董玲玲，龔旭昊，王靜文，楊星，范強

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

HPLC-PDA方法同時檢測黃連解毒散中非法添加的對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新

董玲玲，龔旭昊，王靜文，楊星，范強*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

為同時檢測黃連解毒散中非法添加的對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新，以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，1%冰醋酸溶液(用三乙胺調(diào)劑pH值至4.0)為流動相A，甲醇為流動相B，進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，波長掃描范圍為210～400 nm，柱溫25 ℃，建立了HPLC-PAD檢測方法，并采用峰純度檢查和光譜相似度檢查輔助對照品比對方法，對非法添加藥物進行確證。結果顯示，對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新的回收率分別為98.6%和99.4%，RSD分別為0.6%和0.2%；線性方程分別為y=43408x-401.96，R2=1和y=14331x-1682.4，R2=1；檢測限分別為1和5 mg/g；定量限分別為2和10 mg/g。本方法簡潔、靈敏、可靠，可同時對黃連解毒散中非法添加的對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新違禁藥物進行定性和定量檢測。

對乙酰氨基酚；鹽酸溴己新；黃連解毒散；HPLC-PDA

黃連解毒散的主要成分有黃連、黃芩、黃柏、梔子,主治三焦實熱、瘡黃腫毒,適用于馬、牛、羊、豬、兔及家禽[1]，應用廣泛。對乙酰氨基酚因其解熱鎮(zhèn)痛作用明顯，價格低廉，常被不法商家添加在獸藥中以“增強藥效”。鹽酸溴己新有較強的溶解黏痰作用，可使痰中的多糖纖維素裂解，稀化痰液[2]，常用做祛痰藥。在黃連解毒散中添加對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新，不僅違反了《獸藥管理條例》，也為動物源性食品安全埋下了隱患。

有關獸藥中非法添加對乙酰氨基酚的檢測方法已有不少[3-5]，而針對獸藥中非法添加鹽酸溴己新的檢測方法卻鮮有報道，更沒有同時檢測獸藥中非法添加對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新的方法報道。而實際工作中已發(fā)現(xiàn)有市售黃連解毒散中非法添加了對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新的情況存在，因此有必要建立簡潔、靈敏、可靠的方法檢測黃連解毒散中非法添加的對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新。國內(nèi)外已報道的用于檢測鹽酸溴己新的方法最常用的是高效液相色譜法[2,6-7]，另外還有近紅外光譜法[8]、化學發(fā)光法[9]等。參考上述文獻，并綜合考慮對乙酰氨基酚、鹽酸溴己新的物理化學性質(zhì)及黃連解毒散的特點，本文擬建立一種快速、準確、可靠的定性定量方法，以期廣泛應用于非法添加的檢測工作。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695液相系統(tǒng)、2998 PDA二極管陣列檢測器、Empower3色譜工作站軟件(美國Waters 公司)、Mettler AE240型十萬分之一天平(美國Mettler Toledo公司)、MiliQ純水機、雷磁PHSJ-4A型pH 計。

1.2 試藥與試劑 對乙酰氨基酚對照品(含量：99.9%，批號：100018-201409，中國食品藥品檢定研究院)，鹽酸溴己新對照品(含量：99.9%，批號：100427-201102，中國食品藥品檢定研究院)；供試品：黃連解毒散空白樣品(自制散劑)；黃連解毒散陽性樣品(批號：20150643)，甲醇(德國Merck公司，色譜純)，三乙胺(美國Fisher Scientific公司，色譜純)，冰醋酸(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)，去離子水(MiliQ純化系統(tǒng)制備的去離子水)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：資生堂MGⅡ C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動相：1%冰醋酸溶液(用三乙胺調(diào)劑pH值至4.0)為流動性A，甲醇為流動相B，按下表進行梯度洗脫，流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，進樣量：10 μL，二極管陣列檢測器(PDA，檢測波長:210～400 nm，記錄248 nm波長處的色譜圖)。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 黃連解毒散 空白儲備液取自制黃連解毒散2.0 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇50.0 mL，超聲處理15 min，靜置，濾過，作為黃連解毒散空白儲備液。

2.2.2 黃連解毒散空白溶液 取黃連解毒散空白儲備液1.0 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為黃連解毒散空白溶液。

2.2.3 對乙酰氨基酚對照品儲備液 取對乙酰氨基酚對照品25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1 mg/mL的對乙酰氨基酚對照品儲備液A。精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得0.02 mg/mL的對乙酰氨基酚對照品儲備液B。

2.2.4 鹽酸溴己新對照品儲備液 取鹽酸溴己新對照品25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1 mg/mL的鹽酸溴己新對照品儲備液A。精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得0.1 mg/mL的鹽酸溴己新對照品儲備液B。

2.2.5 系統(tǒng)適用性溶液 取黃連解毒散空白儲備液1.0 mL，置50 mL量瓶中，加對乙酰氨基酚對照品儲備液A和鹽酸溴己新對照品儲備液A各5 mL，加初始流動相稀釋至刻度，搖勻。

2.3 方法學考察

2.3.1 供試品本底及干擾 精密量取黃連解毒散空白溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖和光譜指數(shù)圖，另取系統(tǒng)適用性溶液10 μL，同法操作，結果見圖1、圖2，表明黃連解毒散本底在對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新相應位置不產(chǎn)生干擾。

圖1 黃連解毒散空白溶液光譜色譜圖

圖2 系統(tǒng)適用性溶液光譜色譜圖

2.3.2 線性關系考察 精密量取對乙酰氨基酚對照品儲備液A和鹽酸溴己新對照品儲備液A各2.5 mL，置同一50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取1、3、5、7、9 mL，置10 mL容量瓶中，加初始流動相稀釋至刻度，搖勻，得濃度為5、15、25、35、45 μg/mL的對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新混合標準曲線溶液，測定。按各對照品峰面積與對應的濃度作標準曲線，并計算回歸方程和相關系數(shù)。對乙酰氨基酚的回歸方程為y=43408x-401.96,R2=1；鹽酸溴己新的回歸方程為y=14331x-1682.4,R2=1，表明對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新在5～45 μg/mL濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.3.3 檢測限與定量限 檢測限溶液制備：取黃連解毒散空白儲備液1 mL,置50 mL容量瓶中，分別精密加入對乙酰氨基酚對照品儲備液B適量(1、2、3 mL),加初始流動相稀釋至刻度。另取黃連解毒散空白儲備液1 mL,置50 mL容量瓶中，分別精密加入鹽酸溴己新對照品儲備液B適量(1、2、3 mL),加初始流動相稀釋至刻度。以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢測限(圖3-圖4)，S/N≥10的濃度為定量限。該色譜條件下對乙酰氨基酚的檢測限為1 mg/g，定量限為2 mg/g；鹽酸溴己新的檢測限為5 mg/g，定量限為10 mg/g。為達到“藥效”，有時獸藥中非法添加其它藥物的量非常大，本方法所制定的檢測限和定量限能夠滿足實際工作需要。

圖3 對乙酰氨基酚檢測限光譜色譜圖

圖4 鹽酸溴己新檢測限光譜色譜圖

2.3.4 準確度 以黃連解毒散空白中添加對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新對照品做回收率試驗來考察方法的準確度。儲備液加對照品做回收率試驗來考察方法的準確度。回收率試驗溶液配制：取自制黃連解毒散2.0 g，置50 mL量瓶中，取對乙酰氨基酚對照品50 mg、鹽酸溴己新對照品50 mg，分別精密稱定，置上述量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。平行配制6份，結果見表2.對乙酰氨基酚回收率為98.6%，RSD為0.6%；鹽酸溴己新回收率為99.4%，RSD為0.2%。

表2 回收率結果

2.3.5 耐用性 以系統(tǒng)適用性溶液作為供試品溶液，從柱溫、色譜柱兩個方面考察方法的耐用性。保持其它檢測條件不變，調(diào)節(jié)柱溫為20 ℃、25 ℃、30 ℃，發(fā)現(xiàn)隨著柱溫升高，保留時間提前，但其與相鄰色譜峰的分離度大于1.5；選擇三款不同品牌色譜柱，考察不同色譜柱對測定的影響，結果如表3所示：三種品牌色譜柱均可用于該檢查。結果表明方法耐用性較好。

表3 三種色譜柱耐用性考察結果表

2.4 樣品測定結果 取黃連解毒散陽性樣品2.0 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇50.0 mL，超聲處理15 min，靜置，濾過；取續(xù)濾液1.0 mL，置50 mL量瓶中，加初始流動相稀釋至刻度，搖勻，用建立的HPLC-PDA法對該樣品中非法添加物進行測定，供試品色譜圖中保留時間4.72 min的色譜峰與對乙酰氨基酚對照品保留時間一致，18.47 min的色譜峰與鹽酸溴己新對照品保留時間一致，且與各自對照品光譜圖及最大吸收波長一致，匹配角度均小于匹配閾值，光譜相似。表明供試品中添加了對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新，結果分別為42.76 mg/g和24.50 mg/g，供試品色譜光譜圖見圖5，結果見表4。

表4 黃連解毒散陽性樣品檢測結果

圖5 黃連解毒散陽性樣品光譜色譜圖

3 討論與小結

3.1 流動相的選擇 鹽酸溴己新為2個氨基取代的二溴苯甲胺結構，其中一個氨基的2個氫原子被甲基和環(huán)己基取代，由此可知其在C18固定相中的保留能力較強，應用高比例有機相才能將其洗脫。而對乙酰氨基酚極性大，在固定相中保留弱，洗脫快?？紤]到對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新的極性差別和黃連解毒散的復雜成分，在等度條件下實現(xiàn)三者的分離較困難。因此，需采用梯度洗脫方法實現(xiàn)對黃連解毒散中非法添加對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新的檢測。根據(jù)文獻[3-4]，獸藥中非法添加對乙酰氨基酚檢查方法常采用高比例磷酸鹽溶液，嘗試調(diào)高有機相比例以盡快洗脫鹽酸溴己新，但高比例的有機相易導致磷酸鹽析出堵塞高效液相色譜儀和色譜柱。嘗試以冰醋酸溶液作為水相[2]，加入三乙胺調(diào)節(jié)pH值。選擇不同濃度的冰醋酸溶液，調(diào)至不同的pH值。經(jīng)過優(yōu)化，最終確定以1%冰醋酸溶液作為水相，調(diào)節(jié)pH值至4.0，既能實現(xiàn)有效分離，也能保證峰型良好。

3.2 提取條件的選擇 在非法添加高通量篩查工作中常以甲醇作為溶劑，雖然甲醇提取黃連解毒散有效成分的能力也較強，但考慮到對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新在甲醇中的溶解性良好，因此，仍選取甲醇作為提取溶劑。同時為了盡可能少提取黃連解毒散的有效成分，并保證對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新完全溶解，因此選擇超聲處理15 min，作為提取條件。

3.3 提取波長的選擇 在此測定條件下，對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新對照品在210～400 nm波長范圍內(nèi)的最大吸收波長分別為244.7、248.3、316.1 nm。黃連解毒散中含有黃芩、黃連、黃柏、梔子等，主要有效成分黃芩苷、小檗堿、梔子苷、黃柏酮等均有紫外吸收，最大吸收波長分別為278、345、238和212 nm[10-11]。為最大限度的排除黃連解毒散有效成分及測定溶劑等對紫外吸收的干擾，選擇248 nm作為提取波長。

3.4 峰純度檢查和光譜相似度檢查 峰純度檢查可以作為判斷色譜峰是否為單一物質(zhì)峰的重要指標，無論是在方法優(yōu)化過程中，還是在供試品非法添加物檢查中都能發(fā)揮重要作用。根據(jù)色譜工作站處理軟件(Waters Empower3)對色譜峰的處理結果顯示對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新的純度角度均小于純度閾值，說明未包裹共流出物，在對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新出峰處無其他干擾峰，均為單一物質(zhì)峰；光譜相似度檢查可以將供試品中相應添加物的光譜與對照品進行匹配，以排除保留時間一致但紫外光譜不同的添加物的干擾。以對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新對照品溶液作為建立光譜數(shù)據(jù)庫的溶液，將供試品中非法添加物色譜峰的光譜與光譜庫進行匹配，匹配角度均小于匹配閾值，說明供試溶液中相應色譜峰的光譜與對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新對照品的光譜非常相似。峰純度檢查配合光譜相似度檢查，比單純的供試品與對照品比對法更有說服力。本文采用峰純度檢查和光譜相似度檢查輔助對照品比對方法，對黃連解毒散中非法添加對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新進行確證，結果可靠。

試驗所建立的方法中黃連解毒散各有效成分對檢測無干擾，通過與對照品色譜峰的保留時間進行比對，以及峰純度檢查和光譜匹相似度檢查來判定黃連解毒散中是否添加了對乙酰氨基酚和鹽酸溴己新，方法簡便、可靠、重復性好，可廣泛應用于獸藥非法添加檢測工作，為獸藥質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術保障。

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(編輯：陳希)

Simultaneous Determination of Acetaminophen and Bromhexine Hydrochloride Illegally Added in the Huanglian Jiedu Powder by HPLC-PDA

DONG Ling-ling, WANG Jing-wen, GONG Xu-hao,YANG Xing，F(xiàn)AN Qiang*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

A method for the simultaneous determination of acetaminophen and bromhexine hydrochloride illegally added in the Huanglian Jiedu Powder was developed by the high performance liquid chromatography with photo-diode array detector (HPLC-PDA). It was tested with C18 column, using 1% acetic acid solution(adjusting pH to 4.0 by triethylamine) and methanol with gradient elutionas the mobile phase. The scanning wavelength was from 210 to 400 nm.Peak purity test and spectrum similarity test were used to identify the illegally added drugs.The mean recoveries of acetaminophen and bromhexine hydrochloride was 98.6% and 99.4%, respectively.RSDwas 0.6% and 0.2%, respectively. In conclusion, the method is simple, accurate and reliable for the determination of acetaminophen and bromhexine hydrochloride in the Huanglian Jiedu Powder.

acetaminophen; bromhexine hydrochloride;Huanglian Jiedu Powder; HPLC-PDA

"十二五"科技支撐計劃(2015BAD11B03-4)

董玲玲，碩士研究生，從事藥品檢驗工作。

范強。E-mail:fanqiang@ivde.gov.cn

2016-02-15

A

1002-1280 (2016) 05-0019-05

S853.7