李玉娟，段昌令，李連達(dá)，，王丹巧

（1．中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700； 2．中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100090）

何首烏提取物對魚藤酮所致帕金森病線蟲模型的神經(jīng)保護(hù)作用

李玉娟1，段昌令2，李連達(dá)1，2，王丹巧1

（1．中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700； 2．中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100090）

目的研究何首烏提取物對魚藤酮所致帕金森病線蟲模型的神經(jīng)保護(hù)作用。方法設(shè)對照組、魚藤酮組和用藥組(0．5 g／L，1．0 g／L)，觀察其對線蟲多巴胺神經(jīng)元樹突、體內(nèi)活性氧水平及生存率的影響。結(jié)果與對照組相比，0．5 g／L和1．0 g／L何首烏提取物對帕金森病模型多巴胺樹突減少表型有明顯的抑制，顯著增加正常多巴胺神經(jīng)元樹突的線蟲比例，活性氧水平明顯低于魚藤酮組，線蟲存活率明顯高于魚藤酮組。結(jié)論何首烏提取物提高線蟲生存率，對魚藤酮致多巴胺樹突減少表型有抑制作用，何首烏提取物對魚藤酮所致帕金森病線蟲模型有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機制與抑制活性氧生成有關(guān)。

帕金森病；何首烏；神經(jīng)毒素；神經(jīng)保護(hù)；秀麗隱桿線蟲

帕金森病(PD)是僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)退行性疾病，是黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺(DA)神經(jīng)功能受損所致多巴胺與乙酰膽堿平衡失調(diào)的慢性疾病，以運動遲緩、靜止性震顫和強直為主要特征[1]。其病因至今未明，可能與年老、環(huán)境因素及遺傳因素有關(guān)，發(fā)病機制也涉及自由基、氧化應(yīng)激、谷氨酸興奮性毒性、線粒體復(fù)合物Ⅰ缺失、炎癥、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏和凋亡等，在級聯(lián)生化反應(yīng)中這些機制相互作用最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[2]。

魚藤酮來源于植物，是線粒體氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑，可特異性抑制呼吸鏈中的復(fù)合物Ⅰ。魚藤酮能夠引起黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的變性、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致與PD相似的臨床和病理學(xué)特征，廣泛應(yīng)用于PD發(fā)病機制以及藥效評價的研究。

與哺乳類動物相比，線蟲具有眾多優(yōu)點。成年雌雄同體線蟲個體?。ㄩL約1 mm）、子代個體多（＞300個）、生命周期短（12 h內(nèi)形成胚胎，經(jīng)2．5～3．5 d發(fā)育成成年個體，壽命2～3周）、實驗室中易培養(yǎng)，容易迅速大量獲得。線蟲解剖學(xué)簡單，約有1 000個細(xì)胞，302個偽神經(jīng)元細(xì)胞。線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)包含許多在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中已知的信號元件及信號傳遞系統(tǒng)。線蟲中存在乙酰膽堿、谷氨酸、γ－氨基丁酸（GABA）、5－羥色胺（5－HT）、神經(jīng)肽[3]及其他化學(xué)信號分子。線蟲神經(jīng)遞質(zhì)特異的轉(zhuǎn)運體（膜及囊泡）及受體與哺乳動物對應(yīng)的元件是高度保守的。研究發(fā)現(xiàn)，在線蟲中不僅含有多巴胺，還包括其前體及代謝產(chǎn)物[4]，表明線蟲多巴胺神經(jīng)元與哺乳動物多巴胺神經(jīng)元極為相似。線蟲對于PD藥物靶點的發(fā)現(xiàn)與確證及新的治療藥物研究具有重要貢獻(xiàn)[5]。

何首烏是“十大南藥”之一，植物來源為蓼科屬(Polygonum)植物何首烏 Polygonum multiflorum Thunb．的干燥塊根。近年來，有關(guān)其藥理活性研究的報道較多，主要有以下幾個方面[6－7]：調(diào)血脂及抗動脈粥樣硬化等

國家自然科學(xué)基金項目，項目編號：81274121；中國中醫(yī)科學(xué)院自主選題研究項目課題，項目編號：ZZ2015003。心血管系統(tǒng)作用；保護(hù)肝臟作用；抗氧化及抗衰老、增強機體免疫作用；改善記憶力、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和益智作用；抗菌作用；抗炎、鎮(zhèn)痛作用。本研究中采用線蟲PD模型，旨在探討何首烏提取物對魚藤酮所致PD線蟲模型是否具有神經(jīng)保護(hù)作用，為何首烏的臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1．1 材料與儀器

線蟲品系：N2線蟲由中科院生物物理所惠贈。轉(zhuǎn)入α－synuclein突變基因（突變位點 A30P，＜Pdat－1:: alphasynuclein::Pcat－1:EYFP＞）的線蟲PD模型（簡稱A30P線蟲）及野生型(Pcat－1::EYFP)線蟲[8]，由日本東京大學(xué)Tomoki Kuwahara博士惠贈。

藥物和試劑：何首烏提取物(天津科曼斯特公司)；瓊脂粉(日本協(xié)和株式會社)；蛋白胨（peptone，英國OXOID公司)；胰蛋白胨（tryptone，英國OXOID公司)；瓊脂糖（agarose，西班牙Biowest公司)；膽固醇(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)；蔗糖，二甲基亞砜（DMSO），魚藤酮和DHR123為Sigma公司生產(chǎn)，其余試劑均為國產(chǎn)。

儀器：MIR－553型恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；S6E型體視顯微鏡（德國 Leica公司）；XTS30－D型體視顯微鏡（北京泰克儀器有限公司）；Olympus BX51型熒光顯微鏡和Olympus CCD（DP71）型照相系統(tǒng)；臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；MLS－3780高壓滅菌鍋（日本SANYO公司）。

1．2 方法

1．2．1 線蟲常規(guī)培養(yǎng)[9]

將線蟲接種于涂布E．Coli OP50的標(biāo)準(zhǔn)線蟲培養(yǎng)基(NGM），于20℃恒溫培養(yǎng)。

1．2．2 藥物干預(yù)試驗

同步化：用M9緩沖溶液將年輕成蟲洗至無菌EP管中，加適量裂解液（0．5%次氯酸鈉，0．5N氫氧化鈉）裂解線蟲，置低速離心機上離心（3 000 r／min，1 min），棄去上清液，再用M9液沖洗線蟲2次，離心棄上清液后用移液槍吸取EP管底部線蟲滴于NGM的無菌區(qū)，約48 h后裂解的線蟲體內(nèi)的受精卵基本發(fā)育成L4期幼蟲，完成同步化用于下一步試驗。

何首烏提取物干預(yù)對魚藤酮誘導(dǎo)線蟲PD模型多巴胺神經(jīng)元樹突的影響：同步化的線蟲接種到各組培養(yǎng)基中，20℃恒溫培養(yǎng)3 d，加入25 μmol／L魚藤酮誘導(dǎo)線蟲PD模型，同時加入不同質(zhì)量濃度何首烏（0．5 g／L和1．0 g／L）干預(yù)，24 h后，M9液清洗線蟲，挑取年輕成蟲置熒光顯微鏡下觀察，統(tǒng)計多巴胺神經(jīng)元樹突（部分）恢復(fù)線蟲比例。獨立重復(fù)3次。

何首烏提取物干預(yù)對魚藤酮誘導(dǎo)線蟲PD模型體內(nèi)活性氧水平的影響：同步化的線蟲接種到各組培養(yǎng)基中，20℃恒溫培養(yǎng)3 d，加入25 μmol／L魚藤酮誘導(dǎo)線蟲PD模型，同時加入不同質(zhì)量濃度何首烏（0．5 g／L和1．0 g／L）干預(yù)，24 h后，M9清洗線蟲，加入終濃度為100 μmol／L DHR123在30℃下避光孵育，30 min后M9液清洗除去多余DHR123，上SYNERGY 2檢測熒光度值（λex＝485 nm，λem＝520 nm）的變化。

何首烏提取物干預(yù)對魚藤酮誘導(dǎo)線蟲應(yīng)激耐受力的影響：根據(jù)文獻(xiàn)方法培養(yǎng)線蟲，采用線蟲生長培養(yǎng)基（NGM），喂飼E．Coli OP50，培養(yǎng)溫度20℃。將L1期線蟲與細(xì)菌的混懸液均勻加入到24孔培養(yǎng)板中，使每孔細(xì)菌濃度在 OD600的吸收值為2，平均每孔含20～30個線蟲。待線蟲長至L4期，分為對照組、魚藤酮組和用藥組（0．5 g／L和1．0 g／L），20℃培養(yǎng)24 h，光鏡下觀察線蟲存活率[10]。用鉑絲觸碰不動者即視為死亡。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 魚藤酮誘導(dǎo)PD線蟲模型鏡下觀察法的建立

圖1顯示，對照組CEP多巴胺神經(jīng)元樹突完整，而給予不同濃度魚藤酮（25 μmol／L，50 μmol／L）會導(dǎo)致CEP多巴胺神經(jīng)元樹突出現(xiàn)不同程度的損傷，出現(xiàn)斷點或缺失。

2．2 何首烏提取物對模型多巴胺神經(jīng)元樹突的影響

由圖2可見，魚藤酮誘導(dǎo)導(dǎo)致CEP多巴胺神經(jīng)元樹突缺失表型線蟲的存在比例明顯低于對照組（P＜0．001），而0．5 g／L和1．0 g／L何首烏提取物可以明顯抑制多巴胺神經(jīng)元樹突的損傷，并增加魚藤酮導(dǎo)致CEP多巴胺神經(jīng)元樹突缺失表型線蟲的存在比例（P＜0．05）。

2．3 何首烏提取物對模型活性氧(ROS)的影響

由圖3可見，25 μmol／L魚藤酮可明顯增高線蟲體內(nèi)活性氧的水平（P＜0．01），而給予0．5 g／L和1．0 g／L何首烏提取物干預(yù)24 h后，線蟲體內(nèi)活性氧水平明顯低于魚藤酮組（P＜0．05，P＜0．01）。

2．4 何首烏提取物對模型應(yīng)激耐受力的影響

由圖4可見，魚藤酮所致N2線蟲存活率明顯降低（P＜0．001），而給予0．5 g／L和1．0 g／L何首烏提取物干預(yù)24 h后線蟲存活率顯著高于魚藤酮對照組（P＜0．001，P＜0．001）。

圖1 魚藤酮處理24 h N2線蟲CEP多巴胺神經(jīng)元熒光顯微鏡圖像（×100）

3 討論

PD的主要病理改變是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性死亡、殘存神經(jīng)元多巴胺合成能力降低，導(dǎo)致紋狀體多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的不足，從而對錐體外系的運動調(diào)節(jié)功能失調(diào)。試驗表明，當(dāng)多巴胺能神經(jīng)元減少60% ～80% 時，多巴胺含量降至正常值的30%，可導(dǎo)致PD的癥狀出現(xiàn)。

魚藤酮PD模型可以模擬PD發(fā)病的許多特征，且魚藤酮模型因為可以模擬路易氏小體的出現(xiàn)，而優(yōu)于其他類型的PD模型。魚藤酮來源于自然環(huán)境，其慢性暴露的制作方式能較好地模擬PD發(fā)病過程，在病理、生化、發(fā)病機制、行為改變等方面均能較好地模擬人類PD的相關(guān)特征[11]。

線蟲具有精確的解剖結(jié)構(gòu)、快速的復(fù)制周期、簡短的生活史以及半透明的胞體，線蟲的多巴胺神經(jīng)元在細(xì)胞及分子水平上重點體現(xiàn)哺乳類多巴胺神經(jīng)元的特點。但不同于脊椎動物含有上萬個多巴胺神經(jīng)元，雌雄同體的線蟲僅有8個多巴胺神經(jīng)元，易于觀察。其中6個位于大前端，由兩對CEP(cephalic)和一對ADE(anteriordeirid)神經(jīng)元組成。通常選擇CEP作為觀察對象，并且通過轉(zhuǎn)基因手段轉(zhuǎn)入綠色熒光蛋白（GFP），可以在顯微鏡下進(jìn)行觀察，用于研究藥物或遺傳手段的干預(yù)作用[12]。

圖2 何首烏提取物對魚藤酮誘導(dǎo)24 h N2線蟲CEP多巴胺神經(jīng)元保護(hù)作用（×100）

圖3 何首烏提取物對魚藤酮誘導(dǎo)線蟲帕金森病模型活性氧水平的影響

圖4 何首烏提取物對魚藤酮誘導(dǎo)的應(yīng)激性損傷的保護(hù)作用

本研究結(jié)果顯示，給予不同濃度（25 μmol／L，50 μmol／L）的魚藤酮誘導(dǎo)線蟲 24 h，可以看出線蟲CEP多巴胺神經(jīng)元樹突出現(xiàn)斷點或缺失，表明多巴胺神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度地?fù)p傷，50 μmol／L濃度組的損傷程度大于25 μmol／L，因此選擇25 μmol／L作為后續(xù)研究使用的濃度，觀察不同質(zhì)量濃度何首烏提取物的保護(hù)作用。在給予高、低濃度何首烏提取物干預(yù)后可明顯逆轉(zhuǎn)這種表型存在的線蟲比例，說明何首烏不但對魚藤酮誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)作用，且具有一定的促進(jìn)損傷多巴胺神經(jīng)元生長的作用。

魚藤酮誘導(dǎo)24 h后，線蟲體內(nèi)活性氧大量增加（P＜0．01），然而給予何首烏提取物0．5 g／L，1．0 g／L干預(yù)后，線蟲體內(nèi)活性氧水平明顯降低，說明抗氧化應(yīng)激損傷是何首烏提取物保護(hù)機制之一。同時，何首烏提取物對魚藤酮誘導(dǎo)的線蟲死亡具有抗應(yīng)激作用，低劑量組與高劑量組對魚藤酮造模線蟲生存時間存在顯著性差異，提示何首烏提取物的神經(jīng)保護(hù)作用具有一定的劑量依賴性。本研究結(jié)果表明，何首烏提取物對PD模型線蟲的一些病理性損傷具有保護(hù)作用，其作用機制與抑制線蟲體內(nèi)活性氧水平升高有關(guān)。但何首烏提取物神經(jīng)保護(hù)作用的具體作用機制還需要進(jìn)一步的探討。

綜上所述，何首烏提取物對線蟲PD模型的神經(jīng)保護(hù)作用其機制與抑制線蟲體內(nèi)活性氧水平升高有關(guān)，并顯著提高應(yīng)激水平下線蟲存活比例，延長線蟲壽命，為何首烏的臨床應(yīng)用提供了參考。

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Neuroprotective Effect of the Extract of P．multiflorum Thunb．in a Caenorhabditis elegans Model on Rotenone－Induced Parkinson′s Disease

Li Yujuan1,Duan Changling2,Li Lianda1,2,Wang Danqiao1
(1．Experimental Research Center,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing,China 100700; 2．China Academy of Chinese Medical Sciences,Xiyuan Hospital,Beijing,China 100090)

Objective To study the neuroprotective effect of polygonum extract on rotenone－induced Parkinson＇s disease model nematode．M ethods The experienment set control group,rotenone group and treatment group(0．5 g／L,1．0 g／L),and their effect on nematodes dopamine neurons dendrites,and oxygen levels influence survival in vivo activity were observed．Results Compared with the control group,the 0．5 g／L,1．0 g／L Polygonum extract on Parkinson disease model significantly inhibited dopamine phenotype of dendritic,showed a significant increase in dopamine neuron dendrites normal proportion of nematodes,the reactive oxygen species was significantly lower than the rotenone group,and the nematode survival rate was significantly higher than rotenone group．Conclusion Polygonum extract improves the nematode survival,inhibits rotenone－induced dopaminergic phenotype of dendritic．Polygonum extract has neuroprotective effects on rotenone－induced Parkinson＇s disease,and its mechanism of inhibition is related to active oxygen production．

Parkinson′s disease;P．multiflorum Thunb．;neurotoxins;neuroprotection;Caenorhabditis elegans

R285．5；R282．71

A

1006－4931(2016)05－0012－04

李玉娟（1974－），博士研究生，研究方向為帕金森病的中藥干預(yù)及分子機制研究；王丹巧（1959－），研究員，研究方向為中藥藥理，本文通訊作者，（電話）010－64089530（電子信箱）dqwang96＠sohu．com。

20515－10－14)