姜永田 滕海軍 張 棟 謝 東

(1 濰坊醫(yī)學(xué)院研究生系研究生教研室，濰坊市 261000，E-mail：yongtian818@163.com；2 中國人民解放軍第89醫(yī)院脊柱外科，濰坊市 261021；3 山東省淄博市臨淄區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科，淄博市 255400)

論著·基礎(chǔ)研究

水下沖擊波致兔脊髓損傷的神經(jīng)機(jī)能變化及其病理特點(diǎn)

姜永田1滕海軍2張 棟3謝 東1

(1 濰坊醫(yī)學(xué)院研究生系研究生教研室，濰坊市 261000，E-mail：yongtian818@163.com；2 中國人民解放軍第89醫(yī)院脊柱外科，濰坊市 261021；3 山東省淄博市臨淄區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科，淄博市 255400)

目的 探討水下沖擊波致兔脊髓損傷的神經(jīng)機(jī)能變化及其病理特點(diǎn)。方法 選取48只新西蘭大白兔隨機(jī)分為A、B、C、D組各12只，通過手術(shù)將大白兔脊髓暴露后將其固定于封水倉內(nèi)，僅椎板切除段脊髓外露于沖擊波作用之下，用銨松蠟炸藥2 g為水下爆源，其中A、B、C組分別按沖擊波到達(dá)脊髓表面的超壓峰值2.6 MPa、2.8 MPa、3.0 MPa致傷，檢測沖擊波的超壓峰值及作用時(shí)間。D組不致傷，作為對照組。通過BBB法運(yùn)動(dòng)學(xué)評分、體感誘發(fā)電位檢測、脊髓組織蘇木精-伊紅(HE)染色及透射電鏡觀察，評估各組水下沖擊波致脊髓損傷后的神經(jīng)機(jī)能變化及病理特點(diǎn)。結(jié)果 水下沖擊波致傷后，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均癱瘓，D組沒有癱瘓。致傷12 h及24 h后A組、B組、C組的BBB評分依次減低(P<0.05)，且均低于D組(P<0.05)；致傷24 h后A、B、C各組大白兔BBB評分低于致傷12 h后(P<0.05)。致傷12 h及24 h后A組、B組、C組的體感誘發(fā)電位潛伏期依次延長(P<0.05)，且均高于D組(P<0.05)；波幅依次下降(P<0.05)，且均低于D組(P<0.05)。與致傷12 h后比較，A組、B組、C組致傷24 h后的潛伏期均延長(P<0.05)，A組及B組波幅均下降(P<0.05)。致傷48 h時(shí)組織形態(tài)學(xué)和電鏡下示A組、B組、C組脊髓出血壞死，結(jié)構(gòu)破壞，髓鞘板層分層，軸索變形水腫，A組、B組、C組動(dòng)物脊髓HE染色陽性率依次降低(P<0.05)，且均低于D組(P<0.05)。結(jié)論 水下沖擊波可造成水下動(dòng)物脊髓損傷，其致傷程度與動(dòng)物接受的爆炸沖量有關(guān)，且在一定時(shí)間內(nèi)存在繼發(fā)性損傷。

脊髓損傷；水下沖擊波；神經(jīng)機(jī)能；病理；兔

水下沖擊傷是現(xiàn)代戰(zhàn)爭中的一種常見傷，尤其在島嶼作戰(zhàn)和登陸作戰(zhàn)中常見，以往戰(zhàn)爭中水下沖擊傷發(fā)生率較高[1]，其死亡率高[2]。20世紀(jì)60～70年代國外曾對水下沖擊傷的防護(hù)進(jìn)行了大量研究；國內(nèi)對水下沖擊傷也做了一系列研究，在沖擊損傷機(jī)制、生物力學(xué)響應(yīng)、人體耐受性及防護(hù)研究等取得了一定成果[3]。隨著對水下沖擊傷研究的深入，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)水下沖擊波不僅對空腔臟器可造成損傷，對實(shí)質(zhì)臟器(如中樞神經(jīng)系統(tǒng))也可造成傷害[4]。本實(shí)驗(yàn)旨在探索水下沖擊波對脊髓造成損傷的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心提供的成年新西蘭大白兔48只(許可證號：41880120)，雌雄不限，體重2.1～2.6 kg，3～4個(gè)月齡。飼料配方為10%豬油、37%蔗糖混合53%基礎(chǔ)飼料，由江蘇雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料有限公司配制，上、下午各喂養(yǎng)1次。采用隨機(jī)區(qū)組法將大白兔分為分為 A、B、C、D組各12只，將大白兔固定于封水倉內(nèi)，僅椎板切除段脊髓外露于沖擊波作用之下，A、B、C組(實(shí)驗(yàn)組)分別按照沖擊波到達(dá)脊髓表面的不同超壓峰值(2.6 MPa、2.8 MPa、3.0 MPa)致傷，D組不致傷，作為對照組。術(shù)前所有大白兔均采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)法[5]行運(yùn)動(dòng)學(xué)評分，均完全正常。術(shù)前各組均行體感誘發(fā)電位檢測，4組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 術(shù)前各組動(dòng)物體感誘發(fā)電位潛伏期和波幅(x±s)

1.2 主要試劑及儀器 3%戊巴比妥鈉注射液(美國Sigma公司，批號：F20140205)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(上?；瘜W(xué)總公司試劑分部，批號：150723)，生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司，型號CX21)，肌電圖誘發(fā)電位儀 (丹麥丹迪公司，型號NDI-092)，水下壓力自動(dòng)測試儀 (杭州美控自動(dòng)技術(shù)有限公司，型號R2008S)，銨松蠟炸藥2 g(龍海爆破研究所，批號140603)，實(shí)驗(yàn)水槽(中國人民解放軍第89醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，型號QT0357D)。

1.3 方法

1.3.1 水下沖擊波參數(shù)測定：水下爆炸源采用銨松蠟炸藥2 g，水下0.3 m實(shí)驗(yàn)水槽中心位置安置爆炸源。固定爆炸源，調(diào)整傳感器與其的距離，記錄產(chǎn)生超壓峰值為2.6 Mpa、2.8 Mpa、3.0 Mpa時(shí)的爆炸源與傳感器的距離，實(shí)驗(yàn)時(shí)將相應(yīng)分組的大白兔放置在此，并應(yīng)用杭州美控自動(dòng)技術(shù)有限公司研發(fā)的R2008S沖擊波測試分析系統(tǒng)分別檢測距離爆炸源不同距離的沖擊波超壓峰值和持續(xù)時(shí)間。

1.3.2 脊髓沖擊傷模型的建立：用濃度為3%戊巴比妥鈉注射液(25 mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈對大白兔進(jìn)行麻醉，備皮，將四肢及頭部俯臥位固定于特制的固定架上。以T9為中心取背部正中皮膚切口，長約6 cm，暴露 T8～T10。咬除椎板，充分顯露硬脊膜。調(diào)制水溫為30℃左右，將A、B、C 3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別放置于水下1 m的實(shí)驗(yàn)水槽中，制作通氣道保證呼吸正常進(jìn)行，選用質(zhì)地結(jié)實(shí)的橡膠覆蓋實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部，對重要臟器給予保護(hù)，橡膠板開一直徑為5 cm圓孔，顯露脊柱脊髓實(shí)驗(yàn)區(qū)域，將特制銨松蠟炸藥2 g分別安置于距爆炸源不同距離處，調(diào)節(jié)脊髓節(jié)段垂直于爆炸沖擊波傳導(dǎo)的方向，調(diào)整好位置使之正好對準(zhǔn)暴露的硬脊膜，檢驗(yàn)動(dòng)物模型是否穩(wěn)定、牢固；電子發(fā)爆器水下引爆。按 A、B、C組分別以2.6 Mpa、2.8 Mpa、3.0 Mpa超壓峰值壓力，給T8～T10節(jié)段實(shí)施單次沖擊。D組動(dòng)物暴露脊髓后放于水中，不作水下沖擊波沖擊。動(dòng)物納入實(shí)驗(yàn)組的標(biāo)準(zhǔn)為：(1)動(dòng)物存活；(2)大白兔雙后肢不同程度的抽搐、尾巴搖擺；(3)家兔背部僅傷及皮膚，皮下組織無穿透傷。大白兔致傷后，每日肌注青霉素3萬U/次，每2次/d、按摩膀胱協(xié)助排尿，各組分籠飼養(yǎng)，喂養(yǎng)同術(shù)前，各組無區(qū)別。

1.3.3 運(yùn)動(dòng)學(xué)評分：分別于沖擊波沖擊前、沖擊后12 h和24 h，采用雙盲法根據(jù)BBB評分法分別對各組大白兔進(jìn)行評分，每只兔子至少觀察5 min。本實(shí)驗(yàn)中BBB評分≥16分記為正常，BBB評分<16分記為癱瘓[6]。

1.3.4 體感誘發(fā)電位：分別于沖擊波沖擊前、沖擊后12 h和24 h，將所有大白兔麻醉后固定于固定架上，將針式電極作為記錄電極，置于兩耳連線與矢狀縫交點(diǎn)，大白兔鼻根部接參考電極，前肢貼地。在單側(cè)后肢跟腱內(nèi)上方放置叉狀刺激電極，采用波寬為0.2 ms的脈沖電流以3 Hz的頻率刺激兔單側(cè)脛后神經(jīng)，以刺激兔趾輕微抽搐為準(zhǔn)，電流3～4 mA，分析時(shí)間為 15 ms，平均行80～100次檢測。

1.3.5 組織形態(tài)學(xué)檢查：于沖擊波沖擊后48 h將所有大白兔麻醉，然后用4%多聚甲醛-磷酸緩沖固定液經(jīng)左心室行心臟灌注固定，解剖椎管，取2 cm T9～T10節(jié)段脊髓，放入4﹪多聚甲醛液中2周后，脫水，石蠟包埋，每隔6張取1張，行橫斷面切片，常規(guī)HE染色。各組12只大白兔全部納入計(jì)數(shù)，每只計(jì)數(shù)5張，400倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選取損傷部位中心左側(cè)和右側(cè)視野各一，由不了解實(shí)驗(yàn)進(jìn)程及分組情況的人員觀察脊髓組織神經(jīng)元的形態(tài)變化，并手工計(jì)數(shù)，取每張切片兩側(cè)視野正常神經(jīng)元的數(shù)量之和的平均值，即為每個(gè)標(biāo)本存活神經(jīng)元數(shù)量的平均值。

1.3.6 透射電鏡下觀察：于沖擊波沖擊后48 h將2 cm T9～T10節(jié)段脊髓先在2.5%戊二醛中固定6 h，用pH 7.4的磷酸緩沖液充分清洗后，再用1%鋨酸固定，脫水、包埋，行超薄切片，每張厚50～60 mm，透射電鏡下觀察各組脊髓神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)變化，透射電鏡下觀察結(jié)構(gòu)有無破壞，髓鞘板層有無分層，軸索有無變形水腫，并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組均數(shù)比較方差齊時(shí)采用t檢驗(yàn)，方差不齊則采用t′檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組水下沖擊波物理參數(shù) 隨著距離爆心距離越遠(yuǎn)，水下沖擊波超壓峰值越大(P<0.05)，但各組持續(xù)時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組水下沖擊波物理參數(shù)(x±s)

注：與C組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

2.2 肢體運(yùn)動(dòng)學(xué)評分 水下沖擊波致傷后12 h及24 h，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均為癱瘓，對照組D組沒有癱瘓。沖擊后12 h及24 h A組、B組、C組的BBB評分依次減低(P<0.05)，均低于D組。沖擊后24 h實(shí)驗(yàn)組(A、B、C)各組大白兔的BBB評分較12 h降低(P<0.05)。見表3。

表3 致傷后12 h和24 h各組動(dòng)物BBB評分(x±s，分)

注：與A組比較，#P<0.05； 與B組比較，*P<0.05；與C組比較，▲P<0.05。

2.3 致傷后12 h和24 h各組動(dòng)物體感誘發(fā)電位潛伏期和波幅 體感誘發(fā)電位沖擊后12 h及24 h A組、B組、C組的體感誘發(fā)電位潛伏期依次延長(P<0.05)，且均高于D組(P<0.05)，波幅依次下降(P<0.05)，且均小于D組(P<0.05)。與沖擊后12 h比較，A組、B組、C組沖擊后24 h的潛伏期均延長(P<0.05)，A組及B組波幅均減小(P<0.05)。見表4。

表4 致傷后12 h和24 h各組動(dòng)物體感誘發(fā)電位潛伏期和波幅(x±s)

注：與A組比較，#P<0.05； 與B組比較，*P<0.05；與C組比較，▲P<0.05。

2.4 4組脊髓組織形態(tài)學(xué)改變及存活神經(jīng)元數(shù)量 致傷后48 h，A組脊髓出現(xiàn)少量散在出血壞死灶，正常神經(jīng)細(xì)胞比例減少不明顯；B組可見較多散在出血壞死灶，以灰質(zhì)為主；C組可見灰質(zhì)大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，白質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞脫髓鞘化嚴(yán)重，正常神經(jīng)細(xì)胞比例減少至(28.21±2.52)%；D組脊髓組織無明顯改變，正常神經(jīng)細(xì)胞比例為(96.23±1.09)%。A、B、C組動(dòng)物脊髓HE染色陽性率依次降低(P<0.05)，且均低于D組(P<0.05)。見表5。

表5 致傷后48 h各組動(dòng)物脊髓HE染色陽性率(x±s，%)

注：與A組比較，#P<0.05； 與B組比較，*P<0.05；與C組比較，▲P<0.05。

2.5 電鏡下觀察情況 A組髓鞘板層略有分層，近端軸管內(nèi)密度不均，微管減少，軸索變形、變性，水腫。B組髓鞘板層分層，軸索變形，軸索內(nèi)微管明顯減少，部分髓鞘與軸索剝離、腫脹。C組髓鞘板層分層，水腫、出血，呈“洋蔥樣”改變，部分髓鞘與軸索剝離；水下沖擊傷后髓鞘局灶性疏松，近側(cè)軸索內(nèi)線粒體腫脹、變性。D組正常。

3 討 論

沖擊傷是指沖擊波共同作用于機(jī)體所產(chǎn)生的各種損傷，主要由超壓和負(fù)壓引起。沖擊波在水下由于水底硬度和密度的不同，反射和吸收的量也會(huì)有所差異?？諝饷芏燃s為水的1/800，且壓縮性和稀散性遠(yuǎn)高于水，故水下沖擊波相對空氣沖擊波具有傳播速度快、傳播距離遠(yuǎn)的特點(diǎn)，其致傷效應(yīng)也與空氣沖擊波有所不同[7-8]。水下沖擊波的傳播速度是相同強(qiáng)度空氣沖擊波的3.2～4.1倍，相同質(zhì)量三硝基甲苯水下爆炸是等距離地面爆炸壓力值的227.1～247.2倍，沖量的8.2～11.2倍。當(dāng)沖擊波在水中傳播至剛性障礙物，如礁石或水底時(shí)會(huì)發(fā)生反射，放大沖擊波效應(yīng)；當(dāng)水下沖擊波傳至水與空氣的交界面時(shí)，會(huì)反射而形成水中的拉伸波。水下沖擊波物理參數(shù)的特征表現(xiàn)為峰值壓力高，前沿上升時(shí)間僅數(shù)微妙，沖量大，但持續(xù)時(shí)間僅為數(shù)百微秒級。沖擊傷的發(fā)生機(jī)制包括碎裂效應(yīng)、內(nèi)爆效應(yīng)、慣性效應(yīng)、壓力差效應(yīng)、血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)、負(fù)壓與肺泡擴(kuò)張效應(yīng)、生物力學(xué)效應(yīng)等[9]。水下沖擊波對生物的殺傷效應(yīng)顯著強(qiáng)于空氣沖擊波，肺和腹腔臟器的損傷是早期救治的重要環(huán)節(jié)，損傷發(fā)生率高、死亡率高。

既往很多學(xué)者對水下沖擊波對空腔臟器的損傷進(jìn)行了大量研究，并且基本掌握了水下沖擊波致空腔臟器損傷的規(guī)律[10-14]。在實(shí)踐中，絕大多數(shù)水下沖擊波會(huì)造成肺等空腔臟器損傷，致動(dòng)物死亡。近年來發(fā)現(xiàn)水下沖擊波對神經(jīng)組織也會(huì)造成損傷[4]。本實(shí)驗(yàn)在保護(hù)動(dòng)物其他臟器的前提下，觀察了水下沖擊波致脊髓損傷后的神經(jīng)機(jī)能變化以及病理學(xué)特點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，沖擊后12 h及24 h A組、B組、C組的BBB評分依次減低(P<0.05)，提示隨著水下沖擊波超壓峰值增高，大白兔癱瘓程度也加重。且在沖擊后12 h及24 h，隨著水下沖擊波超壓峰值增高，大白兔體感誘發(fā)電位的潛伏期逐漸延長、波幅逐漸減小(P<0.05)，表明脊髓損傷程度的逐漸加重。沖擊后24 h A組、B組、C組的BBB評分和體感誘發(fā)電位的改變較12 h加重，提示水下脊髓沖擊傷后存在繼發(fā)性損傷，導(dǎo)致脊髓損傷逐漸加重。傷后48 h組織光鏡結(jié)果顯示，隨著水下沖擊波超壓峰值增高，大白兔脊髓灰質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞壞死、白質(zhì)脫髓鞘化增多，壞死區(qū)逐漸增多，存活的正常神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，神經(jīng)細(xì)胞脫髓鞘加重。表明水下沖擊波致脊髓損傷時(shí)，脊髓損傷程度與沖擊波的當(dāng)量呈正相關(guān)。這提示水下脊髓沖擊傷患者應(yīng)及早救治，防止受傷后由于繼發(fā)性損傷導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元發(fā)生不可逆損傷，對脊髓的防護(hù)也尤為重要。

目前，由于實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)的不同，得到的數(shù)據(jù)差異性較大，以及動(dòng)物與人體的實(shí)際差異性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得的定量數(shù)據(jù)不可推論到人體。在脊髓水下沖擊傷中，脊髓凋亡細(xì)胞類別及其凋亡機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。脊髓水下沖擊傷往往不是作為單一的損傷存在，水下沖擊波造成的肺、胃、肝等空腔臟器的損傷對機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改變，是否參與脊髓的繼發(fā)性損傷也需要進(jìn)一步研究。

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Neuro-electrophysiological changes and pathological features of spinal cord injury caused by underwater shock waves in rabbits

JIANGYong-tian1,TENGHai-jun2,ZHANGDong3,XIEDong1

(1DepartmentofPostgraduate,SchoolofPostgraduate,WeifangMedicalCollege,Weifang261000,China; 2DepartmentofSpinalSurgery,the89thHospitaloftheChinesePeople′sLiberationArmy,Weifang261021,China; 3DepartmentofSpinalSurgery,LinziDistrictPeople′sHospitalofZiboCity,ShandongProvince,Zibo255400,China)

Objective To explore the neuro-electrophysiological changes and pathological features of spinal cord injury caused by underwater shock waves in rabbits.Methods Forty-eight New Zealand rabbits were randomly divided into Group A,Group B,Group C and Group D,with 12 rabbits in each group.After surgical exposure of spinal cord,the rabbits were fixed in the sealing water storehouse,and only the spinal cords with laminectomy were exposed to shock waves.Ammonium nitraterosin paraffin explosive with the dose of 2 g was taken as underwater blasting source.The rabbits of Group A,Group B and Group C were vulnerated by the overpressure peaks of 2.6 MPa,2.8 MPa,3.0 MPa from shock waves to spinal cord surfaces,respectively.The overpressure peak and actuation duration were measured.Group D was not vulnerated and was taken as control.The neuro-electrophysiological changes and pathological features of spinal cord injury in each group were evaluated using BBB Kinematics score,somatosensory evoked potential,hematoxylin-eosin(HE) staining of spinal cord tissues and transmission electron microscopy after spinal cord injury caused by underwater shock waves.Results After 12 hours of injury caused by underwater shock waves,paralysis was observed in all rabbits in the experimental groups,but not in Group D.After 12 and 24 hours of injury,the BBB scores decreased in the order of Group A,Group B and Group C(P<0.05),and the scores of these three groups were lower than the score of Group D(P<0.05).The BBB score after 24 hours of injury was lower than that after 12 hours of injury in Group A,Group B or Group C(P<0.05).After 12 and 24 hours of injury,the latent period of somatosensory evoked potential prolonged in the order of Group A,Group B and Group C(P<0.05),and the potential of these three groups were higher than that of Group D(P<0.05).And the amplitude of somatosensory evoked potential decreased in the order of Group A,Group B and Group C(P<0.05),and the amplitude of these three groups were lower than that of Group D(P<0.05).The latent period was longer in Group A,Group B or Group C,and the amplitude decreased after 24 hours of injury in Group A or Group B compare to those after 12 hours of injury(P<0.05).After 48 hours of injury,the results of histomorphology and electron microscopy showed that hemorrhage and necrosis structure damage,myelin layered plate layer,axonal deformation edema were observed in the spinal cords of Group A,Group B and Group C.The positive rate of HE staining of spinal cord tissues decreased in the order of Group A,Group B and Group C(P<0.05),and the rates of these three groups were lower than that of Group D(P<0.05).Conclusion Underwater shock wave can cause underwater spinal cord injury in animals,and the severity of injury is associated with the explosion impulse accepted,and the secondary injury exists during a certain period.

Spinal cord injury,Underwater shock waves,Nervous function,Pathology,Rabbit

姜永田(1989～)，男，在讀碩士研究生，研究方向：脊柱外科。

滕海軍(1970～)，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：脊柱外科，E-mail：tenghaijun89@163.com。

R 651.21

A

0253-4304(2016)04-0457-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.04.03

2015-11-30

2016-02-18)