李翠，張秀英，蔣卉，戴志紅，楊承槐，孫淼，王在時(shí)

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

外源病毒檢驗(yàn)用抗鴨瘟病毒特異性陽(yáng)性血清的制備與檢定

李翠，張秀英，蔣卉，戴志紅，楊承槐，孫淼，王在時(shí)*

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為制備鴨瘟種毒和鴨瘟活疫苗檢驗(yàn)用抗鴨瘟病毒特異性陽(yáng)性血清，對(duì)6個(gè)月齡左右的山羊進(jìn)行五次免疫。最后一次免疫后2周采血并分離血清，血清經(jīng)混合、分裝、冷凍真空干燥后，對(duì)其進(jìn)行了無(wú)菌檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、剩余水分測(cè)定、中和效價(jià)測(cè)定、均勻性檢驗(yàn)。結(jié)果表明，本研究制備的抗鴨瘟病毒陽(yáng)性血清特異性良好，無(wú)菌檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)和剩余水分測(cè)定均符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010年版三部)規(guī)定；血清中和效價(jià)大于1∶100，均勻性良好，可滿足獸藥典標(biāo)準(zhǔn)中鴨瘟種毒和鴨瘟活疫苗的鑒別檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)。

鴨瘟；特異性血清；檢驗(yàn)

鴨瘟或鴨病毒性腸炎(DVE)是由鴨瘟病毒(duck plague virus, DPV)引起的鴨、鵝及多種雁行目禽類的一種急性、高致死率的傳染病。目前，各主要養(yǎng)鴨國(guó)家均有發(fā)生該病的報(bào)道，易感鴨群初始癥狀通常為突發(fā)持續(xù)性高死亡現(xiàn)象，產(chǎn)蛋量明顯下降[1]。鴨瘟診斷技術(shù)、診斷試劑以及疫苗等是該病防制的關(guān)鍵。按照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》[2]，病原鑒定和血清學(xué)診斷都可用抗鴨瘟病毒特異性血清進(jìn)行中和試驗(yàn)；《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2010年版三部)[3]要求，鴨瘟活疫苗鑒別檢驗(yàn)項(xiàng)中需要抗鴨瘟病毒特異性血清，但是目前國(guó)內(nèi)缺乏質(zhì)量穩(wěn)定的抗鴨瘟病毒特異性血清。而且，由于缺乏效價(jià)較高的抗鴨瘟病毒特異性血清，目前鴨瘟活疫苗的外源病毒檢驗(yàn)項(xiàng)是通過(guò)雞檢查法進(jìn)行的，檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，檢驗(yàn)成本高。本研究首次以鴨瘟病毒AV1221株滅活液和鴨瘟病毒雞胚弱毒AV1222株對(duì)山羊進(jìn)行免疫，獲得具有高中和效價(jià)的特異性陽(yáng)性血清，并使得血清的純凈性更易控制和可靠，滿足了鴨瘟毒種和鴨瘟活疫苗的檢驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種毒 鴨瘟病毒AV1221株和鴨瘟病毒雞胚弱毒AV1222株均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 田間6個(gè)月齡左右未得并未免疫口蹄疫的山羊。

1.1.3 SPF雞胚 均購(gòu)自北京梅里亞維通試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.4 試劑和試劑盒 布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)用抗原由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備、提供；豬偽狂犬病毒gB抗體檢測(cè)試劑盒、牛病毒性腹瀉抗體檢測(cè)試劑盒、PrioCHECK口蹄疫病毒O型抗體檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自IDEXX公司;PPR Competitive ELISA試劑盒購(gòu)自ID.vetScreenR;Ruminant Bluetongue Advanced Ⅱ - Serum試劑盒購(gòu)自法國(guó)LSIVetTM。

1.2 方法

1.2.1 山羊篩選 選擇田間6～12個(gè)月齡、未得且未免疫口蹄疫的山羊，并按照表1中列出的檢驗(yàn)方法對(duì)支原體、布魯氏菌病、牛病毒性腹瀉/粘膜病BVDV、偽狂犬病、藍(lán)舌病、小反芻獸疫、羊痘和口蹄疫抗體進(jìn)行檢測(cè)。

表1 病源抗體及其檢驗(yàn)方法

1.2.2 抗原的制備[4]鴨瘟病毒AV1221株滅活液用滅菌生理鹽水將鴨瘟病毒AV1221株毒種作50～100倍稀釋，接種9～10齡鴨胚絨毛尿囊膜，每胚0.2 mL。選擇接種后48～120 h內(nèi)死亡的鴨胚，分別收取絨毛尿囊膜和胚液，勻漿后加入適量雙抗制成鴨胚毒，冷凍保存。鴨胚毒作5000倍稀釋，用9～10日齡鴨胚10個(gè)接種于絨毛尿囊膜上，每胚0.2 mL，接種后鴨胚應(yīng)60～168 h內(nèi)全部死亡且胎兒有明顯病痕；純凈性應(yīng)無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。鴨胚毒滿足以上標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)甲醛滅活后可作為免疫原。

鴨瘟病毒雞胚弱毒AV1222株用滅菌生理鹽水將鴨瘟病毒雞胚弱毒AV1222株毒種作50～100倍稀釋，接種9～10齡SPF雞胚絨毛尿囊膜，每胚0.2 mL。選擇接種后48～120 h內(nèi)死亡的雞胚，分別收取絨毛尿囊膜和胚液，勻漿后加入適量雙抗制成雞胚毒，冷凍保存。雞胚毒作5000倍稀釋，用9～10日齡SPF雞胚10個(gè)接種于絨毛尿囊膜上，每胚0.2 mL，接種后雞胚應(yīng)60～168 h內(nèi)全部死亡且胎兒有明顯病痕；純凈性應(yīng)無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。雞胚毒滿足以上標(biāo)準(zhǔn)可作為免疫原。

1.2.3 免疫程序 按照表2免疫程序?qū)ι窖蜻M(jìn)行免疫。

1.2.4 血清采集與分離 最后一次免疫后2周，山羊頸動(dòng)脈采血，分離血清。

1.2.5 分裝凍干 將混合均勻的血清以瓶頂分裝器(滅菌)在無(wú)菌條件下定量分裝至洗滌干凈、且經(jīng)過(guò)150 ℃干烤滅菌30 min的安瓿中，每支安瓿裝量1 mL，凍干后抽真空封口。

1.2.6 無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、真空度測(cè)定和剩余水分測(cè)定 按文獻(xiàn)3進(jìn)行。

1.2.7 中和效價(jià)測(cè)定 將血清56 ℃滅活30 min后2倍系列稀釋，選取適宜稀釋度與鴨瘟病毒AV1222株100 ELD50/0.1 mL的病毒液等量混合，室溫下作用60 min后，經(jīng)絨毛尿囊膜接種9～10日齡SPF雞胚5枚，每胚0.2 mL。同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照雞胚5枚(每胚接種100 ELD50/0.1 mL的病毒液0.1 mL)、血清毒性對(duì)照雞胚5枚(每胚接種血清原液0.1 mL)，陰性血清對(duì)照雞胚5枚(每胚接種陰性血清中和病毒液0.2 mL)，37 ℃孵育168 h，觀察雞胚死亡數(shù)，根據(jù)中和組雞胚死亡情況，按照Reed-Muench方法計(jì)算血清的中和抗體效價(jià)。

表2 鴨瘟高免血清免疫程序

1.2.8 均勻性檢驗(yàn) 從凍干血清中隨機(jī)選取10支進(jìn)行中和效價(jià)測(cè)定，采用方差分析法統(tǒng)計(jì)樣品均勻性。

1.2.9 3批鴨瘟活疫苗及種毒外源病毒檢驗(yàn) 按文獻(xiàn)[3]將3批疫苗稀釋至200羽份/2 mL和20羽份/2 mL，種毒稀釋至103.0ELD50/0.1 mL，分別與等體積56 ℃滅活30 min的抗鴨瘟病毒特異性血清混合，置室溫作用60 min后，分別接種雞成纖維細(xì)胞和10日齡SPF雞胚，進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)和真空度測(cè)定 從凍干血清中隨機(jī)選取5支按文獻(xiàn)3分別進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)和真空度測(cè)定，均無(wú)菌生長(zhǎng)，且無(wú)外源病毒污染，檢驗(yàn)合格。

2.2 剩余水分測(cè)定 按文獻(xiàn)3進(jìn)行，剩余水分含量為0.7%、1.1%、0.8%、0.7%，均小于3%，檢驗(yàn)合格。

2.3 中和效價(jià)測(cè)定 隨機(jī)抽取10支凍干血清，無(wú)菌生理鹽水復(fù)溶后56 ℃滅活30 min，10倍稀釋后再2倍倍比稀釋至1∶80、1∶160、1∶320和1∶640，測(cè)定其中和100ELD50/0.1 mL的鴨瘟病毒AV1222株的中和效價(jià)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 10支凍干陽(yáng)性血清中和效價(jià)測(cè)定結(jié)果

2.4 均勻性檢驗(yàn) 采用方差分析法統(tǒng)計(jì)樣品均勻性。此方法是通過(guò)組間方差和組內(nèi)方差的比較來(lái)判斷各組測(cè)量值之間有無(wú)系統(tǒng)性差異，如果兩者的比小于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的臨界值，則認(rèn)為樣品是均勻的。經(jīng)檢驗(yàn)，10個(gè)樣品組內(nèi)與組間無(wú)明顯差異，樣品是均勻的。

2.5 3批鴨瘟活疫苗和種毒外源病毒檢驗(yàn) 3批疫苗樣品和種毒的外源病毒檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果表明，1 mL血清能完全中和病毒含量為104.0ELD50/mL的種毒；2 mL血清能完全中和200羽份病毒含量為103.5ELD50/羽份的疫苗樣品，以及20羽份病毒含量為104.17ELD50/羽份和104.5ELD50/羽份的疫苗樣品。

表4 三批鴨瘟活疫苗和種毒外源病毒檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論與小結(jié)

本研究旨在為鴨瘟診斷技術(shù)、診斷試劑以及疫苗質(zhì)量監(jiān)控提供滿足要求的鴨瘟陽(yáng)性血清，這要求陽(yáng)性血清應(yīng)具有良好的特異性和足夠高的中和效價(jià)。袁明龍等[5]免疫山羊制備了羊抗鴨IgG，瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)1∶64，蔡銘升等[6]免疫家兔制備了兔抗VP26血清，瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)1∶32。鑒于山羊?qū)Π捳畈《镜拿舾行?，本研究以山羊作為免疫?dòng)物，并優(yōu)化了免疫程序，以鴨瘟病毒AV1221株滅活液基礎(chǔ)免疫后再以鴨瘟病毒AV1221株滅活液和鴨瘟雞胚弱化毒AV1222株活病毒協(xié)同免疫，最終獲得了中和效價(jià)大于1∶100倍的鴨瘟陽(yáng)性血清，可滿足獸藥典標(biāo)準(zhǔn)中鴨瘟活疫苗及毒種的外源病毒檢驗(yàn)和鑒別檢驗(yàn)；以山羊作為免疫動(dòng)物，其不含有禽源病原體，在試驗(yàn)動(dòng)物純凈度上容易控制，保證了陽(yáng)性血清具有良好的特異性。另外，免疫原為鴨瘟病毒AV1221株滅活液和鴨瘟病毒雞胚弱毒AV1222株，容易獲得且避免使用鴨瘟強(qiáng)毒免疫，降低了生物安全風(fēng)險(xiǎn)；免疫程序共經(jīng)過(guò)五次免疫，簡(jiǎn)便易行，適合大規(guī)模制備。

本研究制備的抗鴨瘟病毒特異性血清可滿足獸藥典標(biāo)準(zhǔn)中鴨瘟活疫苗及毒種的外源病毒檢驗(yàn)和鑒別檢驗(yàn)，有望將獸藥典標(biāo)準(zhǔn)中鴨瘟活疫苗的外源病毒檢驗(yàn)方法修改為雞胚檢查法，以縮短檢驗(yàn)周期，降低檢驗(yàn)成本。

[1] 殷震，劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)[M]. 第二版. 北京: 科學(xué)出版社, 1997:1073-1077.

[2] 世界動(dòng)物衛(wèi)生組織著, 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局/中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心譯. 陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)[M]. 第五版. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2007: 828-834.

[3] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典三部(二〇一〇年版)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2011: 65-66.

[4] 范書(shū)才, 李虹, 朱良全, 等. 鴨瘟滅活疫苗種毒篩選及生產(chǎn)用種毒種子批的建立[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2009, 31(6): 458-461.

[5] 袁明龍, 楊永紀(jì), 諸奎龍, 等. 鴨瘟抗體檢測(cè)方法研究[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2001, 23(2): 140-143.

[6] 蔡銘升. 鴨瘟病毒UL35基因的原核表達(dá)、蛋白純化、轉(zhuǎn)錄時(shí)相、表達(dá)時(shí)相及亞細(xì)胞定位[D]. 雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

(編輯：侯向輝)

Preparation and Identification of Specific Antiserum against Duck Plague Virus for Test

LI Cui, ZHANG Xiu-ying, JIANG Hui, DAI Zhi-hong, YANG Cheng-huai, SUN Miao, WANG Zai-shi*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

To prepare the specific antiserum against duck plague virus (DPV) for test, goats with about 6 months old were inoculated with live and inactivated DPV. 2 weeks after the last immunity, serums were collected and mixed thoroughly. After lyophilization, the serum was used for sterility test, exogenous virus test, residual moisture test, neutralization titer determination and uniformity test. The results of sterility test, exogenous virus test, residual moisture testcomplied with China veterinary pharmacopoeia. The neutralization titer was higher than 1∶100. The antiserum against DPV was prepared with high specificity and good uniformity for the identifying inspection and exogenous virus test of duck plague live vaccines and virus seeds.

duck plague virus; specific antiserum; test

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2015BAD12B03-07)，948項(xiàng)目(2011-G14(4))

李翠，從事獸用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理與研究。

王在時(shí)。E-mail：wangzaishi@ivdc.org.cn

2015-12-31

A

1002-1280 (2016) 05-0007-04

S852.65