鄭銳年，林順歡，關(guān) 靈，林欽雄，劉 淳，盧志斌，吳少敏

（廣東省東莞市人民醫(yī)院，廣東 東莞 523000）

乳腺癌患者新輔助化學(xué)治療后ERCC1基因表達(dá)情況研究

鄭銳年，林順歡，關(guān) 靈，林欽雄，劉 淳，盧志斌，吳少敏

（廣東省東莞市人民醫(yī)院，廣東 東莞 523000）

目的研究乳腺癌新輔助化學(xué)治療（簡(jiǎn)稱化療）對(duì)核苷酸切除修復(fù)基因ERCC1表達(dá)的影響及臨床意義。方法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)檢測(cè)正常健康志愿者活檢組織（18例），常規(guī)手術(shù)切除的乳腺癌標(biāo)本（28例）和術(shù)前曾接受新輔助化療的乳腺癌標(biāo)本（18例）中ERCC1基因的表達(dá)，分析其表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性以及乳腺癌新輔助化療對(duì)其的影響。結(jié)果無(wú)化療組患者的ERCC1基因表達(dá)水平顯著低于正常組（P＜0．05）。無(wú)化療組乳腺癌中ERCC1基因表達(dá)水平與患者的年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分型、組織學(xué)分級(jí)、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮因子受體－2(HER－2)均無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0．05)。新輔助化療組ERCC1基因的表達(dá)水平明顯高于無(wú)化療組(P＜0．05)。結(jié)論與正常人相比，乳腺癌患者ERCC1基因表達(dá)水平顯著下降(P＜0．05)，而ERCC1基因的表達(dá)水平與乳腺癌的臨床病理特征無(wú)相關(guān)性，患者經(jīng)過(guò)新輔助化療后ERCC1基因的表達(dá)水平可出現(xiàn)上調(diào)，對(duì)乳腺癌患者實(shí)施化療治療具有參考意義。

ERCC1基因；乳腺癌；新輔助化療

切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因 1(excision repair cross complementing gene 1，ERCC1）是人類細(xì)胞DNA損傷后核苷酸切除修復(fù)途徑基因家族中重要的成員之一。ERCC1基因位于染色體19q13．2，長(zhǎng)度15 kb，編碼由297個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。ERCC1基因的表達(dá)產(chǎn)物可特異性連結(jié)5′端的核酸內(nèi)切酶，具有損傷識(shí)別和切除5′端的雙重作用。目前，大量研究證實(shí)ERCC1基因的低表達(dá)常伴隨癌癥發(fā)病率的增加。為了解ERCC1基因在健康人群、乳腺癌患者以及接受新輔助化學(xué)治療（簡(jiǎn)稱化療）后的乳腺癌患者中的表達(dá)情況，筆者對(duì)新輔助化療或無(wú)新輔助化療的46例乳腺癌臨床標(biāo)本以及18例健康志愿者采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT－PCR)法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)ERCC1基因的臨床意義進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1．1 一般資料

選取2012年8月至2015年8月我院收治的46例乳腺癌患者，均知情同意并接受手術(shù)治療。根據(jù)術(shù)前治療情況將患者分為化療組（n＝18）和無(wú)化療組（n＝28）?；熃M患者中，年齡28～59歲，平均（40．5±10．2）歲；臨床分期為Ⅱ期14例，Ⅲ期4例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況為伴有5例，不伴有13例；病理類型為非特殊型癌15例，特殊型癌3例；組織學(xué)分級(jí)為為Ⅰ級(jí)2例，Ⅱ級(jí)9例，Ⅲ級(jí)7例。無(wú)化療組患者中，年齡28～67歲，平均（43．2± 10．1）歲；臨床分期為Ⅰ期8例，Ⅱ期16例，Ⅲ期4例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況為伴有5例，不伴有23例；病理類型為非特殊型癌24例，特殊型癌4例；組織學(xué)分級(jí)為Ⅰ級(jí)6例，Ⅱ級(jí)12例，Ⅲ級(jí)10例。另選取在我院行健康體檢的志愿者18例為正常組，年齡28～62歲，平均（41．5±11．5）歲。所有試驗(yàn)均經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，均簽署知情同意書(shū)。3組對(duì)象年齡、性別資料比較，差異均不顯著（P＞0．05），具有可比性。

1．2 方法

1．2．1 治療方法

化療組患者曾接受的新輔助化療方案包括：TE方案，多西他賽(TXT)75 mg／m2，第 1天，表阿霉素(EPI)75 mg／m2，第1天，21 d為1周期；TEC方案，TXT 75 mg／m2，第 1天，EPI 75 mg／m2，第 1天，環(huán)磷酰胺(CTX）500 mg／m2，第1天，21 d為1個(gè)周期；4EC－4T方案：EPI 75 mg／m2，第1天，CTX 500 mg／m2，第1天，TXT(多西他賽)75 mg／m2，第1天。任選一種上述方案，化療2～8個(gè)療程。

1．2．2 RT－PCR檢測(cè)

3組患者均進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)，采用總RNA提取試劑盒及RT－PCR試劑盒(深圳晶美生物公司)。

總RNA提取：取300 mg乳腺癌組織，在液氮預(yù)冷的研缽中放置研磨，用藥匙收集放入15 mL的EP管，加入Trizol液，組織和Trizol液的比例為100 mg∶1 mL，充分混勻后靜置5 min。運(yùn)用氯仿－異丙醇法將總RNA提取出來(lái)，電泳可見(jiàn)3個(gè)條帶，即28S，18S，5S。用紫外分光光度計(jì)對(duì) RNA的純度進(jìn)行鑒定，對(duì) A260nm／A280nm的比值進(jìn)行測(cè)定，使其維持在1．8～2．0。

第一鏈cDNA合成：1 μg總RNA＋1 μL oligo(dT) 18引物，焦碳酸二乙酯(DEPC)水補(bǔ)到12 μL，70℃的溫度下孵育5 min，冰上驟冷;順序加入4 μL 5×buffer＋2 μL 10 mmol／L dNTP＋20 U Ribonuclease inhibitor，37℃放置，孵育 5 min，加 200 UM－MuLV，終體積為20 μL。42℃放置，孵育60 min，70℃放置，孵育10 min，冰上驟冷，cDNA保存在－20℃。

鏈擴(kuò)增：PCR引物（上海生工公司合成，見(jiàn)表1），反應(yīng)體系為50 μL去離子水＋5 μL 10×PCR緩沖液＋5 μL cDNA＋2 μL 25 mmol／L MgCl2＋1 μL 10 mmol／L dNTP＋2．5 U Taq酶＋25 pmol上游特異引物＋25 pmol下游特異引物，充分混勻，在較短的時(shí)間內(nèi)離心，94℃預(yù)熱5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增：94℃、55℃、72℃、94℃分別變性30 s、退火30 s、延伸40 s、延伸5 min。

表1 PCR引物

電泳檢測(cè)：用1．0%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，將電泳電壓穩(wěn)定在500 V／m 1．0 h左右，用5 g／L溴化乙錠(EB)染色20 min，然后在紫外燈、凝膠成像系統(tǒng)、LabWorkS4圖形分析處理系統(tǒng)分別觀察、拍照成像、分析。

ERCC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量＝ERCC1擴(kuò)增帶灰度／內(nèi)參β－actin擴(kuò)增帶灰度。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

3 討論

20世紀(jì)70年代末以來(lái)，全球乳腺癌發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)[1]。近年，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率的增長(zhǎng)速度也已高出高發(fā)國(guó)家1%～2%。2012年國(guó)家癌癥中心、衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局公布的2009年乳腺癌發(fā)病數(shù)據(jù)顯示，全國(guó)腫瘤登記地區(qū)乳腺癌發(fā)病率高居女性惡性腫瘤的首位，女性乳腺癌發(fā)病率（粗率）全國(guó)合計(jì)為42．55／10萬(wàn)，城市為51．91／10萬(wàn)，農(nóng)村為23．12／10萬(wàn)，乳腺癌已成為當(dāng)前社會(huì)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[2]。自 20世紀(jì) 90年代，全球乳腺癌死亡率呈下降趨勢(shì)；究其原因，一是乳腺癌篩查工作的開(kāi)展，使早期病例的比例增加；二是乳腺癌綜合治療的開(kāi)展，提高了療效，乳腺癌已成為療效最佳的實(shí)體腫瘤之一[3]。

表2 3組對(duì)象ERCC1基因表達(dá)水平比較（s）

表2 3組對(duì)象ERCC1基因表達(dá)水平比較（s）

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表3 無(wú)化療組患者ERCC1基因的表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性（s）

表3 無(wú)化療組患者ERCC1基因的表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性（s）

t／F值0．229 P值0．82腫塊大?。╟m）0．5860．56病理類型例數(shù)13 15 13 12 3 240．4340．67組織學(xué)分級(jí)＞40＜2 2～5＞5非特殊型癌特殊型癌Ⅰ級(jí)Ⅱ級(jí)Ⅲ級(jí)46 0．8200．45腋淋巴結(jié)0．3650．72 PR 0．4160．68 ER＋－＋－＋－0．5230．60 HER－2＋＋／＋＋＋－／＋12 10 5 23 14 14 18 10 9 19 ERCC1 mRNA 0．961±0．047 0．973±0．033 0．958±0．021 1．003±0．048 1．010±0．026 0．974±0．041 1．002±0．040 1．041±0．041 0．965±0．048 0．946±0．041 1．003±0．035 0．962±0．036 0．982±0．059 0．962±0．023 0．965±0．042 0．991±0．020 1．003±0．023 0．957±0．0290．8470．40

DNA的合成和修復(fù)異常與腫瘤的發(fā)生、多藥耐藥均有密切聯(lián)系，其中核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)是導(dǎo)致鉑類藥物耐藥的重要機(jī)制。NER通路由多種DNA修復(fù)酶組成，ERCC1基因是NER通路中的限速基因，其編碼的ERCC1蛋白參與DNA損傷識(shí)別和DNA鏈的切割，在DNA修復(fù)過(guò)程中具有重要作用。目前，大量研究證實(shí)ERCC1基因的低表達(dá)常伴隨癌癥發(fā)病率的增加[4－6]。因此，ERCC1基因表達(dá)水平與腫瘤易感性、化療藥物療效預(yù)測(cè)、臨床預(yù)后等相關(guān)性的研究，是近期臨床研究的熱點(diǎn)。

目前，有關(guān)ERCC1基因在乳腺癌中表達(dá)的研究，大多關(guān)注蛋白質(zhì)水平。一項(xiàng)國(guó)際研究[7]對(duì)504例早期乳腺癌患者標(biāo)本行ERCC1免疫組化檢測(cè)并分析，結(jié)果表明，ERCC1蛋白表達(dá)并不能反映乳腺癌手術(shù)的預(yù)后，但ERCC1過(guò)表達(dá)與ER陽(yáng)性、較低T分期、淋巴結(jié)陰性和年齡超過(guò)50歲有關(guān)，與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存率無(wú)關(guān)。

本研究結(jié)果表明，無(wú)化療組患者與正常健康患者相比，ERCC1基因的表達(dá)水平顯著降低，與之前相關(guān)研究結(jié)果一致[8]；28例無(wú)化療組患者的ERCC1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與不同年齡、腫塊大小、病理類型、組織學(xué)分級(jí)、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、ER表達(dá)、PR表達(dá)、HER－2表達(dá)等臨床病理特征無(wú)相關(guān)，說(shuō)明ERCC1蛋白或mRNA表達(dá)水平或許不是一個(gè)預(yù)后不良因素。但本研究樣本量較少，其結(jié)論有待大數(shù)據(jù)的臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。

此外，本研究結(jié)果還顯示，18例接受新輔助化療患者組織的ERCC1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著高于無(wú)化療組（P＜0．05），說(shuō)明ERCC1基因的表達(dá)水平在乳腺癌新輔助化療后可上調(diào)，有利于乳腺癌的治療。

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[8]Adam Vilmar，Jens Benn S?rensen．Excision repair cross－complementation group 1(ERCC1)in platinum－based treatment of non－small cell lung cancer with special emphasis on carboplatin: A review of current literature[J]．Lung Cancer，2009，64(2): 131－139．

Expression of ERCC1 Gene in Breast Cancer after Neoadjuvant Chemotherapy

Zheng Ruinian，Lin Shunhuan，Guan Ling，Lin Qinxiong，Liu Chun，Lu Zhibin,Wu Shaomin
（Dongguan People′s Hospital，Dongguan，Guangdong，China 523000）

Objective To study the expression of ERCC1 gene in breast cancer after neoadjuvant chemotherapy．Methods The expression of ERCC1 gene was detected by RT－PCR in 28 breast cancer patients without neoadjuvant chemotherapy and in 18 breast cancer patients treated with neoadjuvant chemotherapy．The expression and clinicopathological features of breast cancer as well as the relevance of the impact of neoadjuvant chemotherapy on it were analyzed．Results No chemotherapy patients ERCC1 expression level was significantly lower than the normal group,the difference was statistically significant(P＜0．05)．The differences of ERCC1 gene expression levels of the non chemotherapy group between different ages,tumor sizes,histological types,histological grades,axillary lymph nodes,PR, ER,HER－2 were not significant(P＞0．05)．Neoadjuvant chemotherapy group ERCC1 gene expression levels were significantly higher than those without chemotherapy group,the difference was statistically significant(P＜0．05)．Conclusion Compared with the normal, ERCC1 gene expression levels were significantly decreased in patients with breast cancer(P＜0．05)and ERCC1 gene expression and Clinical pathological characteristics of breast cancer not associated,after neo－adjuvant chemotherapy in patients with raised the ERCC1 gene expression can occur,chemotherapy in the treatment of breast cancer patients have some reference value．

ERCC1 gene；breast neoplasms；neoadjuvant chemotherapy

R969．4；R979．1

A

1006－4931(2016)05－0024－03

鄭銳年（1983－），男，在職博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)榉伟┌邢蛑委煛⒏伟┌邢蛑委?，（電子信箱）aweifrom＠163．com，2857311978＠qq．com。

2015－09－10)

廣東省東莞市科技計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2015105101180。