馬陽王紅

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血管內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖與遷移的研究進展*

馬陽①②王紅②

【摘要】血管內(nèi)皮祖細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，亦稱為成血管細(xì)胞。隨著近年來血管性疾病的增多，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞在動脈硬化性狹窄及閉塞性病變方面的作用越來越受到人們重視。但內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力成為制約其運用的一大障礙。筆者通過大量閱讀文獻(xiàn)，就血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖與遷移方面作一綜述。

【關(guān)鍵詞】血管內(nèi)皮祖細(xì)胞； 增殖； 遷移

①昆明醫(yī)科大學(xué) 云南 昆明 650500

②成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院

First-author’s address：Kunming Medical University，the General Hospital of People’s Liberation Army in Kunming，Kunming 650500，China

血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類能增殖、遷移并直接分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。在血管性疾病多發(fā)的今天，血管內(nèi)皮障礙作為始動環(huán)節(jié)貫穿整個動脈硬化、狹窄、損傷的過程。而試驗中已經(jīng)證實，EPCs的動員、增殖、歸巢可提高缺血組織的血管新生，從骨動員后通過直接分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞和歸巢到損傷血管局部，通過旁分泌途徑指導(dǎo)損傷的血管內(nèi)皮修復(fù)，更換受損的內(nèi)皮細(xì)胞［1］。但是EPCs的體外擴增十分困難，想要大規(guī)模運用于臨床還有著其局限性，國內(nèi)外對其研究也處于起步階段。因此，本文就血管內(nèi)皮祖細(xì)胞如何在體內(nèi)外擴增的研究進展作一綜述。

1　EPCs的概況

1.1EPCs的來源 自1997年Asahara等［2］首次將EPCs從成人外周血中分離出來，并證實其能表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，分化成為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞。有些文獻(xiàn)［2-3］認(rèn)為EPCs與造血干細(xì)胞同起源于胚外中胚層卵黃囊的血島，由血液/血管母細(xì)胞發(fā)育而來。目前有研究證實，EPCs在成人體中主要分布于外周血、骨髓和脾等。機體在需要時能在血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-csf）等細(xì)胞因子的作用下從骨髓增殖、遷移、歸巢到血管受損部位參與修復(fù)活動。

1.2EPCs的特性與表面標(biāo)記 血管內(nèi)皮祖細(xì)胞作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體，兩者的特性既有相似的地方又有所區(qū)別。EPCs既表達(dá)內(nèi)皮系特異抗原vWF、CD31、CD34等，又表達(dá)特殊的CD133表面標(biāo)記，同時EPCs具有高增殖和歸巢特性。目前比較公認(rèn)的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)志物為CD34、CD133、VEGFR-2。

CD34是我們熟知的造血干細(xì)胞標(biāo)記物之一，是白細(xì)胞分化抗原的一種，其廣泛表達(dá)于內(nèi)皮干細(xì)胞。早期試驗中常用CD34+來富集EPCs，富集出的細(xì)胞能夠分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，推測大多數(shù)為EPCs。但最近有研究證實CD34-細(xì)胞群中也有EPCs的存在［4］。使得此種富集細(xì)胞的方法受到挑戰(zhàn)。

VEGFR-2（即人的KDR，鼠的Flk-1）也是EPCs高度富集的標(biāo)志之一。作為從干細(xì)胞轉(zhuǎn)換為成熟內(nèi)皮細(xì)胞最早表達(dá)的分子標(biāo)記，其配體對EPC有陽性趨化的作用。

CD133是近年來新發(fā)現(xiàn)的，具有5個跨膜結(jié)構(gòu)域的糖基化多肽。它的分子質(zhì)量為1 200 000，選擇性表達(dá)于造血干/祖細(xì)胞。體外研究發(fā)現(xiàn)，CD133僅表達(dá)于血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，而在分化過程中其逐漸消失，不表達(dá)于成熟內(nèi)皮細(xì)胞。因此，它為目前用于分離、富集EPCs最重要的分子標(biāo)志。

在EPCs轉(zhuǎn)化為成熟細(xì)胞的過程中，經(jīng)過各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化，能夠吸收乙?；兔芏戎鞍祝╝cLDL）并與荊豆凝集素-1（UEA-1）結(jié)合，然后其表面標(biāo)志CD133+的表達(dá)逐漸減弱至2周后完全消失而成熟內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志如CD31+、E-鈣粘附素、vWF等的表達(dá)增多［5］。而到底是哪些基因在調(diào)控此過程還屬未知。

2　EPCs的分離

EPCs存在于外周血（如臍帶血）、骨髓和脾中，故各研究多取這些組織做試驗。在早期對EPCs的分離中多采用免疫磁珠法，原理即血管內(nèi)皮祖細(xì)胞表面抗原與磁珠表面包被的抗體反應(yīng)，再將其置于磁場之中，被結(jié)合的細(xì)胞就會在磁場力的作用下與其余細(xì)胞分群，如此就可以篩選出特定的細(xì)胞來。此種方法雖然能獲得較純的EPCs，但是數(shù)量過于稀少，不能滿足科學(xué)研究的需要。近年來，試驗多使用密度梯度離心法來篩選EPC。此種方法通過離心機的離心力達(dá)到沉降平衡，使細(xì)胞處于一種梯度的分布，然后可以直接收獲位于界面層的單個核細(xì)胞，如此可大量篩選出試驗用細(xì)胞。篩選出可用細(xì)胞后需要用倒置相差顯微鏡觀察獲得細(xì)胞形態(tài)并用流式細(xì)胞儀檢測分子表面特征如CD34、CD14、CD31，尤其是CD133的陽性百分率來鑒定EPCs

3　EPCs的增殖和遷移

3.1TRPC-1 TRPC-1（Transient Receptor Potential Cannonical-1）是瞬時受體電位家族的一員，人體中的TRPC通道很類似于果蠅的TRP通道。TRPC-1也是被首先在果蠅身上發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是負(fù)責(zé)響應(yīng)蒼蠅的視覺［6］。結(jié)構(gòu)上看，這一家族的成員之間很類似，都可以非選擇性的透過陽離子，不同成員間Ca2+和Na+的選擇性不同。TRPC-1主要定位于EPCs的質(zhì)膜，已有研究試驗發(fā)現(xiàn)，Ca2+含量的減少可觸發(fā)SOCE（Store-operated Ca2+entry）的傳感器STIM1，TRPC-1可以與STIM1和ORAI結(jié)合形成一個三原復(fù)合物［7］，通過調(diào)節(jié)SOCE來調(diào)控EPCs的增殖和遷移［8］。在早期的研究中已經(jīng)有報道指出TRPC1是廣泛參與血管系統(tǒng)的發(fā)展和功能的維護，如抑制TRPC的特殊位點來抑制血管損傷后的平滑肌細(xì)胞增生。而對于血管內(nèi)皮祖細(xì)胞來說，Kuang等［9］發(fā)現(xiàn)可以通過兩種RNA沉默的方法下調(diào)TRPC-1來抑制血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和遷移，他們在試驗中通過RNA轉(zhuǎn)染的方法敲除TRPC-1基因，結(jié)果SOCE被抑制，細(xì)胞周期停滯于G1期。從目前細(xì)胞基因表達(dá)的結(jié)果來看，循環(huán)PCR基因芯片顯示，9個基因（AK1，BRCA2，camk2b，p21，DDIT3，INHA，slfn1，MDM2，和Prm1）可以上調(diào)，4個基因（BCL2，mki67，PMP22，和 ppp2r3a）表達(dá)下調(diào)，并且Kuang等［9］發(fā)現(xiàn)一個Schlafen 1-blocking peptide可以部分逆轉(zhuǎn)非正常細(xì)胞的周期分布并誘導(dǎo)EPCs增殖和遷移。由此推斷出TRPC1可能是誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)血管的新靶點，是一種調(diào)節(jié)EPCs生物學(xué)特性的新機制。

3.2ID1 ID1（inhibitor of DNA binding 1，DNA結(jié)合抑制因子）是HLH（helix-loop-helix，螺旋-環(huán)-螺旋）轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，因為其缺乏HLH二聚體功能區(qū)外堿性DNA結(jié)合域，所以可以形成無功能異二聚體，對轉(zhuǎn)錄起負(fù)調(diào)節(jié)的作用。ID1在人體很多系統(tǒng)都可以參與增殖分化，而近年來，人們漸漸把目光投入到ID1與EPCs的關(guān)系中來。2007年Jankovic等［10］的試驗就提示了ID1可能參與調(diào)控EPCs增殖形成新的血管，IDl缺失還可導(dǎo)致生成血管前基因，如整合素Q6的下調(diào)，由此抑制血管發(fā)生［11］。ID1已被證明可以增殖骨髓和脾源性的EPCs［12］。為了闡述清楚ID1是否是調(diào)控EPCs增殖的關(guān)鍵因子，它又是通過什么機制來調(diào)控的，國內(nèi)外進行了大量的試驗研究。

3.2.1ID1-E2-2途徑 現(xiàn)有研究已揭示ID1主要通過兩種途徑參與細(xì)胞增殖調(diào)控。其一，ID1可與bHLH轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，形成無功能的異二聚體阻斷p53、p21基因的表達(dá)；或者與啟動子區(qū)域的位點如E-box（CANNTG）、N-box（CACNAG）等結(jié)合，通過調(diào)節(jié)各種被激活的蛋白來調(diào)控。通過酵母雙雜交技術(shù)，篩選小鼠文庫，最終獲得一個目的基因編碼E2-2蛋白。早先Einarson等［13］的研究認(rèn)為轉(zhuǎn)錄因子E2-2在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起到促進神經(jīng)增長的關(guān)鍵作用，2010年Ghosh等［14］的研究也證實E2-2可以促進成熟淋巴細(xì)胞增殖。之后的試驗提示此蛋白屬于E蛋白家族，可以與ID1結(jié)合形成二聚體來抑制bHLH，可能在血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖與遷移中也起到重要作用。在內(nèi)皮細(xì)胞的增長中有一種十分特殊的細(xì)胞因子（scular endothelial growth factor，VEGF）VEGF-2，它的缺乏可導(dǎo)致明顯的血管生成障礙，提示其在傳輸細(xì)胞信號及促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移等過程中是一個關(guān)鍵的受體。現(xiàn)有證據(jù)已經(jīng)可以證明E2-2可以通過與VEGFR-2啟動子特異性結(jié)合抑制成熟內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，將其敲除后內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯增強。

3.2.2ID1-P13K/Akt/NFkB途徑 之前就有報道稱ID1可能通過P13K/Akt/NFkB對腫瘤細(xì)胞的增殖起著重要的調(diào)控作用［15］。他們使用siRNA轉(zhuǎn)染來抑制ID1的表達(dá)，顯著降低PI3K/Akt和NFkB信號通路的表達(dá)。Li等［16］在體外試驗中通過重組腺病毒載體表達(dá)ID1，同時使用小分子干擾RNA沉默ID1表達(dá)來做對照，并使用anti-P13K，anti-Akt，anti-NFkB抗體等對試驗進行控制。結(jié)果顯示使用Id1體外轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)Akt通過PI3K的磷酸化，ID1刺激細(xì)胞增殖，上調(diào)p-PI3K，p-Akt蛋白，p-IJB，并可以通過NFkB通道增加凋亡抑制基因的表達(dá)，證實了ID1通過活化PI3K/Akt/NFkB/survivin通路來促進EPCs的增殖。Id1/PI3K/Akt/NFjB/survivin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在EPC和腫瘤系統(tǒng)中的作用有許多相似之處，但是不像腫瘤細(xì)胞或組織，ID1，PI3K/Akt，NFkB，和Survivin在靜態(tài)內(nèi)皮祖細(xì)胞的基礎(chǔ)表達(dá)幾乎檢測不到，在內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)功能中ID1與PI3K/Akt/NFkB/survivin之間的關(guān)系在很大程度上是未知的，這也是以后的研究方向。

3.3bFGF和PDGF-BB 近年來的研究發(fā)現(xiàn)bFGF（堿性成纖維細(xì)胞生長因子）和PDGF-BB（血小板源性生長因子）具有協(xié)同作用，可以促進血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和遷移。bFGF是成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）家族的一員，由于其等電點呈堿性且對酸和熱敏感，故命名為堿性成纖維細(xì)胞生長因子。血小板衍生因子（PDGF）具有3種二聚體結(jié)構(gòu)，PDGF-BB是其中之一，具有促進細(xì)胞群分裂與增殖的能力。兩者基本原理都是依靠其受體激活下游的分子來起到調(diào)控作用。通常，人們認(rèn)為PLC-C是與細(xì)胞增殖和分化等有關(guān)的關(guān)鍵分子［17］，Guo等［18］使用了PDGF受體激酶拮抗劑（AG1296）和選擇性PLC抑制劑（U73122）作對照，評估了bFGF和/或PDGF-BB處理過的內(nèi)皮祖細(xì)胞在缺少和有bFGF抗體存在的情況下PDGFRB mRNA的表達(dá)。結(jié)果有力地表明，堿性成纖維細(xì)胞生長因子可以觸發(fā)PDGFRB mRNA的轉(zhuǎn)錄活性，bFGF和PDGF-BB可促進內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和遷移，特別是bFGF和PDGF-BB的協(xié)同作用影響更為顯著。

4　討論

由于篇幅所限，載脂蛋白A-I模擬肽D-4F通過eNOS/NO途徑、雌激素通過雌激素受體和P13K途徑、肝細(xì)胞生長因子的過表達(dá)等等促進血管內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和遷移的方法不再一一贅述［19-21］。隨著近年來研究的深入，人們對血管內(nèi)皮祖細(xì)胞在各領(lǐng)域所能發(fā)揮的作用表現(xiàn)出了極大的關(guān)注。EPCs在血管損傷修復(fù)，靶向治療，血管新生及生物學(xué)特性等都有著無可估量的使用前景。但是由于現(xiàn)有技術(shù)層面的局限，EPCs有限的增殖能力已是制約EPCs研究進展的一大瓶頸，其有沒有更加特異性的表面標(biāo)記，如何分離、純化單個的EPC，提取出來的EPCs又如何保持體外增殖、遷移，這其中的機制又是如何還有待解答，所以未來的研究任務(wù)依然艱巨。

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Research Progress in Proliferation and Migration of Endothelial Progenitor Cells

MA Yang，WANG Hong.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：133-136

【Abstract】The endothelial progenitor cells（EPCs）are precursor cells of vascular endothelial cells，which are also known as angioblasts.With the increase of vascular disease in recent years，the function and mechanism of endothelial progenitor cells in atherosclerotic stenosis and occlusive disease areas get more and more attention.However，its clinical application is limited to the poor proliferation capacity.Now we reviewe the latest developments in the proliferation and migration of endothelial progenitor cells in this article.

【Key words】Endothelial progenitor cells； Proliferation； Migration

*基金項目：國家自然科學(xué)基金（NSFC.NO.81270224）

通信作者：王紅

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.038

收稿日期：（2015-12-31） （本文編輯：劉蕾）