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基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因-1562C/T多態(tài)性與過敏性紫癜并發(fā)癥的關(guān)系

2016-02-09 10:25方全中郭愛紅丁振堯楊嬌嬌
關(guān)鍵詞:紫癜等位基因過敏性

方全中 郭愛紅 丁振堯 楊嬌嬌

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基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因-1562C/T多態(tài)性與過敏性紫癜并發(fā)癥的關(guān)系

方全中 郭愛紅 丁振堯 楊嬌嬌

過敏性紫癜;基質(zhì)金屬蛋白酶-9;基因多態(tài)性;并發(fā)癥

過敏性紫癜(henoch-schoenlein purpura,HSP)是一種臨床表現(xiàn)為特征性皮疹、關(guān)節(jié)疼痛、腹痛、便血、血尿、蛋白尿等癥狀的小血管炎綜合征,其發(fā)病機(jī)制與免疫和遺傳有關(guān)。HSP急性期血中炎癥細(xì)胞因子能上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)表達(dá)[1-2]。研究[3-4]發(fā)現(xiàn),HSP患兒急性期血清MMP-9水平及循環(huán)白細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)水平顯著升高,并且MMP-9基因C-1562C/T基因位點(diǎn)存在多態(tài)性。本文研究MMP-9-1562C/T多態(tài)性與HSP患兒的腎臟損害及胃腸道損害的關(guān)系,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月—2015年6月本院確診的過敏性紫癜(HSP)患兒124例,均符合“過敏性紫癜”的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。男69例,女55例,年齡4~12歲,平均(7.59±2.36)歲。腎臟損害43例出現(xiàn)血尿和/或蛋白尿癥狀,無腎臟損害81例。胃腸道損害46例,腹痛、便血或大便隱血試驗(yàn)陽性,無胃腸道損害78例。

1.2 方 法 采用PCR-RFLP方法測(cè)定MMP-9基因多態(tài)性:(1)提取DNA:抽靜脈血2mL,加EDTA抗凝。使用白細(xì)胞分離液,離心法分離并收集外周血白細(xì)胞,用DNA提取試劑盒從白細(xì)胞中抽提基因組DNA,雙蒸水溶解,核酸分析儀測(cè)定DNA水平后,-80℃冰箱保存。提取全血DNA作為PCR模板,具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。將提取的基因組DNA均置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩#?)PCR擴(kuò)增:MMP-9基因-1562C/T各位點(diǎn)引物由上海涵生物科技公司合成,上游引物為5’-GCCTGGCACATAGTA GGCCC-3’,下游引物為5’-CTTCCTAGCCAGCCGG CATC-3’。PCR反應(yīng)體系為:10×Buffer 2.5μL→ dNTP0.5μL→上下游引物各 1μL→DNA模板0.1μg→2×Taq PCR MasterMix 12.5μL→加雙蒸水,總體積為25μL。反應(yīng)條件為按說明書操作。(3)酶切反應(yīng):對(duì)PCR產(chǎn)物采用限制性內(nèi)切酶SphI進(jìn)行酶切→酶切體系為PCR產(chǎn)物10.0μL→10×H Buffer 2.0μL→SphI內(nèi)切酶1.0μL→雙蒸水7.0μL→體積20.0μL→37℃水浴消化。酶切后產(chǎn)物分析采用2%瓊脂糖凝膠電泳法,產(chǎn)物電泳,凝膠成像系統(tǒng)判定結(jié)果。(4)序列分析:所有病例的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,兩組間各等位基因及基因型頻率的比較采用χ2檢驗(yàn),單因素Logistic回歸分析,關(guān)聯(lián)程度用優(yōu)勢(shì)比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI)表示。

2 結(jié) 果

2.1 MMP-9基因多態(tài)性檢測(cè) 當(dāng)MMP-9基因型為TT時(shí),兩個(gè)等位基因均有酶切位點(diǎn),酶切產(chǎn)物電泳后有247bp和188bp兩個(gè)片段。MMP-9基因突變標(biāo)準(zhǔn):CC基因型(435bp)、CT基因型(435bp、247bp、188bp)、TT基因型(247bp、188bp),PCR酶切后電泳結(jié)果見圖1(封三)。

2.2 MMP-9 PCR產(chǎn)物基因測(cè)序 CC、CT為MMP-9 1562位點(diǎn)兩種基因型。CC純合子測(cè)序相應(yīng)位點(diǎn)為C單峰;CT雜合子測(cè)序結(jié)相應(yīng)位點(diǎn)為C、T雙峰。見圖2~3(箭頭所示為突變位點(diǎn))(封三)。

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn) 對(duì)124例過敏性紫癜患兒MMP-9基因-1562C/T進(jìn)行經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn),結(jié)果符合平衡定律(χ2=0.814,P=0.326),表示樣本具有群體代表性。

2.4 各組間MMP-9-1562 C/T基因型及等位基因頻率比較 過敏性紫癜患兒腎損害組中MMP-9-1562CT基因型及T等位基因頻率高于無腎臟損害組(P<0.01),見表1;logistic回歸分析示1562T等位基因可增加過敏性紫癜患兒發(fā)生腎臟損害(OR= 3.89,95%CI:1.36~11.44)。過敏性紫癜患兒胃腸道損害組和無胃腸道損害組中MMP-9-1562C/T基因型及等位基因頻率無明顯差異(P>0.05),見表2。

表1 HSP腎臟損害組與無腎臟損害組患者的基因型及等位基因頻率[例(%)]

表2 HSP胃腸道損害組與無胃腸道損害組患者的基因型及等位基因頻率[例(%)]

3 討論

過敏性紫癜(HSP)是以廣泛的急性無菌性毛細(xì)血管和小動(dòng)脈的炎性反應(yīng)為基本病理改變的血管炎綜合征。目前細(xì)胞外基質(zhì)在HSP和紫癜性腎炎(henoch-schonlein purpura nephritis,HSPN)發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到重視。MMP-9是一種由鋅離子依賴性酶組成的能降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白的重要酶類,在調(diào)節(jié)基質(zhì)降解方面發(fā)揮著重要的作用,它幾乎能降解細(xì)胞基質(zhì)的所有成分,也參與了相關(guān)組織的破壞和重建,與炎癥反應(yīng)、腫瘤擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、新陳代謝、關(guān)節(jié)炎中的軟骨破壞、動(dòng)脈硬化等有關(guān)。MMP-9降解細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)的完整性,促進(jìn)血管炎癥反應(yīng)的發(fā)生,從而導(dǎo)致血管損害[4,6-7]。

基質(zhì)金屬蛋白酶的損傷是HSP血管炎發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)HSP的多種易感基因多態(tài)性分析表明,遺傳因素在HSP的發(fā)生發(fā)展及其腎臟損傷過程中扮演重要角色。包含MMP-9-1562C/T多態(tài)性位點(diǎn)的9bp序列GCGCAC/ TGCC(-1567→-1559)是一個(gè)重要的調(diào)控元件,是MMP-9基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上游的1562處存在的C被T取代,而1562位點(diǎn)基因多態(tài)性不引起氨基酸的改變。MMP-9濃度隨其基因轉(zhuǎn)錄效率不同發(fā)生變化,從而影響一些相關(guān)疾病發(fā)生與發(fā)展[3,8]。張園海等[9]發(fā)現(xiàn),MMP-9-1562C/T多態(tài)性與兒童川崎病的冠脈損害有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn),HSP患兒胃腸道損害組和無胃腸道損害組中MMP-9-1562C/T基因型及等位基因頻率無明顯差異;HSP患兒腎損害組中MMP-9-1562CT基因型及T等位基因頻率比無腎臟損害組明顯升高;單因素Logistic回歸分析也顯示-1562T等位基因是HSP患兒發(fā)生腎臟損害的危險(xiǎn)因素。這從遺傳基因水平揭示了MMP-9對(duì)HSP腎損害的作用,為其治療提供了新的靶點(diǎn)。

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(收稿:2015-12-16 修回:2016-01-24)

浙江省溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.Y20140252)

浙江省蒼南縣人民醫(yī)院兒科(蒼南 325800)

方全中,Tel:13566114288

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