJS(稀釋濃度1∶1 000)孵育心室肌細胞0.5 h后，再給予哇巴因(1 mmol/L)進行灌流。采用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄鈉泵電流(Ip)，觀察WJS對哇巴因抑制Ip作用的影響；采用激光共聚焦顯微鏡測定心室肌細胞游離鈣濃度([Ca2+]i)；采用細胞動緣探測系統(tǒng)測定心室肌細胞收縮力的大小。結(jié)果Western blotting法檢測結(jié)果顯示，純化后的WJS在電泳時分別出現(xiàn)2條清晰的條帶，其分子量均為 110 kD 左右。細胞免疫熒光法測定結(jié)果顯示，WJS均結(jié)合在心室肌細胞鈉泵的膜外區(qū)，而且這種結(jié)合并不被1 μmol/L哇巴因影響，但卻被在H1-H2膜外區(qū)特異性抗原點具有相同成分的多肽阻斷劑RE2取消。WJS+1 μmol/L哇巴因組高親和力鈉泵電流(Iph)低于1 μmol/L哇巴因組(P<0.05)；1 mmol/L哇巴因組、WJS+1 mmol/L哇巴因組Iph高于1 μmol/L哇巴因組和WJS+1 μmol/L哇巴因組，低親和力鈉泵電流(Ipl)低于1 μmol/L哇巴因組和WJS+1 μmol/L哇巴因組(P<0.05)；WJS+1 mmol/L哇巴因組Iph高于1 mmol/L哇巴因組，Ipl低于1 mmol/L哇巴因組(P<0.05)。灌流5、15 min WJS+1 μmol/L哇巴因組心室肌細胞[Ca2+]i低于1 μmol/L哇巴因組(P<0.05)；灌流5、15 min 1 mmol/L哇巴因組、WJS+1 mmol/L哇巴因組心室肌細胞[Ca2+]i高于1 μmol/L哇巴因組和WJS+1 μmol/L哇巴因組(P<0.05)；灌流5、15 min WJS+1 mmol/L哇巴因組心室肌細胞[Ca2+]i高于1 mmol/L哇巴因組(P<0.05)。灌流5、15 min WJS+1 μmol/L哇巴因組心室肌細胞收縮力低于1 μmol/L哇巴因組(P<0.05)；灌流5 min 1 mmol/L哇巴因組、WJS+1 mmol/L哇巴因組心室肌細胞收縮力高于1 μmol/L哇巴因組和WJS+1 μmol/L哇巴因組，灌流15 min心室肌細胞收縮力低于1 μmol/L哇巴因組和WJS+1 μmol/L哇巴因組(P<0.05)；灌流5、15 min WJS+1 mmol/L哇巴因組心室肌細胞收縮力低于1 mmol/L哇巴因組(P<0.05)。結(jié)論抗心肌鈉泵α2亞基H1-H2膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體WJS取消Iph和低濃度哇巴因所致的心室肌細胞收縮力增強作用，表明鈉泵α2亞基介導低濃度哇巴因治療心力衰竭的作用。

充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF)是臨床上極為常見的心血管綜合征，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計全球心力衰竭發(fā)病率為0.5%～2.0%，特別是CHF的患病率呈日益上升趨勢，成為住院、病殘及死亡的主要原因[1]。目前CHF的治療仍以強心苷類(CGs)藥物為主，輔以利尿劑和血管擴張劑等，但CGs藥物有效劑量與中毒劑量接近、不良反應強、治療窗較窄，使其應用受到很大限制。

CGs藥物治療心力衰竭的機制是其抑制衰竭心室肌細胞膜上鈉泵(Na+/K+-ATPase，Na/K pump，NKP)，使細胞內(nèi)Na+增加，通過Na+/Ca2+交換(NCX)，引起細胞內(nèi)Ca2+的升高，并促進肌質(zhì)網(wǎng)對鈣的攝取及隨后的鈣釋放(CICR)。增加的內(nèi)鈣一方面可以增加心室肌細胞收縮力即其治療作用，另一方面當鈣的增加超過了肌質(zhì)網(wǎng)的負荷時則表現(xiàn)為其不良反應[2]。因此，探討CGs藥物如何在減少其不良反應的同時最大限度地發(fā)揮其正性肌力作用是目前亟待解決的問題。

鈉泵由α、β、γ 3個亞基組成，其最小功能單位是αβ異源二聚體[3]。多種配體如內(nèi)源性鈉泵抑制因子哇巴因、ATP、Na+和K+等，在α亞基膜外區(qū)均有結(jié)合位點[4]。α亞基分為4種亞型，其中α1亞基被認為是“管家”亞基，嚙齒類動物α亞基各亞型與CGs藥物如哇巴因的親和力從α1、α2到α3依次升高；但人類α亞基各亞型對哇巴因的親和力均很高，因此容易受到哇巴因的作用[5-6]。催化性α亞基存在10個跨膜結(jié)構(gòu)域(H1～H10)，隨著對心肌的鈉泵結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究的深入，進一步揭示哇巴因結(jié)合在鈉泵的是α亞基而不是β亞基[7]。點突變研究和氨基酸替代實驗證明，將大鼠鈉泵α2亞基H1-H2膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域氨基酸Gln111和Asn122雙突變?yōu)锳sp111和Arg122時，鈉泵對哇巴因的親和力與野生型鈉泵相比下降了千倍[8]。由此推測，鈉泵抑制因子對鈉泵的抑制作用正是通過與鈉泵α2亞基H1-H2膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域氨基酸的結(jié)合實現(xiàn)。提示，鈉泵α2亞基H1-H2膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域是哇巴因的主要結(jié)合位點，說明該結(jié)構(gòu)域?qū)τ谕郯鸵虻淖饔糜兄峭瑢こ５囊饬x。

根據(jù)與CGs藥物的親和力不同，α亞基可分為高親和力亞型和低親和力亞型。其中，α1亞基對CGs藥物的親和力明顯低于α2亞基和α3亞基[9]。例如大鼠心室肌細胞α2亞基僅占11%，給予3×10-7mol/L哇巴因能夠抑制94%的α2亞基和1%的α1亞基，但卻使收縮力增加約40%，說明α2亞基在調(diào)節(jié)心室肌細胞收縮方面發(fā)揮重要作用[10]。文獻報道，鈉泵特別是抑制α2亞基調(diào)節(jié)著哇巴因誘導的心室肌細胞收縮力，而抑制α1亞基則會造成鈣超載和非節(jié)律性收縮[11]，這為治療心力衰竭過程中尋找特異性作用于α2亞基的藥物提供了參考。

因此，本研究利用作用在抗心肌鈉泵α2亞基H1-H2膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體WJS為工具藥，分析其是否參與低濃度哇巴因的正性肌力作用或者特異性作用于α2亞基來尋找更安全的正性肌力作用藥物。

1材料與方法

1.1藥品與試劑哇巴因由美國Sigma公司提供,用二甲基亞砜溶解配成100 mmol/L的母液,貯存于-20 ℃的冰箱中。WJS(LAAMEDEPSNDNGGGSC)以及該結(jié)構(gòu)域多肽RE2(LAAMEDEPSNDNGGGSC)購自杭州華安生物技術(shù)有限公司。臺式液：氯化鈉(NaCl)140.0 mmol/L,氯化鉀(KCl)5.4 mmol/L,氯化鎂(MgCl2)1.0 mmol/L,4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPEs)10.0 mmol/L,D-葡萄糖 10.0 mmol/L,氫氧化鈉(NaOH)調(diào)節(jié)pH值至7.4。KB液：氫氧化鉀(KOH)80.0 mmol/L，KCl 40.0 mmol/L,磷酸二氫鉀(KH2PO4)25.0 mmol/L,硫酸鎂(MgSO4)3.0 mmol/L,L-谷氨酸 50.0 mmol/L,?；撬?Taurine)20.0 mmol/L,HEPEs 10.0 mmol/L,乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)1.0 mmol/L,D-葡萄糖 10.0 mmol/L,KOH調(diào)節(jié)pH值至7.2。上述試劑購自Maverick公司。消化液：含0.6%膠原酶B(collagenase B,Roche)，0.6%牛血清清蛋白(bovine serum albumin，BSA,Maverick)，30 μmol/L Ca2+的上述臺式液。兔抗鼠鈉泵α2亞基多克隆抗體(Santa 公司)；生物素標記的羊抗兔和羊抗鼠 IgG 和辣根酶標記鏈霉卵白素(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierrce)。

本研究創(chuàng)新點：

利用作用在抗心肌鈉泵α2亞基H1-H2膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體WJS為工具，在急性分離的大鼠心室肌細胞上，用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄鈉泵電流(Ip)，觀察WJS對哇巴因抑制Ip作用的影響。并用激光共聚焦顯微鏡測定心室肌細胞內(nèi)游離鈣濃度([Ca2+]i)的大小及利用細胞動緣探測系統(tǒng)測定心室肌細胞收縮力的大小。通過封閉該結(jié)合位點從而有效拮抗哇巴因?qū)︹c泵的抑制作用，比較封閉前后哇巴因?qū)π氖壹〖毎c泵活性的影響及心室肌細胞收縮力、[Ca2+]i的變化，更深入地揭示鈉泵與哇巴因的可能作用機制，結(jié)果表明，高親和力鈉泵α2亞基介導哇巴因治療心力衰竭的作用。使哇巴因強心機制的研究更加深入和全面，既可提高強心苷類藥物治療心力衰竭的安全性，又可開辟尋找心力衰竭治療藥物的新途徑。

1.2實驗動物2013年1月—2015年1月選用清潔級成年雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量220～250 g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)2012-1-003，動物合格證編號：910022。

1.3單個心室肌細胞的急性分離參照文獻[12]采用Langendorff灌流法，大鼠采用1.2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，摘取心臟迅速掛于Langendorff裝置上，以無鈣臺氏液行主動脈逆行灌流，灌流液以純氧飽和,保溫37 ℃左右，灌流速度為5～8 ml/min。2 min后，用含0.33 mg/ml膠原酶的無鈣臺氏液反復灌流，至心臟變軟，取下置于KB液中，剪碎后，用吸管吹打，以200目尼龍網(wǎng)過濾，保留上清液。分離的細胞在KB液中于4 ℃保存?zhèn)溆?。實驗均灌流給藥，在細胞分離后10 h內(nèi)完成。此法可得到80%呈桿狀的成活心室肌細胞。置于室溫待用，2 h后選擇細胞膜光滑、橫紋清晰、貼壁較好、穩(wěn)定無收縮的心室肌細胞用于實驗。

1.4Western blotting法檢測WJS的表達水平將心室肌細胞進行常規(guī) Western blotting法檢測，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離蛋白，采用聚偏氟乙烯(PVDF)膜進行半干轉(zhuǎn)膜，一抗為兔抗鼠鈉泵α2亞基多克隆抗體，二抗為生物素標記的羊抗兔和羊抗鼠IgG，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒顯色，Bio-1D 圖像分析系統(tǒng)分析顯色條帶的吸光度。

1.5細胞免疫熒光法檢測WJS表達用含5% BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS)孵育大鼠心室肌細胞1 h，后用WJS(稀釋濃度1∶1 000)與RE2(1 mmol/L)共同室溫下孵育1 h，用PBS清洗3遍。細胞以1 μmol/L哇巴因灌流15 min。在激發(fā)光波長為495 nm，吸收光波長為520 nm的熒光顯微鏡下觀察免疫熒光細胞。

1.6鈉泵電流(Ip)的測定

1.6.1電極內(nèi)液和細胞外液的配制(1)電極內(nèi)液：氫氧化銫(CsOH)30 mmol/L,氯化四乙銨(TEACl) 20 mmol/L,MgSO45 mmol/L,HEPEs 5 mmol/L,EGTA 11 mmol/L,葡萄糖10 mmol/L，Na2-ATP 5 mmol/L，氯化鈣(CaCl2)1 mmol/L，用CsOH調(diào)節(jié)pH值至7.2。(2)細胞外液：NaCl 137.7 mmol/L,NaOH 2.3 mmol/L,KCl 5.4 mmol/L，MgCl21 mmol/L，HEPEs 5 mmol/L,葡萄糖10 mmol/L，氯化鋇(BaCl2)2 mmol/L，氯化鎘(CdCl2)1 mmol/L，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4。

1.6.2Ip的測定采用全細胞膜片鉗技術(shù)(whole-cell patch-clamp technique)記錄Ip，鈉泵1次主動轉(zhuǎn)運可將3個Na+泵出細胞外，同時泵進2個K+，因而可產(chǎn)生一個純凈的向外電流。在特定的細胞外液和電極內(nèi)液阻斷細胞膜上其他離子通道和交換體電流的條件下(主要是K+電流、Ca2+電流、Na+/Ca2+交換體電流)，灌流鈉泵的抑制劑哇巴因，使膜電流產(chǎn)生內(nèi)向移動，此差別電流反映Ip大小。用微電極拉制器拉制玻璃微電極，電極入液電阻為2～4 MΩ。將心室肌細胞置于浴槽中，灌流細胞外液2 ml/min，選用條紋清晰的桿狀細胞與微電極封接，破膜，待電流平穩(wěn)后，以鈉泵抑制劑哇巴因為工具藥由低到高濃度(1 μmol/L和1 mmol/L)進行灌流，采用Axon 700B放大器將細胞膜電位鉗制在0 mV，采樣率為200 ms/point，記錄全細胞Ip。電流密度即是電流大小與電容之比。由于1 mmol/L哇巴因可以引起最大的Ip，所以以1 mmol/L哇巴因引起的電流大小為100% (即Ipt，總泵電流)，計算1 μmol/L哇巴因抑制百分率。因為高親和力鈉泵電流(Iph)表示由鈉泵α2亞基介導而低親和力鈉泵電流(Ipl)由鈉泵α1亞基介導[13]，據(jù)Ipt=Ipl+Iph，所以Ipl可通過1 μmol/L哇巴因阻斷Iph后由1 mmol/L哇巴因計算。參照文獻[12]，將心室肌細胞分為4組，1 μmol/L哇巴因組、WJS+1 μmol/L哇巴因組、1 mmol/L哇巴因組、WJS+1 mmol/L哇巴因組,每組11個心室肌細胞。1 μmol/L哇巴因組給予哇巴因(1 μmol/L)進行灌流；WJS+1 μmol/L哇巴因組以WJS(稀釋濃度1∶1 000)孵育心室肌細胞0.5 h后，再給予哇巴因(1 μmol/L)進行灌流；1 mmol/L哇巴因組給予哇巴因(1 mmol/L)進行灌流；WJS+1 mmol/L哇巴因組以WJS(稀釋濃度1∶1 000)孵育心室肌細胞0.5 h后，再給予哇巴因(1 mmol/L)進行灌流。比較Ipl、Iph。

1.7激光共聚焦顯微鏡檢測心室肌細胞游離鈣濃度([Ca2+]i)參照文獻[12]，將心室肌細胞分為4組，1 μmol/L哇巴因組、WJS+1 μmol/L哇巴因組、1 mmol/L哇巴因組、WJS+1 mmol/L哇巴因組,每組9個心室肌細胞。1 μmol/L哇巴因組給予哇巴因(1 μmol/L)進行灌流；WJS+1 μmol/L哇巴因組以WJS(稀釋濃度1∶1 000)孵育心室肌細胞0.5 h后，再給予哇巴因(1 μmol/L)進行灌流；1 mmol/L哇巴因組給予哇巴因(1 mmol/L)進行灌流；WJS+1 mmol/L哇巴因組以WJS(稀釋濃度1∶1 000)孵育心室肌細胞0.5 h后，再給予哇巴因(1 mmol/L)進行灌流。結(jié)果用相對熒光密度=(FI-FI0)/FI0×100%表示，其中FI0表示用藥前的熒光密度，F(xiàn)I表示用藥后的熒光密度。所有實驗每5 s掃1張，共50～120張。分別記錄灌流5、15 min時的結(jié)果。

1.8心室肌細胞收縮力檢測采用IonOptix單細胞動緣檢測系統(tǒng)(IonOptix video-based edge-detection)檢測心室肌細胞收縮力。將適量細胞放于浴槽內(nèi)，給予含1.8 mmol/L Ca2+的氧飽和臺氏液灌流10 min，灌流速度1.5 ml/min，通過浴槽兩側(cè)鉑絲電極給予電壓15 V，頻率1 Hz，波寬4 ms的持續(xù)電刺激，在10×物鏡下尋找邊緣清晰、收縮良好的細胞，切換40×物鏡，IonOptix單細胞動緣檢測系統(tǒng)能夠?qū)Ρ粶y細胞進行高速采樣并成像于計算機并實時跟蹤細胞邊緣，實時測定心室肌細胞收縮力。將心室肌細胞分為4組，1 μmol/L哇巴因組、WJS+1 μmol/L哇巴因組、1 mmol/L哇巴因組、WJS+1 mmol/L哇巴因組,每組8個心室肌細胞。1 μmol/L哇巴因組給予哇巴因(1 μmol/L)進行灌流；WJS+1 μmol/L哇巴因組以WJS(稀釋濃度1∶1 000)孵育心室肌細胞0.5 h后，再給予哇巴因(1 μmol/L)進行灌流；1 mmol/L哇巴因組給予哇巴因(1 mmol/L)進行灌流；WJS+1 mmol/L哇巴因組以WJS(稀釋濃度1∶1 000)孵育心室肌細胞0.5 h后，再給予哇巴因(1 mmol/L)進行灌流。分別記錄灌流5、15 min時的結(jié)果。

2結(jié)果

2.1WJS的鑒定(1)WJS濃度及效價：WJS濃度為1.03 mg/ml，效價為1∶240 000。(2)Western blotting法檢測結(jié)果顯示，純化后的WJS在電泳時分別出現(xiàn)2條清晰的條帶，其分子量均為 110 kD 左右(見圖1，本文圖1～3彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。說明WJS能夠像市售鈉泵α2亞基抗體一樣特異性辨認鈉泵α2亞基 H1-H2 膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域，能夠檢測到來自大鼠心室肌細胞的鈉泵α2亞基，表明WJS具有抗鈉泵α2亞基抗體的性質(zhì)。(3)細胞免疫熒光法測定結(jié)果顯示，WJS均結(jié)合在心室肌細胞鈉泵的膜外區(qū)，而且這種結(jié)合并不被1 μmol/L哇巴因影響，但卻被在H1-H2膜外區(qū)特異性抗原點具有相同成分的多肽阻斷劑RE2取消(見圖2)。

2.2WJS對哇巴因所致Ip的影響當以哇巴因1 μmol/L及1 mmol/L灌流大鼠心室肌細胞時，由于Ip被抑制，可引起膜電流的內(nèi)向移動；其中1 μmol/L哇巴因主要阻斷Iph,1 mmol/L哇巴因可以阻斷Ipt。而抗體WJS能基本取消1 μmol/L哇巴因?qū)ph的抑制。4組Iph、Ipl比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中WJS+1 μmol/L哇巴因組Iph低于1 μmol/L哇巴因組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；1 mmol/L哇巴因組、WJS+1 mmol/L哇巴因組Iph高于1 μmol/L哇巴因組和WJS+1 μmol/L哇巴因組，Ipl低于1 μmol/L哇巴因組和WJS+1 μmol/L哇巴因組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；WJS+1 mmol/L哇巴因組Iph高于1 mmol/L哇巴因組，Ipl低于1 mmol/L哇巴因組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.3WJS對哇巴因所致心室肌細胞[Ca2+]i的影響灌流5、15 min 4組心室肌細胞[Ca2+]i比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中灌流5、15 min WJS+1 μmol/L哇巴因組心室肌細胞[Ca2+]i低于1 μmol/L哇巴因組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；灌流5、15 min 1 mmol/L哇巴因組、WJS+1 mmol/L哇巴因組心室肌細胞[Ca2+]i高于1 μmol/L哇巴因組和WJS+1 μmol/L哇巴因組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；灌流5、15 min WJS+1 mmol/L哇巴因組心室肌細胞[Ca2+]i高于1 mmol/L哇巴因組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2、圖3)。

2.4WJS對哇巴因所致心室肌細胞收縮力的影響灌流5、15 min 4組心室肌細胞收縮力比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中灌流5、15 min WJS+1 μmol/L哇巴因組心室肌細胞收縮力低于1 μmol/L哇巴因組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；灌流5 min1 mmol/L哇巴因組、WJS+1 mmol/L哇巴因組心室肌細胞收縮力高于1 μmol/L哇巴因組和WJS+1 μmol/L哇巴因組，灌流15 min心室肌細胞收縮力低于1 μmol/L哇巴因組和WJS+1 μmol/L哇巴因組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；灌流5、15 min WJS+1 mmol/L哇巴因組心室肌細胞收縮力低于1 mmol/L哇巴因組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3、圖4)。

圖1　Western blotting法檢測WJS表達水平

圖2　細胞免疫熒光法檢測WJS表達

組別例數(shù)IphIpl1μmol/L哇巴因組110.14±0.010.28±0.02WJS+1μmol/L哇巴因組110.04±0.01a0.29±0.011mmol/L哇巴因組110.20±0.02ab0.16±0.01abWJS+1mmol/L哇巴因組110.22±0.01abc0.14±0.01abcF值387.10410.67P值<0.001<0.001

注：Iph=高親和力鈉泵電流,Ipl=低親和力鈉泵電流；與1 μmol/L哇巴因組比較，aP<0.05；與WJS+1 μmol/L哇巴因組比較，bP<0.05；與1 mmol/L哇巴因組比較，cP<0.05

Table 2Comparison of [Ca2+]i among the four groups at different time points

組別例數(shù)5min15min1μmol/L哇巴因組9189.5±14.0183.2±8.9WJS+1μmol/L哇巴因組9151.4±6.7a157.1±7.8a1mmol/L哇巴因組9246.6±11.2ab268.3±12.3abWJS+1mmol/L哇巴因組9232.3±10.5abc230.2±11.5abcF值140.73207.46P值<0.001<0.001

注：與1 μmol/L哇巴因組比較，aP<0.05；與WJS+1 μmol/L哇巴因組比較，bP<0.05；與1 mmol/L哇巴因組比較，cP<0.05

3討論

CGs藥物是治療心力衰竭的傳統(tǒng)經(jīng)典藥物，其增加心肌收縮性的機制一直被認為在于其抑制鈉泵，而CGs藥物在心力衰竭患者的治療濃度卻遠低于其在體外抑制鈉泵的濃度，因此治療濃度CGs藥物的正性肌力作用可能與鈉泵抑制作用并無因果關(guān)系，甚至此治療濃度反而興奮鈉泵，這使得鈉泵抑制理論難以圓滿解釋治療濃度CGs藥物的強心作用。鈉泵是普遍存在于人類和動物細胞膜上的一種酶，其α亞基上存在CGs藥物的結(jié)合位點。心室肌細胞鈉泵不同亞型是CGs藥物治療心力衰竭中發(fā)揮治療和不良反應的重要影響因素[9-10]。文獻報道，鈉泵特別是抑制α2亞基調(diào)節(jié)著哇巴因誘導的心室肌細胞收縮力，而抑制α1亞基則會造成鈣超載和非節(jié)律性收縮[11]，這為在治療心力衰竭過程中尋找特異性作用于α2亞基的藥物提供參考思路。有研究發(fā)現(xiàn)，臨床上CGs藥物有效治療心力衰竭的血清游離藥物濃度(10-9～10-8mol/L)比體外細胞實驗抑制鈉泵的濃度低得多[12]。本課題組前期的實驗發(fā)現(xiàn)，低濃度CGs藥物的正性肌力作用與鈉泵的離子泵功能無關(guān)，可能僅涉及了鈉泵的信號轉(zhuǎn)導功能[13]。因此，目前關(guān)于哇巴因的正性肌力作用有兩種可能機制：高濃度哇巴因抑制鈉泵α1亞基即低親和力泵，且其增強心室肌細胞收縮力的作用與泵的抑制程度呈正相關(guān)；低濃度即治療濃度下的哇巴因與鈉泵的α2亞基即高親和力泵有關(guān)，且其加強心室肌細胞收縮力作用與鈉泵的離子轉(zhuǎn)運功能無關(guān)，可能與其他如信號轉(zhuǎn)導功能有關(guān)[14]。

圖3　WJS對哇巴因所致心室肌細胞[Ca2+]i的影響

Table 3Comparison of contractility of myocardial cells among the 4 groups at different time points

組別例數(shù)5min15min1μmol/L哇巴因組8141.8±7.9142.1±6.2WJS+1μmol/L哇巴因組8103.9±2.8a118.1±6.9a1mmol/L哇巴因組8283.9±12.1ab101.5±3.2abWJS+1mmol/L哇巴因組8238.6±11.2abc85.2±3.9abcF值651.62169.46P值<0.001<0.001

注：與1 μmol/L哇巴因組比較，aP<0.05；與WJS+1 μmol/L哇巴因組比較，bP<0.05；與1 mmol/L哇巴因組比較，cP<0.05

圖4　WJS對哇巴因所致心室肌細胞收縮力的影響

Figure 4Effect of WJS on the contractility of myocardial cells induced by uabain

鑒于以上研究，本研究將實驗分3部分。首先，以α2亞基H1-H2膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列作為靶蛋白，通過免疫動物獲得抗血清制備多克隆抗體WJS，通過此抗體來封閉哇巴因與鈉泵α2亞基H1-H2膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點，為進一步探討鈉泵與其抑制因子的可能作用機制奠定了基礎(chǔ)。實驗結(jié)果顯示，WJS能夠選擇性與心室肌細胞鈉泵α2亞基H1-H2膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并與鈉泵α2亞基H1-H2膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域抗原點相互作用。其次，利用該抗體封閉鈉泵α2亞基膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域上的哇巴因結(jié)合位點，拮抗或阻斷鈉泵抑制因子對鈉泵的抑制作用，通過比較封閉前和封閉后哇巴因?qū)︹c泵的活性影響、Ip的變化，更深入地揭示鈉泵與其抑制因子的可能作用機制，為心力衰竭的治療提供理論和實驗依據(jù)，同時試圖發(fā)現(xiàn)可更有效治療心力衰竭的新型藥物。實驗結(jié)果顯示，預孵抗體WJS能基本取消低濃度哇巴因?qū)ph的抑制，說明WJS可以與鈉泵α2亞基H1-H2膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域的該位點作用，從而減少高親和力泵的活性。最后，進一步對心室肌細胞[Ca2+]i、心室肌細胞收縮力相關(guān)因素進行探討，檢測其是否參與了治療濃度哇巴因的正性肌力作用。實驗結(jié)果顯示，鈉泵α2亞基H1-H2膜外區(qū)結(jié)構(gòu)域參與哇巴因增加心室肌細胞收縮力的作用，提示鈉泵α2亞基介導了哇巴因的治療作用，對于更深入地揭示鈉泵的功能和作用機制以及為臨床治療心力衰竭藥物的研制提供新的線索。

總之，本實驗利用鈉泵膜外區(qū)特異性的抗體，從細胞、分子水平比較封閉前后哇巴因?qū)︹c泵功能的影響及可能作用的機制。明確該膜外區(qū)參與哇巴因正性肌力作用的機制，為臨床治療心力衰竭采用新的治療手段提供了新途徑，同時也為研發(fā)高效低毒的藥物提供一全新的治療思路。

作者貢獻：武彥昭進行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；張?zhí)m進行實驗實施、評估、資料收集；熊晨進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

參考文獻

[1]Reddy S,Benatar D,Gheorghiade M.Update on digoxin and other oral positive inotropic agents for chronic heart failure[J].Curr Opin Cardiol，1997,12(3):233-241.

[2]Bers DM.Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes[J].Annu Rev Physiol，2008,70(1):23-49.

[3]Crambert G,Hasler U,Beggah AT,et al.Transport and pharmacological properties of nine different human Na,K-ATPase isozymes[J].J Biol Chem,2000,275(3):1976-1986.

[4]Kaplan JH.Biochemistry of Na,K-ATPase[J].Annu Rev Biochem,2002,71(1):511-535.

[5]Mobasheri A,Avila J,Cózar-Castellano I,et al.Na+,K+-ATPase sozyme diversity;comparative biochemistry and physiological implications of novel functional interactions[J].Biosci Rep,2000,20(2):51-91.

[6]Wang J,Velotta JB,McDonough AA,et al.All human Na(+)-K(+)-ATPase alpha-subunit isoforms have a similar affinity for cardiac glycosides[J].Am J Physiol Cell Physiol,2001,281(4):C1336-1343.

[7]Biser PS,Thayne KA,Fleming WW,et al.Na+,K+ATPase alpha-subunit isoform distribution and abundance in guinea-pig longitudinal muscle/myenteric plexus after exposure to morphine[J].Brain Res,2002,931(2):186-193.

[8]Price EM,Lingrel JB.Structure-function relationships in the Na,K-ATPase alpha subunit:site-directed mutagenesis of glutamine-111 to arginine and asparagines-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistant enzyme[J].Biochemistry,1988,27(22):8400-8408.

[9] Lingrel JB.The physiological significance of the cardiotonic steroid/ouabain-binding site of the Na,K-ATPase[J].Annu Rev Physiol,2010,72:395-412.

[10]Swift F,Tovsrud N,Enger UH,et al.The Na+/K+-ATPase alpha2-isoform regulates cardiac contractility in rat cardiomyocytes[J].Cardiovasc Res,2007,75(1):109-117.

[11]Adams RJ,Schwartz A,Grupp G，et al.High-affinity ouabain binding site and low-dose inotropic effect in rat myocardium[J].Nature，1982，296(5853):167-169.

[12]Noble D.Mechanism of action of therapeutic levels of cardiac glycosides[J].Cardiovasc Res，1980,14(9):495-514.

[13]Gao J,Wymore RS,Wang Y,et al.Isoform-specific stimulation of cardiac Na/K pumps by nanomolar concentrations of glycosides[J].J Gen Physiol,2002,119(4):297-312.

[14]Katz A,Lifshitz Y,Bab-Dinitz E,et al.Selectivity of digitalis glycosides for isoforms of human Na,K-ATPase[J].J Biol Chem,2010,285(25):19582-19592.

(本文編輯：陳素芳)

【關(guān)鍵詞】肌細胞,心臟；哇巴因；鈉鉀交換ATP酶；大鼠

武彥昭,張?zhí)m，熊晨.鈉泵α2亞基介導低濃度哇巴因影響大鼠心室肌細胞收縮力的作用研究[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(3)：285-291.[www.chinagp.net]

Wu YZ,Zhang L,Xiong C.Effect of sodium pump α2 subunit mediating low-concentration ouabain on the contractility of rat myocardial cells[J].Chinese General Practice，2016，19(3)：285-291.

Effect of Sodium Pump α2 Subunit Mediating Low-concentration Ouabain on the Contractility of Rat Myocardial CellsWUYan-zhao,ZHANGLan,XIONGChen.TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

【Abstract】BackgroudThe application of CGs has much limitation in the treatment of heart failure due to its therapeutic window.Myocardial sodium pump is the target spot of the drug effect of CGs,while the mechanism of the interaction between CGS and sodium pump needs further elaboration.The first extramembrane fragment H1-H2 is currently considered as a possible binding site for ouabain (OUA).ObjectiveThe polyclonal antibody WJS which has effect on the extramembrane fragment H1-H2 of anti-myocardial sodium pump α2 subunit was employed,and the binding site was closed,which had effective antagonism on ouabain′s inhibiting effect on sodium pump.Comparison was made in the influence of ouabain on the activity of sodium pump of myocardial cells,cell contractility and the variation of intracellular calcium,and the effect mechanism of sodium pump and ouabain was investigated.MethodsThe ventricle muscle cells of rates were acutely isolated from January 2013 to January 2015 and were divided into four groups:1 μmol/L ouabain group,WJS+1 μmol/L ouabain group,1 mmol/L ouabain group and WJS+1 mmol/L ouabain group.The 1 μmol/L ouabain group was given 1 μmol/L ouabain by perfusion;the WJS+1 μmol/L group was given ouabain after incubating myocardial cell by antibody WJS (diluted concentration 1∶1 000);the 1 mmol/L ouabain group was given 1 mmol/L ouabain by perfusion;the WJS+1 mmol/L ouabain group was given 1 mmol/L ouabain by perfusion after incubating myocardial cells for 0.5 hour by antibody WJS (diluted concentration 1∶1 000).Sodium pump current was recorded using whole-cell patch clamp technique,and the influence of WJS on the inhibiting effect of ouabain on Ip was observed;laser scanning confocal microscope was used to determine the concentration of free calcium([Ca2+]i) of myocardial cells;video-based motion edge-detection system was employed to measure the length of myocardial cells and the magnitude of contractility.ResultsThe results of western blotting showed that two clear stripes showed in the electrophoresis of WJS after purification,with a molecular weight of 110 kD each.The results of cell immunofluorescence method showed that WJS all bonding in the extramembrane fragment of the sodium pump of myocardial cells;the bonding was not influenced by 1 μmol/L ouabain but was undone by polypeptide blockers of RE2 with the same components at the specific antigen cutoff point in the extramembrane fragment H1-H2.The WJS+1 μmol/L ouabain group was lower than the 1 μmol/L ouabain group in the high-affinity sodium pump current(Iph)(P<0.05);the 1 mmol/L ouabain group and the WJS+1 mmol/L ouabain group were higher in Iph and lower in low-affinity sodium pump current(Iph)than the 1 μmol/L ouabain group and the WJS+1 μmol/L ouabain group (P<0.05);the WJS+1 mmol/L ouabain group was higher in Iph and was lower in Ipl than the 1 mmol/L ouabain group (P<0.05 for all).The WJS+1 μmol/L ouabain group was lower than the 1 μmol/L ouabain group in 5 min and 15 min [Ca2+]i in myocardial cells (P<0.05);the 1 mmol/L ouabain group and the WJS+1 mmol/L ouabain group were higher than the 1 μmol/L ouabain group and the WJS+1 μmol/L ouabain group in 5 min and 15 min [Ca2+]i in myocardial cells (P<0.05);the WJS+1 mmol/L group was higher than the 1 mmol/L ouabain group in 5 min and 15 min [Ca2+]i in myocardial cells (P<0.05).The WJS+1 μmol/L ouabain group was lower than the 1 μmol/L ouabain group in 5 min and 15 min contractility of myocardial cells (P<0.05);1 mmol/L ouabain group and WJS+1 mmol/L ouabain group were higher in 5 min contractility and lower in 15 min contractility of myocardial cells than 1 μmol/L ouabain group and WJS+1 μmol/L ouabain group (P<0.05);the WJS+1 mmol/L ouabain group was higher in 5 min contractility of myocardial cells and was lower in 15 min contractility of myocardial cells than 1 mmol/L ouabain group (P<0.05).ConclusionThe polyclonal antibody WJS in the H1-H2 extramembrane fragment of anti-myocardial sodium pump α2 subunit could undo the high-affinity sodium pump currency and the reinforcement of the contractility of myocardial cells induced by low-concentration uabain,which indicates the therapeutic effect of sodium pump α2 aubunit mediating low-concentration ouabain.

【Key words】Myocytes,cardiac；Ouabain；Sodium-potassium-exchanging ATPase；Rats

(收稿日期：2015-05-06；修回日期：2015-10-27)

【中圖分類號】R 541.6

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.009

通信作者：熊晨，050017河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學藥理教研室；E-mail:bearmorning@sina.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81302773)；河北省自然科學基金資助項目(H2014206319)
作者單位：050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院(武彥昭,張?zhí)m)；河北醫(yī)科大學藥理教研室(熊晨)