施琳琳 陳建永 徐 虹 章佳穎

大黃素維持肝硬化大鼠高動力循環(huán)狀態(tài)下腸屏障完整性實驗研究

施琳琳 陳建永 徐 虹 章佳穎

目的觀察大黃素對肝硬化大鼠高動力循環(huán)狀態(tài)下腸屏障完整性的維持作用。方法SD雄性大鼠25只，隨機分為對照組5只、肝硬化模型組10只、大黃素干預組10只，模型組與干預組予500mL/L四氯化碳（3mL/100g）皮下注射復制肝硬化大鼠模型，對照組大鼠給予生理鹽水（3mL/ 100g）皮下注射，均為8周。干預組制模第15天起予大黃素（5mg/mL，5mL/kg）灌胃，對照組和模型組每日給予相當體積的生理鹽水灌胃，均1天1次。8周后處死大鼠，行墨汁推進試驗測定腸道傳輸功能，測定門脈壓力，血清生化指標測定，取末端回腸組織及肝臟組織觀察組織病理學改變，腸黏膜TUNEL凋亡檢測。結(jié)果（1）大鼠小腸黏膜損傷：模型組＞干預組＞對照組（P＜0.05）。（2）門脈壓力:模型組（13.73±1.81）mmHg，較對照組（5.64±0.88）mmHg顯著升高（P＜0.05），大鼠明顯處于高循環(huán)狀態(tài)；干預組門脈壓力（10.25±1.47）mmHg，較模型組明顯降低（P＜0.05）。（3）血清生化指標（ALT、AST、TB、ALP）水平：模型組[（594.22±317.82）U/L，（1008.33±778.70）U/L，（6.00±5.29）μmol/L，（802.78± 396.94）U/L]較對照組[（60.20±21.30）U/L，（149.80±43.03）U/L，（1.00±0.44）μmol/L，（196.20±31.29）U/L]顯著升高（P＜0.05）；干預組[（292.20±140.12）U/L，（350.40±173.35）U/L，（2.49±1.10）μmol/L，（552.20± 303.37）U/L]較模型組明顯降低（P＜0.05）；ALB模型組（16.29±1.26）g/L較對照組（23.42±1.56）g/L明顯下降（P＜0.05），干預組（18.89±1.02）g/L較模型組明顯上升（P＜0.05）。（4）腸道黑染百分比：模型組（68.05±2.09）%，較對照組（81.68±3.15）%明顯減少（P＜0.05）；干預組（74.50±4.28）%，較模型組明顯增加（P＜0.05）。（5）腸黏膜凋亡小體：模型組明顯多于對照組，而干預組大黃素干預后的小腸上皮細胞凋亡較模型組明顯下降。結(jié)論大黃素對肝硬化大鼠高動力循環(huán)狀態(tài)下腸屏障完整性有較好的維持作用。

大鼠；肝硬化；門脈高壓；腸屏障；大黃素

大黃素是一種葸醌類衍生物，主要來源于蓼科植物掌葉大黃根莖，其化學名稱為1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌（1，3，8-thihydroxy-6-methyl-anthraquinone）肝硬化可導致腸屏障功能的受損，腸道細菌及內(nèi)毒素發(fā)生移位，可導致多臟器功能障礙。以往研究表明大黃素有抗大鼠肝纖維作用，本研究探討大黃素對于肝硬化高動力循環(huán)大鼠的腸屏障保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物與造模 選擇健康成年雄性SD大鼠25只，體質(zhì)量（170±10）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，實驗動物使用許可證號：SCXK（滬）2012-0002；飼養(yǎng)室溫度22～23℃，環(huán)境濕度50%，喂以標準的大鼠飲食。分為正常對照組5只，肝硬化模型組10只，大黃素干預組10只。肝硬化模型組與大黃素干預組按Nakamura等[1]方法誘導肝硬化，500mL/L四氯化碳（3mL/100g）皮下注射，對照組大鼠給予生理鹽水（3mL/100g）皮下注射，均1周2次，共8周。干預組制作模型第15天起每日予大黃素（5mg/mL，5mL/kg）灌胃，1天1次，對照組與模型組予同容量的生理鹽水灌胃，1天1次；每周稱體質(zhì)量以調(diào)整給藥劑量。大鼠正常進食和飲水。

1.2 藥 品 四氯化碳（分析純，武漢化學試劑公司出品），臨用前用橄欖油稀釋，配成50%（v/v）的溶液。大黃素，純度≥98%，西安中鑫生物技術有限公司生產(chǎn)，臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配成5mg/mL大黃素混懸液。

1.3 墨汁推進實驗 實驗第8周采用墨汁推進實驗測定各組大鼠腸道傳輸功能，全部大鼠麻醉、取血處死后，立即剖腹取出幽門至直腸末段的全部腸道。在無張力狀況下測量腸道全長、小腸長度、大腸長度和墨汁在腸道內(nèi)推進的長度，并計算墨汁推進長度占腸道全長的百分比（黑染腸管長度/腸管總長度），最后計算每組平均值。

1.4 門脈壓力測定 大鼠麻醉后將接有三通的PE50導管（含有抗凝劑肝素鈉）插至腸系膜上靜脈與脾靜脈分叉處，固定導管并連接生理多導記錄儀測定門靜脈壓力（PVP）。

1.5 肝臟生化指標檢測 門靜脈壓力測定結(jié)束后，下腔靜脈抽取血液5mL，靜置1h后離心，立即檢測肝功能指標（ALT、AST、ALB、ALP）。

1.6 肝、小腸組織的留取及病理檢查 采各組大鼠新鮮肝臟組織及距回盲部10cm處末段回腸黏膜組織-70℃冰箱保存，部分組織用10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、脫水，4mm切片，作HE染色，光學顯微鏡下觀察病理變化并按Chiu氏法[2]進行腸道損傷病理分級；小腸黏膜損傷分為6級進行評分：0分：腸黏膜絨毛正常；1分：絨毛頂端上皮下出現(xiàn)囊狀間隙，并伴有毛細血管充血；2分：上皮下間隙擴大，中度固有層水腫.中央乳糜管擴張；3分：固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細胞變性、壞死，少數(shù)絨毛頂端脫落；4分：上皮細胞層變性壞死、脫落，部分絨毛脫落.固有層裸露，毛細血管擴張、充血；5分：絨毛脫落，固有層崩解，出血或潰瘍形成。

1.7 腸黏膜TUNEL凋亡檢測 腸黏膜石蠟切片，烤片2～3h脫蠟，用二甲苯浸洗2次，每次5min；用梯度乙醇（無水乙醇、95%、90%、80%、70%）各浸洗1次，每次3min，0.01M PBS沖洗3次，每次3min，將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，微波爐加熱（750W high）1min，立即浸入 20℃的雙蒸水冷卻，0.01M PBS沖洗進行抗原修復，滴加封閉用正常山羊血清，室溫孵育30min，傾去多余液體，勿洗，滴加50μL TUNEL反應液 37℃避光孵育 60min；0.01M PBS沖洗3次，每次3min；緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光波長450～500nm，檢測波長515～565nm（綠色），凋亡陽性位于細胞核，熒光顯微鏡下呈綠色熒光。每次都設立陰性對照。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，計量數(shù)據(jù)和病理評分采用兩獨立樣本比較的秩和檢驗（Mann-Whitney U檢驗），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 對照組與干預組大鼠全部存活；模型組大鼠死亡1只，所有存活大鼠均進入統(tǒng)計。肝臟肉眼觀：對照組大鼠肝臟顏色鮮紅，有光澤，質(zhì)地柔軟，表面光滑細膩；模型組大鼠肝臟體積縮小，顏色晦暗，質(zhì)地變硬，部分大鼠肝臟表面呈顆粒狀改變；干預組大鼠顏色較模型組大鼠鮮紅，質(zhì)地偏軟，顆粒狀改變不明顯。光鏡下：對照組肝臟標本肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞無變性壞死，未見纖維組織增生；模型組鏡下可見肝細胞變性、壞死，空泡樣變性，匯管區(qū)纖維組織增生，部分可見假小葉形成；干預組鏡下可見部分肝細胞出現(xiàn)氣球樣變，較模型組膠原纖維與網(wǎng)狀纖維沉積較少，假小葉少見，見圖1～4（插頁）。小腸：對照組大鼠腸上皮絨毛完整，上皮細胞下無間隙，間質(zhì)僅少量淋巴細胞浸潤；模型組大鼠腸道絨毛上皮細胞可見脫落、部分壞死，上皮下間隙擴大，部分伴有毛細血管充血，并可見較多中性粒細胞、淋巴細胞浸潤；干預組大鼠腸道絨毛上皮細胞壞死減少，毛細血管充血減少，淋巴管擴張不明顯，少量淋巴細胞浸潤，模型組大鼠病理損傷評分明顯高于對照組（P＜0.05），干預組較模型組評分有所下降（P＜0.05），見圖5～7（插頁）、表1。

表1 三組大鼠腸道損傷病理分級比較（只）

2.2 三組大鼠門脈壓力比較 與對照組比較，模型組與干預組門脈壓力顯著升高（P＜0.05），大鼠明顯處于高循環(huán)狀態(tài)；但干預組門脈壓力較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3 三組腸道動力比較 墨汁推進實驗顯示，模型組腸道黑染百分比較對照組明顯減少（P＜0.05），腸道動力明顯下降；干預組腸道黑染百分比較模型組明顯增加（P＜0.05），腸道動力有所改善，見表2。

表2 三組大鼠門脈壓力與腸道動力比較（s）

表2 三組大鼠門脈壓力與腸道動力比較（s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別對照組模型組干預組鼠數(shù)5 9 1 0門脈壓力（mmHg）5.64±0.88 13.73±1.81* 10.25±1.47*△腸道黑染百分比（%）81.68±3.15 68.05±2.09* 74.50±4.28△

2.4 三組大鼠生化指標檢測比較 模型組各生化指標較對照組均有明顯改變，肝功能受損明顯，干預組ALT、AST、TBIL較模型組有所下降，ALB較模型組有所上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 三組大鼠生化指標比較（±s）

表3 三組大鼠生化指標比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，與模型組比較，△P＜0.05

組別對照組模型組干預組鼠數(shù)5 9 1 0 ALT（IU/L）60.20±21.30 594.22±317.82* 292.20±140.12△AST（IU/L）149.80±43.03 1008.33±778.70* 350.40±173.35△ALB（g/L）23.42±1.56 16.29±1.26* 18.89±1.02△TBil（μmol/L）1.00±0.44 6.00±5.29* 2.49±1.10△ALP（IU/L）196.20±31.29 802.78±396.94* 552.20±303.37

2.5 三組大鼠腸黏膜上皮細胞凋亡檢測（TUNEL）熒光顯微鏡下模型組大鼠凋亡小體明顯多于對照組，多位于絨毛體部及頂端，而干預組大鼠大黃素干預后小腸上皮細胞凋亡小體較模型組明顯減少，見圖8～10（插頁）。

3 討 論

肝硬化是由一種或多種病因長期或反復作用而造成的肝臟不可逆損害，以彌漫性纖維化為特征的肝組織結(jié)構(gòu)異常，肝細胞變性壞死，纖維組織增生和肝結(jié)節(jié)再生的慢性進行性病理過程或疾病[3]。多項研究顯示，腸屏障功能障礙與肝硬化并發(fā)癥（如自發(fā)性細菌性腹膜炎、消化道出血和肝性腦病等）的發(fā)生發(fā)展密切相關[4-5]。國外相關研究[6]顯示，在有自發(fā)性腹膜炎的肝硬化失代償期患者其膽紅素、肌酐水平明顯增高，而總蛋白、白蛋白水平明顯下降、凝血酶原時間顯著延長。亦有報道顯示，大約有50%的肝硬化合并肝功能衰竭患者死于細菌感染，其中70%～80%的病原菌為革蘭陰性桿菌，且以大腸埃希菌為主，這提示腸道細菌是感染的主要來源[7-8]。肝硬化患者由于門脈高壓、免疫功能下降、膽汁及SIgA分泌量明顯減少、腸蠕動減弱、以及低蛋白血癥等因素，導致腸屏障功能受損，通透性增加，腸道細菌及其代謝產(chǎn)物如內(nèi)毒素等移位，成為引發(fā)腸源性感染、肝性腦病及肝損害加重的重要原因，如何有效保護肝硬化門脈高壓患者腸屏障功能及及延緩肝硬化進程成為臨床亟待解決的問題。

多項研究[9-10]顯示，中藥有抗肝纖維化作用，其中有研究顯示大黃素能使肝纖維化大鼠血清透明質(zhì)酸及層粘連蛋白降低、減少肝組織羥脯氨酸含量，并能降低肝纖維化分級評分。本研究也證實應用大黃素干預大鼠肝硬化進程后，大黃素組大鼠肝臟膠原纖維與網(wǎng)狀纖維沉積較少，假小葉少見。且我們的研究發(fā)現(xiàn)大黃素干預后，大鼠的門脈壓力有明顯下降，可能與大黃素延緩大鼠肝纖維化進程相關，有待進一步研究。亦有實驗證實大黃素對豚鼠、大鼠和家兔離體回腸具有調(diào)節(jié)作用，能夠明顯增加腸道平滑肌運動，促進腸道水的分泌，可促使結(jié)腸蠕動，抑制炎癥反應和炎癥介質(zhì)的釋放，清除氧自由基，降低細胞因子作用，雙向調(diào)節(jié)免疫和凋亡[11-12]；研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可通過MLCK和PKCa信號途徑收縮大鼠結(jié)腸平滑肌細胞[13]。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素干預后，肝硬化門脈高壓大鼠光鏡下小腸黏膜損傷評分顯著降低，腸動力明顯好轉(zhuǎn)，凋亡減少。在肝纖維化早期應用大黃素干預，可有效保護肝硬化門脈高壓大鼠的腸屏障功能，并可有效延緩肝纖維化進程。一項包括684例慢性乙型肝炎患者的前瞻性研究顯示，肝硬化的年發(fā)病率約為2.1%[14]，20%的代償期肝硬化患者在確診后5年內(nèi)進展為失代償期，而10年后則高達60%[15-16]。在肝纖維化早期應用大黃素干預，可有效保護肝硬化門脈高壓大鼠的腸屏障功能，并可有效延緩肝纖維化進程，基于龐大的患者群體，大黃素對臨床改善肝硬化患者腸屏障功能，減少并發(fā)癥具有研究價值，但對于其可能的分子學機制及不同劑量的大黃素的治療作用及副作用、對肝硬化晚期的腸屏障是否有保護作用均有待進一步研究。

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（收稿：2015-11-15 修回：2016-01-19）

Effects of Emodin on Maintaining Intestinal Barrier in Cirrhotic Rats with Portal Hypertension

SHI Linlin,CHEN Jianyong,XU Hong,ZHANG Jiaying.Department of Gastroenterology,Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310003),China

ObjectiveTo investigate the effects of emodin on intestinal mucosal barrier in cirrhotic rats with portal hypertension.MethodsTwenty-five male SD rats were randomly divided into three groups:control group（n= 5）,model group（n=10）,and emodin group（n=10）.The model was induced by thesubcutaneous injection of 500mL/L CCL4（3mL/100g,twice a week for 8 weeks）,then was intragastrically given saline in model group or emodin（5mg/ mL,5mL/kg,once a day）in emodin group from Day 15.Control group received normal saline（3mL/100g）.At 8 weeks,rats were sacrificed to determine the changes of Ink propelling test,portal pressure,and serum variable and biopsies from the terminal ileum and liver were made for histology and apoptosis body detection with TUNEL.ResultsThe degree of intestinal mucosal injury was the severest in model group,followed by emodin group and control group（P＜0.05）.The portal pressure in model group was higher than that in control group（13.73±1.81mmHg vs 5.64±0.88mmHg,P＜0.05）,indicating a hyperkinetic circulatory state;that in emodin group（10.25±1.47mmHg）was lower than that in model group（P＜0.05）.ALT,AST,TB,and ALP in model group（594.22±317.82U/L,1008.33±778.70U/L,6.00±5.29μmol/L,802.78±396.94U/L）were higher than those in control group（60.20±21.30U/L, 149.80±43.03U/L,1.00±0.44μmol/L,196.20±31.29U/L）and in emodin group（292.20±140.12U/L,350.40±173.35U/L, 2.49±1.10μmol/L 552.20±303.37U/L）,ALB in model group（16.29±1.26g/L）was lower than that in control group （23.42±1.56g/L）and emodin group（18.89±1.02g/L）（all P＜0.05）.The percentage of dyed intestinal black in model group（68.05%±2.09%）was lower than that in control group（81.68%±3.15%）and emodin group（74.50%±4.28%）（all P＜0.05）.The number of apoptosis body in model group was more than that in control group and emodin group.ConclusionEmodin could protect intestinal mucosal barrier in the hyperkinetic circulatory state in cirrhotic rats.

Rats;Hepatic cirrhosis;Portal hypertension;Intestinal barrier;Emodin

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（No.2011RCB029）

浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化科（杭州 310003）

施琳琳，Tel：15888805710；E-mail:jessicasll@163.com