黃文川 潘宇政 黃李平 張冉令 朱翠香

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，南寧市 530021，E-mail：460755039@qq.com)

論著·基礎(chǔ)研究

氣管切開插管大鼠肺組織病理及肺泡灌洗液肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A濃度的變化情況▲

黃文川 潘宇政 黃李平 張冉令 朱翠香

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，南寧市 530021，E-mail：460755039@qq.com)

目的 探討氣管切開插管大鼠肺組織病理及肺泡灌洗液肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(SP-A)的變化情況。方法 將36只雄性SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組(A組)18只、氣管切開插管模型組(B組)18只。于建立模型后24 h、72 h、168 h分別取各組大鼠6只，并取右肺組織行病理切片檢查，進(jìn)行Smith評(píng)分評(píng)估肺組織損傷情況；取左肺肺泡灌洗液檢測(cè)SP-A濃度。結(jié)果 肺組織病理結(jié)果顯示B組大鼠在建模后24 h、72 h、168 h均有不同程度的水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥、出血、肺不張等肺組織損傷，各時(shí)間點(diǎn)Smith評(píng)分均明顯高于A組(P<0.05)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增高(P<0.05)。B組大鼠肺泡灌洗液SP-A濃度在各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于A組(P<0.05)，且隨氣管切開插管時(shí)間的延長(zhǎng)而降低(P<0.05)。結(jié)論 氣管切開插管可導(dǎo)致水腫、肺泡炎癥、出血、肺不張等肺組織損傷及肺部固有免疫功能紊亂，SP-A有保護(hù)肺組織作用，氣管切開插管早期SP-A代償性增高，隨后逐漸下降。

氣管切開插管；肺組織；Smith評(píng)分；表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A；肺泡灌洗液；肺部感染；大鼠

氣管切開插管緊急建立人工氣道是治療通氣障礙、呼吸衰竭最有效的方法之一，為重型顱腦損傷、昏迷等急危重癥常用的搶救手段?；颊邭夤芮虚_插管后，極易并發(fā)肺部感染，而肺部感染直接影響疾病的預(yù)后與進(jìn)程。何國(guó)厚等[1]通過對(duì)132例氣管切開患者進(jìn)行回顧性分析后發(fā)現(xiàn)，肺部感染的發(fā)生率達(dá)63.64%(84/132)。另一項(xiàng)研究顯示，氣管切開患者的肺部感染率達(dá)79.49%(62/78)，其中45例發(fā)生在氣管切開后3～10 d，有2例直接死于肺部感染[2]。而有學(xué)者報(bào)告氣管切開插管后肺部感染率高達(dá)100%[3]。因此，防治肺部感染對(duì)氣管切開插管患者的治療具有重要意義。氣管切開后發(fā)生肺部感染的機(jī)制為氣管切開插管后氣道受損，呼吸道開放與外界直接相通，失去了鼻腔和口咽部濕化、加溫及防御作用，各種病原體大量侵入所致[4]。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)氣管切開后并發(fā)肺部感染亦與免疫功能紊亂有關(guān)。雖然氣管切開插管在臨床應(yīng)用已久，但少有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)氣管切開插管引起的肺部病理及固有免疫變化進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠氣管切開插管模型，并在3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)取肺組織行病理檢查及取肺泡灌洗液檢測(cè)肺組織固有免疫因子肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(surfactant-associated protein A，SP-A)濃度，為正確認(rèn)識(shí)氣管切開插管引起的病理及固有免疫改變提供參考，為氣管切開插管并發(fā)癥的臨床防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠36只，10周齡，質(zhì)量250～300 g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SCXK(桂)2014-0002]，實(shí)驗(yàn)前自由進(jìn)水進(jìn)食。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為A組(空白對(duì)照組)、B組(氣管切開插管組)，每組18只。

1.2 主要儀器與試劑 高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司，型號(hào)：英泰TDL5M)、數(shù)控超級(jí)恒溫箱(寧波新芝生物科技股份公司，型號(hào)：寧波新芝sc-15)、Multiskan FC型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司)、顯微鏡(Leica公司，型號(hào)：DMil)、移液槍(Eppendorf公司，規(guī)格：0.1～2.5 μl、0.5～10 μl、20～200 μl、100～1 000 μl、multi 12-channel 10～100 μl)；SP-A酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，批號(hào)：L150616441)、多聚甲醛(天津博迪化工股份有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：津Q/HG 3076-99)。

1.3 動(dòng)物模型制備 B組大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水。術(shù)前稱體重后，麻醉前給予阿托品0.02 mg/kg肌肉注射，30 min后3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔肌肉注射麻醉。待大鼠完全麻醉后，取仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)操作臺(tái)上，上切牙套線固定，充分暴露頸部。于頸前正中環(huán)狀軟骨下緣，下至胸骨上窩，剃除頸部鼠毛，醫(yī)用碘伏消毒。縱行剪開大鼠頸部皮膚、皮下組織、筋膜，于白線處鈍性分離各肌層至暴露白色的氣管，暴露氣管，如見甲狀腺峽部可鈍性分離并向上提起，用血管鉗游離出氣管。在氣管上作一小倒“V”型切口后，將一次性硬膜外導(dǎo)管(斜面端)順氣管方向準(zhǔn)確插入氣管中一定深度(2～3 cm)，切口外導(dǎo)管留20 cm，并綁線固定氣管插管，縫合手術(shù)切口，碘伏消毒；用醫(yī)用防水膠布將留在切口外的氣管導(dǎo)管繞在大鼠脖頸一圈，固定，將多余的導(dǎo)管剪掉，保留1 cm于膠布外，以于機(jī)械通氣。A組不做特殊處理，自由進(jìn)食飲水。

1.4 取材 于造模后24 h、72 h、168 h每組分別取6只大鼠進(jìn)行取材。采用3%戊巴比妥鈉于腹部肌肉注射麻醉，麻醉完全后予仰臥位固定取材。取材時(shí)結(jié)扎并取右肺組織，用冰凍生理鹽水進(jìn)行沖洗以除去血液，置入4%多聚甲醛液中固定，過夜后送至廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心制作病理切片。于左肺取肺泡灌洗液，用5 ml冰凍滅菌生理鹽水灌洗，反復(fù)灌洗3次，回收3 ml左右；上述過程重復(fù)3次，共回收9 ml。4℃下2 400 r/min離心10 min，取上清，置于-20℃保存。

1.5 病理切片 觀察采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，用顯微鏡觀察制好的肺組織病理切片，采用Smith評(píng)分方法[5]對(duì)肺水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)出血、肺不張和透明膜形成分別進(jìn)行半定量評(píng)分：無損傷0分，病變范圍<25%為1分，病變范圍25%～50%為2分，50%<病變范圍≤75%為3分，病變范圍>75%為4分，總肺損傷評(píng)分為上述各項(xiàng)之和。觀察10個(gè)高倍鏡視野，取其平均值。由兩位病理科醫(yī)師分別評(píng)分后取平均分。

1.6 測(cè)定SP-A 用SP-A酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)SP-A濃度，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作：(1)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品、試劑及樣品；(2)加樣(標(biāo)準(zhǔn)品及樣本)100 μl，37℃孵育2 h；(3)吸棄，加檢測(cè)液A 100 μl，37℃孵育1 h；(3)洗板3次；(4)加檢測(cè)液B 100 μl，37℃孵育30 min；(5)洗板5次；(6)加3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺底物溶液90 μl，37℃孵育20 min；(7)加終止液50 μl，立即用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm A值；(8)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣本濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組的肺組織Smith評(píng)分肺組織病理切片 B組大鼠在3個(gè)時(shí)段均存在不同程度的水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥、出血、肺泡破壞等肺組織損傷，各時(shí)間點(diǎn)Smith評(píng)分均高于A組大鼠(P<0.05)。在24 h、72 h、168 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，B組大鼠Smith評(píng)分隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)而增高(P<0.05)。見圖1、圖2及表1。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)的肺組織Smith評(píng)分比較(x±s，分)

注：*B組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，P<0.05。

圖1 A組肺組織光鏡下表現(xiàn)( HE染色，×200)

圖2 B組肺組織光鏡下表現(xiàn)( HE染色，×200)

2.2 兩組的SP-A比較 B組大鼠肺泡灌洗液SP-A濃度在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯高于A組(P<0.05)。B組大鼠SP-A濃度以24 h濃度最高，168 h最低，呈隨氣管切開插管時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷降低的趨勢(shì)(P<0.05)。見表2。

表2 兩組不同時(shí)點(diǎn)SP-A濃度(x±s，pg/ml)

注：*B組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較，P<0.05。

3 討 論

氣管切開插管能夠及時(shí)解除患者的呼吸道梗阻，從而改善腦組織的缺氧，減輕腦水腫的發(fā)生，提高腦功能的恢復(fù)效果。早期進(jìn)行氣管切開可以降低格拉斯哥評(píng)分較低的腦外科患者與氣管和支氣管相關(guān)的并發(fā)癥發(fā)生率[6]。由于實(shí)施氣管切開后將患者正常呼吸道的解剖結(jié)構(gòu)破壞，氣體將不經(jīng)過鼻內(nèi)加溫、濕化等處理直接進(jìn)入下呼吸道，導(dǎo)致下呼吸道的水分丟失增多，受到一定的刺激，最終使患者發(fā)生咳嗽能力減弱、氣道分泌物排出不暢、肺表面活性物質(zhì)遭到破壞而發(fā)生肺部感染、缺氧加重等一系列并發(fā)癥[7-8]，嚴(yán)重影響患者的治療效果及預(yù)后。因此氣管切開插管是存在明顯利弊的急救措施，故要嚴(yán)格把握氣管切開的適應(yīng)證，同時(shí)需進(jìn)一步探索氣管切開插管本身對(duì)機(jī)體的影響及其機(jī)制，以指導(dǎo)臨床治療。

氣管切開插管極可能導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)的某些病理改變，但在臨床治療中因主客觀條件限制無法進(jìn)行肺組織的病理檢查，因此臨床上對(duì)氣管切開插管引起的病理改變的認(rèn)識(shí)受到了很大限制。本研究結(jié)果顯示，氣管切開插管可引起大鼠肺泡破壞、炎癥浸潤(rùn)、出血、水腫等病理損傷，且在24 h、72 h、168 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，Smith評(píng)分隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)而增高(P<0.05)，提示這種損傷隨著氣管切開插管時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步加重，這說明氣管切開插管導(dǎo)致肺組織損傷，這種損傷與氣管切開留置插管時(shí)間呈正相關(guān)。因此，臨床上在應(yīng)用氣管切開插管時(shí)為避免或減輕肺組織損傷，應(yīng)設(shè)法保護(hù)肺組織，防治炎癥、出血、水腫等。

肺泡表面活性物質(zhì)是由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞合成和分泌的脂質(zhì)和蛋白復(fù)合物，能減少肺氣液界面表面張力，提高肺泡穩(wěn)定性和防止呼氣相肺泡塌陷[9]。SP-A是最早被發(fā)現(xiàn)的在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中高表達(dá)、信號(hào)最為豐富的蛋白質(zhì)，它是肺表面活性物質(zhì)的重要組分之一，占肺表面活性物質(zhì)總量的50%以上，是肺部的固有免疫因子[10]。它在調(diào)節(jié)磷脂代謝及局部免疫防御方面意義重大，是反映Ⅱ型細(xì)胞功能的早期指標(biāo)，也是判斷患者肺損傷程度和預(yù)后的指標(biāo)[11]。SP-A缺失或表達(dá)水平過低容易導(dǎo)致細(xì)菌和病毒感染[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氣管切開插管大鼠肺泡灌洗液SP-A濃度明顯高于正常大鼠(P<0.05)，以24 h濃度最高，168 h最低，呈隨氣管切開插管時(shí)間的延長(zhǎng)而濃度不斷降低的趨勢(shì)(P<0.05)?？紤]與氣道開放后固有免疫因子代償性增多，隨著不斷消耗而逐漸下降有關(guān)。隨著SP-A濃度的下降，肺組織炎癥不斷加重。這表明，SP-A能抑制氣管切開插管后肺部炎癥、出血等損傷，具有保護(hù)肺組織的作用；但隨著氣管切開留置插管時(shí)間的延長(zhǎng)，SP-A濃度逐漸降低，對(duì)肺組織的保護(hù)功能逐漸下降。

綜上所述，氣管切開插管是為了搶救危重患者而采取的急救措施，但其本身亦可引發(fā)肺組織損傷，這種損傷程度與氣管切開插管時(shí)間有關(guān)。SP-A具有保護(hù)肺組織作用。故臨床上我們要嚴(yán)格掌握氣管切開插管的適應(yīng)證，在應(yīng)用氣管切開插管時(shí)要設(shè)法采取措施防治肺組織損傷，調(diào)節(jié)SP-A濃度。將來可能在氣管切開插管后期使用人工合成的SP-A制劑，以增強(qiáng)肺部對(duì)細(xì)菌和病毒的抵抗力、降低感染率從而改善患者預(yù)后。

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Changes of lung tissue pathology and bronchoalveolar lavage fluid concentration of surfactant-associated protein A in rats with tracheostomy tube

HUANGWen-chuan,PANYu-zheng,HUANGLi-ping,ZHANGRan-ling,ZHUCui-xiang

(DepartmentofTraditionalChineseMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the changes of lung tissue pathology and the bronchoalveolar lavage fluid(BALF) concentrations of surfactant-associated protein A(SP-A) in rats with tracheostomy tube.Methods Thirty-six male SD rats were divided into blank control group(Group A,n=18) and tracheostomy tube model group(Group B,n=18).Six rats were selected in each group at 24,72 and 168 hours after modeling separately.Then the right lung tissues were taken out for the pathological examination,and the Smith score was used to evaluate the injury of lung tissue.The BALF of left lung was collected for detecting the concentration of SP-A.Results The results of lung tissue pathology showed that the lung tissue injuries including edema,alveolar and interstitial inflammation,alveolar and interstitial hemorrhage,and atelectasis with different degrees existed in the rats of Group B at 24,72 and 168 hours after modeling.The Smith score of Group B was higher than that of Group A at each time point(P<0.05),and increased with the increase of observation time(P<0.05).The BALF concentration of SP-A in Group B was significantly higher than that in Group A at each time point(P<0.05),and decreased with the increase of tracheostomy tube time(P<0.05).Conclusion Tracheostomy tube might lead to lung tissue injuries including edema,alveolar and interstitial inflammation,alveolar and interstitial hemorrhage,atelectasis,and also lead to the disorder of pulmonary innate immune function.And SP-A owns a protective function for lung tissue.The level of SP-A has a compensatory increase in the early stage of tracheostomy tube and then gradually decreases.

Tracheostomy tube,Lung tissue,Smith score,Surfactant-associated protein A,Bronchoalveolar lavage fluid,Pulmonary infection,Rat

國(guó)家自然科學(xué)基金(81460687)；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)(GZPT13-36)

黃文川(1989～)，男，在讀碩士研究生，研究方向：腦病及肺病。

潘宇政(1961～)，男，碩士，副教授，研究方向：腦病及肺病，E-mail：pyz79298@sina.com。

通信作者：黃李平(1956～)，女，碩士，教授，研究方向：腦病及肺病，E-mail：hlp65836@163.com。

R 653.1

A

0253-4304(2016)04-0449-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.01

2015-12-22

2016-03-03)