邵 笑祝 驥趙峻峰許穎齡張穎穎楊建清盧德趙

丹參酮ⅡA對(duì)大鼠肺纖維化細(xì)胞TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響

邵 笑1祝 驥1趙峻峰1許穎齡2張穎穎2楊建清2盧德趙2

目的觀察丹參酮ⅡA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)大鼠肺成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響，探討丹參酮ⅡA干預(yù)肺纖維化的機(jī)制。方法體外培養(yǎng)大鼠肺成纖維細(xì)胞（HFL-1），選取生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞分為正常組、TGF-β1組及丹參酮ⅡA低（L）、中（M）、高（H）劑量組。除正常組外，余四組予以10ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)HFL-1纖維化24h，同時(shí)丹參酮ⅡA低、中、高劑量組分別予2μmol/L、5μmol/L和10μmol/L丹參酮ⅡA處理24h，ELISA法測(cè)定各組細(xì)胞中TGF-β1受體表達(dá)，熒光定量PCR法及免疫印跡法檢測(cè)Smad2、Smad7表達(dá)情況。結(jié)果與正常組比較，HLF-1細(xì)胞經(jīng)10ng/mL TGF-β1誘導(dǎo)后細(xì)胞TGF-β1受體和Smad2表達(dá)量增加[（0.19±0.23）比（1.41± 0.12）、（1.00±0.12）比（1.90±0.12），P＜0.01]，Smad7表達(dá)量降低[（1.00±0.15）比（0.57±0.09），P＜0.01]；與TGF-β1組比較，10μmol/L丹參酮ⅡA處理后TGF-β1受體和Smad2的表達(dá)量均有下降趨勢(shì)[（1.90±0.23）比（1.53±0.12），（1.90±0.12）比（1.38±0.06），P＜0.01]，Smad7表達(dá)量升高[（0.57±0.08）比（0.74±0.11），P＜0.01]。結(jié)論丹參酮ⅡA可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞增殖和Smad2 及TGF-β1受體表達(dá)，增強(qiáng)抑制性信號(hào)蛋白Smad7的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制肺纖維化的作用。

大鼠；肺纖維化；HFL-1；丹參酮ⅡA；轉(zhuǎn)化生長因子β

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，包括慢性炎癥反應(yīng)、成纖維細(xì)胞增殖以及異常的膠原沉積所導(dǎo)致的損傷過度修復(fù)，至今發(fā)病機(jī)制不明，且沒有理想的治療方法[1-3]。目前認(rèn)為轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor beta1，TGF-β1）是導(dǎo)致纖維化的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，其介導(dǎo)的Smad通路是纖維化發(fā)生的可能機(jī)制之一[4]。Smad家族中的Smad2是TGF-β/Smads信號(hào)通路活化蛋白，而其正常表達(dá)與肺纖維化的形成直接相關(guān)[5]，而Smad7是其抑制性信號(hào)。丹參是常見的活血化瘀中藥，丹參酮ⅡA是其最主要的有效成分之一。近年許多研究[6-7]表明，丹參酮ⅡA具有抗纖維化作用，但其具體機(jī)制尚未明確。本研究旨在觀察丹參酮ⅡA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響，闡明丹參酮ⅡA干預(yù)肺成纖維細(xì)胞纖維化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料 HFL-1細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；丹參酮ⅡA（批號(hào)14031278）購于安徽甙爾塔公司；RPMI1640培養(yǎng)基（批號(hào)14051103）、胎牛血清（批號(hào)1414876）購自杭州四季青生物工程材料研究所；氯化鎘（批號(hào)10005416）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Smad2（批號(hào)3103S）、Smad7（批號(hào)YHN0211061）、actin（批號(hào)0017150S）一抗均購于SANTA CRUZ公司。Elisa試劑盒（批號(hào)E12010503）購于上海ELISA生物科技有限公司。蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)00071501）購于康為世紀(jì)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞增殖活力檢測(cè) HLF-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，每2～3天傳代1次，將生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞以1×104個(gè)/孔濃度傳代培養(yǎng)于96孔板中，并加入不同劑量的丹參酮ⅡA，使其終濃度為0、2、4、6、7、8、10、12、16μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，利用MTT法在波長490nm處檢測(cè)各組樣品吸光度值（A490）。

1.3 細(xì)胞分組處理 選取生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞5瓶，分為五組，正常組：HFL-1細(xì)胞正常境況24h；TGF-β1組：10ng/mL TGF-β1處理HFL-1細(xì)胞24h；丹參酮ⅡA（L）：10ng/mL TGF-β1+2μmol/L丹參酮ⅡA處理細(xì)胞24h；丹參酮ⅡA（M）：10ng/mL TGF-β1+5μmol/L丹參酮ⅡA處理細(xì)胞24h；丹參酮ⅡA（H）：10ng/mL TGF-β1+10μmol/L丹參酮ⅡA處理細(xì)胞24h，提取細(xì)胞總RNA及總蛋白質(zhì)，定量后置于-20℃保存。

1.4 Elisa檢測(cè)TGF-β1受體表達(dá) 用Elisa試劑盒，將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品各50μL于反應(yīng)孔立即加入50μL的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45min。清洗4次，每孔加入100μL的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min。清洗4次后，每孔加入底物A、B各50μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光溫育5min，迅速加入50μL終止液，在450nm波長處測(cè)定各孔的OD值。

1.5 熒光定量PCR法檢測(cè)Smad2、Smad7 mRNA表達(dá) 細(xì)胞孵育后，收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，按TRIZOL試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA并將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取產(chǎn)物以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。Actin引物：上游5-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3，下游：5-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為230bp；Smad2引物：上游5-TTTGCGGAATAATCGTGT-3，下游5-AAGGTGCTTTAATTGATGAGAC-3，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為414bp；Smad7引物序列：上游：5-TTTTGAGGTGTGGTGGGT-3，下游：5-GAGGCAGTAAGACAGGGATGA-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為478bp。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行軟件分析。

1.6 Western blot檢測(cè)Smad2、Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)蛋白質(zhì)樣品先用8%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分離，后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再將膜進(jìn)行封閉，β-actin（1:600）兔抗鼠的一抗孵育，1:1000羊抗兔的二抗孵育、Smad7（1：250）、Smad2（1:600）鼠抗人的一抗孵育，1：1000兔抗鼠的二抗孵育及ECL顯色。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA對(duì)HFL-1細(xì)胞增殖活力的影響MTT法檢測(cè)丹參酮ⅡA對(duì)HLF-1細(xì)胞增殖活力的影響，≤10μmol/L丹參酮ⅡA對(duì)細(xì)胞增殖活力沒有顯著影響（P＞0.05），12μmol/L丹參酮ⅡA可以顯著抑制HLF-1細(xì)胞的增殖（P＜0.01）。見表1。

2.2 丹參酮ⅡA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細(xì)胞TGF-β1受體表達(dá)的影響 與正常級(jí)比較，10ng/mL TGF-β1處理HFL-1細(xì)胞后，TGF-β1受體表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），10μmol/L丹參酮ⅡA能明顯降低TGF-β1受體的表達(dá)，并有一定的量效關(guān)系，見表2。

2.3 丹參酮ⅡA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細(xì)胞Smad2和Smad7 mRNA表達(dá)的影響 與正常組比較，TGF-β1誘導(dǎo)HFL-1細(xì)胞24h后，細(xì)胞中Smad2 mRNA增加，而Smad7 mRNA含量顯著減少。經(jīng)5、10μmol/L丹參酮ⅡA處理后，Smad2 mRNA含量降低，而Smad7 mRNA含量相對(duì)增加，見表3。

表1 丹參酮ⅡA對(duì)HFL-1細(xì)胞增殖活力的影響（±s）

表1 丹參酮ⅡA對(duì)HFL-1細(xì)胞增殖活力的影響（±s）

注：與丹參酮ⅡA零濃度比較，**P＜0.01；HFL-1細(xì)胞：大鼠肺成纖維細(xì)胞

丹參酮ⅡA濃度（μmol/L） 孔數(shù)0 2 4 6 8 1 0 12 16 6 6 6 6 6 6 6 6細(xì)胞相對(duì)增殖情況（OD490）0.34±0.012 0.35±0.023 0.36±0.017 0.39±0.015 0.37±0.009 0.36±0.021 0.26±0.022** 0.22±0.015**

表2 四組大鼠HFL-1細(xì)胞TGF-β1誘導(dǎo)后TGF-β1受體表達(dá)比較（±s）

表2 四組大鼠HFL-1細(xì)胞TGF-β1誘導(dǎo)后TGF-β1受體表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與TGF-β1組比較，△△P＜0.01；HFL-1細(xì)胞：大鼠肺成纖維細(xì)胞；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子

組別正常組TGF-β1組丹參酮ⅡA（L）丹參酮ⅡA（M）丹參酮ⅡA（H）孔數(shù)3 3 3 3 3 TGF-β1受體相對(duì)表達(dá)量（OD450）1.41±0.12 1.90±0.23** 1.83±0.09** 1.77±0.18** 1.53±0.12*△△

表3 四組大鼠HFL-1細(xì)胞TGF-β1誘導(dǎo)后HFL-1細(xì)胞Smad2和Smad7 mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 四組大鼠HFL-1細(xì)胞TGF-β1誘導(dǎo)后HFL-1細(xì)胞Smad2和Smad7 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與TGF-β1組比較，△△P＜0.01；HFL-1細(xì)胞：大鼠肺成纖維細(xì)胞；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子

組別正常組TGF-β1組丹參酮ⅡA（L）丹參酮ⅡA（M）丹參酮ⅡA（H）孔數(shù)3 3 3 3 3 Smad2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平1.00±0.12 1.90±0.12** 1.82±0.25** 1.60±0.19** 1.38±0.06**△△Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)水平1.00±0.15 0.57±0.09** 0.60±0.06** 0.67±0.07** 0.74±0.11**

2.4 丹參酮ⅡA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細(xì)胞Smad2和Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)的影響 TGF-β1誘導(dǎo)HFL-1細(xì)胞24h后，細(xì)胞中Smad2蛋白質(zhì)表達(dá)增加，Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)下降。丹參酮ⅡA可以下調(diào)Smad2蛋白質(zhì)表達(dá)，提高Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)，見圖1。

圖1 丹參酮ⅡA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細(xì)胞Smad2和Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

3 討論

肺纖維化是一種原因不明、以彌漫性肺泡炎癥和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為特征的疾病[8]。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）被公認(rèn)為纖維化形成與發(fā)展的啟動(dòng)樞紐，是關(guān)鍵性細(xì)胞因子，能啟動(dòng)成纖維細(xì)胞的增殖分裂，導(dǎo)致膠原蛋白的大量合成，最終形成肺間質(zhì)的膠原沉積等纖維化的組織病理學(xué)改變。TGF-β1發(fā)揮生物學(xué)調(diào)節(jié)功能依賴于其在細(xì)胞膜表面的特異性受體，Smad家族蛋白介導(dǎo)了TGF-β1對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。TGF-β1首先與相應(yīng)的TβRⅡ相結(jié)合，再連接TβRⅠ共同形成復(fù)合物。接著磷酸化激活R-Smads某一成員，該成員再和Co-Smads結(jié)合形成復(fù)合物轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄。Smad蛋白有8種，分為3個(gè)亞型：（1）膜受體激活型Smad（R-Smads），主要包括Smad2、Smad3。（2）共同通路型Smad（Co-Smads），主要是Smad4，可同R-Smads結(jié)合，是TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)必需的中轉(zhuǎn)分子。（3）抑制性Smad（I-Smads），包括Smad6，Smad7?？膳cR-Smads競(jìng)爭TGF-β1受體，對(duì)信號(hào)傳遞起負(fù)調(diào)控作用。Smad2、Smad3是纖維化疾病的重要介導(dǎo)者，大量事實(shí)表明，TGF-β1介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的表達(dá)上升是Smads依賴性的過程[9-10]。Smad7為TGF-β/Smad信號(hào)通路的抑制分子，可與R-Smads競(jìng)爭性結(jié)合受體，阻止R-Smads磷酸化而阻斷TGF-β的信號(hào)傳遞。因此，調(diào)控TGF-β/Smad通路各分子的表達(dá)成為肺纖維化治療的一種新途徑[11]。

丹參酮ⅡA（Tanshinone IIA）是從丹參中提取出的脂溶性成分之一，是近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)中藥單體中研究較多的活性成分，其在丹參酮中含量最高，也是最為穩(wěn)定的有效活性成分，其具有明確的分子結(jié)構(gòu)。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[12-13]，丹參酮ⅡA不僅具有清除氧自由基和抗炎的作用，還具有抗腫瘤等多種藥學(xué)活性。同時(shí)，丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷具有保護(hù)作用[14]。然而，目前關(guān)于丹參酮ⅡA如何作用于肺間質(zhì)纖維化，其相關(guān)的具體生物學(xué)機(jī)制尚不十分清楚。

我們采用TGF-β1誘導(dǎo)大鼠肺成纖維細(xì)胞纖維化，正常組HLF-1細(xì)胞梭形或扁的星狀，胞質(zhì)透明，胞核較大，可見核仁。經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后細(xì)胞伸出多個(gè)突起，并連接成網(wǎng)狀，細(xì)胞密集成放射狀分布。Elisa檢測(cè)顯示TGF-β1受體濃度上升，定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)顯示丹參酮ⅡA可以降低Smad2表達(dá)，并提高Smad7的表達(dá)量。

綜上所述，TGF-β1可以上調(diào)TGF-β1受體和Smad2表達(dá)，并下調(diào)Smad7，促進(jìn)肺纖維化；丹參酮ⅡA可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路，緩解成纖維細(xì)胞的纖維化，從而起到防治肺纖維化作用。

［1］Feng YZ，Zhang YS，Cao ZF，et al.Prevention of combination of Hirsntella sinensis and Panax notoginseng extracts on Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice［J］.Chin Herb Med，2010，2（2）：118-124.

［2］Montes E，Ruiz V，Checa M，et al.Renin is an angiotensinindependent profibrotic mediator：role in pulmonary fibrosis ［J］.EurRespir J，2012，39（1）：141-148.

［3］Santos-Silva MA，Pires KM，Trajano ET，et al.Redox imbalance and pulmonary function in bleomycin-induced fibrosis in C57BL/6，DBA/2，and BALB/c mice［J］.Toxicol Pathol，2012，40（5）：731-741.

［4］Sun XE，Zhang XQ，Liu MM.Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the TGF-β1/Smad signaling pathway of hepatic stellate［J］.Genet Mol Res，2015，14（3）：8744-8754.

［5］Li LC，Li DL，Xu L，et al.High-mobility group box 1 mediates epithelial-to-mesenchymal transition in pulmonary fibrosis involving transforming growth factor-β1/Smad2/3 signaling［J］.J Pharmacol Exp Ther，2015，354（3）：302-309.

［6］ Wu H，Li Y，Wang Y，et al.TanshinoneⅡA attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis via modulating angiotensin-converting enzyme2/angiotensin-（1-7）axis in rats ［J］.Int J Med Sci，2014，11（6）：578-586.

［7］Xu M，Cao F，Liu L，et al.TanshinoneⅡA-induced attenuation of lung injury in endotoxemic mice isassociated with reduction of hypoxia-inducible factor lalpha expression［J］. Am Jrespir Cell Mol Biol，2011，5（5）：1028-1035.

［8］Cottin V，Wuyts W.Insights into idiopathic pulmonary fibrosis in the real world［J］.Eur Respir J，2015，46（1）：16-18.

［9］朱劍萍，姚宏偉，陳季強(qiáng).TGF-β1誘導(dǎo)肺切片纖維化模型的建立［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22（4）：501-504.

［10］石亮亮，劉明東，朱浩，等.丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷的抗炎作用及其機(jī)制研究［J］.胃腸病學(xué)，2014，19（6）：332-335.

［11］ Gharaee-Kermani M，Hu B，Phan SH，et al.Recent Advances in Molecular Targets and Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis：Focus on TGF-β Signaling and the Myofibroblast［J］.Current Medicinal Chemistry，2009，16 （11）：1400-1417.

［12］Teng YH，Lu DZ，F(xiàn)an CL，et al.Proteomic Study on the Protective Effect of Tanshinone IIA Against Oxidative Injury to Human Umbilical Vein Endothelial Cells by Hydrogen Peroxide［J］.Current Proteomics，2013，10（4）：312-321.

［13］李超.丹參酮ⅡA對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者的療效及P糖蛋白表達(dá)的影響［J］.中國民康醫(yī)學(xué)，2015，27（12）：50-51.

［14］Shi XM，Huang L，Xiong SD，et al.Protective effect of transhinone IIA on lipopolysaccharide-induced lung injury in rats［J］.Chin J Integr Med，2007，13（2）：137-140.

（收稿：2015-08-20 修回：2015-11-19）

Effect of TanshinoneⅡA on TGF-β1/Smads Signaling Pathway in Pulmonary Fibrosis Cellsof Rats

SHAO Xiao1,ZHU Ji1,ZHAO Junfeng1,XU Yingling2,ZHANG Yingying2,YANG Jianqing2,LU Dezhao2. 1 Clinical Laboratory,Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2 College of Life Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

ObjectiveTo investigate the protection effect of tanshinoneⅡA on transform growth factor（TGF）-β1/Smads pathway in pulmonary fibrosis cells of rats.MethodsHLF-1 cells were cultivated in vitro and induced to pulmonary fibrosis cells with 10ng/mL TGF-β1,then the cells were treated with 2μmol/L,5μmol/L and 10μmol/ L tanshinoneⅡA,respectively,for 24h.The method of Elisa was used to measure the expression of TGF-β1 receptors.The expression of Smad 2 and Smad 7 was determined with the method of fluorogenic quantitative PCR and Western Blotting.Results10ng/mL TGF-β1increased the expression of TGF-β1 receptors（1.41±0.12 vs 0.19± 0.23）and Smad 2（1.90±0.12 vs 1.00±0.12）,and decreased the expression of Smad 7（0.57±0.09 vs 1.00±0.15）in the HLF-1 cells（all P＜0.05）.When the cells were treated withtanshinoneⅡA,TGF-β1 receptors（1.53±0.12）and Smad 2（1.38±0.06）expressed with a downward trend while the expression of Smad 7（0.74±0.11）was increased （all P＜0.05）.ConclusionTGF-β1 can promote pulmonary fibrosis through upregulating the expression of TGF-β1 receptors and Smad 2 and downregulatingthe expression of Smad 7.TanshinoneⅡA can regulate the TGF-β1/ Smads signaling pathway,which plays a preventive role in pulmonary fibrosis.

Rats;Pulmonary fibrosis;HFL-1;TanshinoneⅡA;Transform growth factor β

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81102841，81403133）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.LY13H270005，No.LQ14H280004）；中國博士后科學(xué)基金（No.2013M541800）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科（杭州 310005）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（杭州 310053）

盧德趙，Tel：13588769151；E-mail：ludezhao@126.com