張璐，馬秋冉，戴青，董玲玲，趙富華，楊星，于曉輝

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

衍生氣相色譜法測定雞疫苗中游離甲醛的含量

張璐，馬秋冉，戴青，董玲玲，趙富華，楊星，于曉輝*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

建立了雞疫苗中游離甲醛含量測定的衍生氣相色譜法。用2,4-二硝基苯肼衍生雞疫苗中的游離甲醛后，環(huán)己烷萃取衍生物，HP-5毛細(xì)管色譜柱分離，氣相色譜分析，電子捕獲檢測器檢測，外標(biāo)法定量。游離甲醛質(zhì)量濃度在0.05～5 mg/L內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=2781.9X+14.525 (r=0.9999)。平均加樣回收率為99.44%(RSD=1.87%)。本方法準(zhǔn)確穩(wěn)定，靈敏度高，重復(fù)性好，可用于雞疫苗中游離甲醛的含量測定。

雞疫苗；甲醛；2,4-二硝基苯肼衍生化；氣相色譜法

甲醛是在雞疫苗抗原滅活過程中用到的最傳統(tǒng)、最廣泛的化學(xué)滅活劑[1]，是一種熔點-92 ℃、沸點-21 ℃的原生質(zhì)毒素，疫苗中高甲醛殘留將會影響雞的健康。有研究表明，若抗原滅活后甲醛去除不徹底，將導(dǎo)致雞疫苗中甲醛含量過高，引起雞雌激素分泌下降，這可能是造成產(chǎn)蛋性能下降的主要因素之一[2]。因此，需要對雞疫苗甲醛殘留量進行嚴(yán)格控制。

目前，對于甲醛的含量測定主要采用分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法等[3]。2010年版《中華人民共和國獸藥典》三部收錄的雞疫苗中甲醛殘留量的測定方法為乙酰丙酮分光光度法[4]，其存在的問題是很多雞疫苗中含有有色物質(zhì)，這些有色物質(zhì)會對試驗結(jié)果產(chǎn)生干擾，影響甲醛含量的準(zhǔn)確測定。文獻(xiàn)中尚未見采用氣相色譜法測定雞疫苗中甲醛含量的相關(guān)報道。本研究以雞新城疫滅活疫苗為供試品，建立了測定雞疫苗中游離甲醛含量的衍生氣相色譜法，并應(yīng)用該方法分別測定了四種雞疫苗中甲醛的含量，這四種疫苗類型包括油苗、水苗及含有有色物質(zhì)的疫苗等。

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備 Agilent 7890A氣相色譜儀及7693自動進樣系統(tǒng)；HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；分析天平：感量0.00001 g；KQ3200型超聲波清洗器；渦旋混合儀；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋。

1.2 試劑和甲醛標(biāo)準(zhǔn)品 甲醛溶液(含量37.0%～40.0%，經(jīng)標(biāo)定甲醛含量為37%[4]，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：141120)。雞新城疫滅活疫苗(批號：2015003)、豬細(xì)小病毒滅活疫苗NJ株(批號：20150002)、瑞仔健豬細(xì)小病毒病滅活疫苗(批號：1406003)、豬多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗(批號：153503)。2,4-二硝基苯肼(2,4-DNPH)、鹽酸、環(huán)己烷、吐溫-80、乙醇均為分析純。吐溫-80購自香港GFCO化學(xué)品供應(yīng)，其余購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 色譜條件 采用HP-5毛細(xì)管柱，升溫程序：初始溫度為150 ℃，保持1 min，以每分鐘20 ℃的速率升溫至250 ℃，保持6 min；進樣口溫度為300 ℃，隔壁吹掃3 mL/min，分流比為50︰1；電子捕獲檢測器(ECD)檢測器，檢測器溫度為350 ℃，尾吹60 mL/min。載氣為N2，流量為2 mL/min；進樣量為1 μL。

1.4 溶液的配制

1.4.1 衍生化試劑 取2,4-DNPH 0.3 g置100 mL棕色容量瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%的鹽酸60 mL，超聲使溶解，搖勻，加水稀釋至刻度，制成2,4-DNPH衍生化試劑。

1.4.2 對照品儲備液 精密稱取甲醛溶液適量置100 mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，搖勻。從中取10.0 mL于100 mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，搖勻，制成0.1 mg/mL的甲醛對照品儲備液，臨用前按需稀釋配制。1.4.3 供試品溶液 精密量取雞新城疫滅活疫苗(油苗)5.0 mL，置50 mL容量瓶中，用20%吐溫-80乙醇溶液10 mL，分次洗滌吸管，洗液并入50 mL量瓶中，搖勻，加水稀釋至刻度，強烈振搖，置分液漏斗中靜置分層，吸取下層溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，制成供試品溶液[4]。

1.5 樣品的衍生化處理方法 精密吸取對照品或供試品溶液各1.0 mL，分別置15 mL離心管中，加入2,4-DNPH衍生化試劑1 mL，渦旋1 min，超聲5 min，60 ℃保溫45 min，迅速冷卻，精密加入環(huán)己烷3.0 mL，渦旋萃取1 min，靜置分層后取上層液置氣相小瓶中，供氣相色譜法測定。

2 方法學(xué)驗證

2.1 樣品的衍生化反應(yīng)條件優(yōu)化 紀(jì)宏等[3]在用衍生化氣相色譜法測定重組乙型肝炎疫苗中游離甲醛含量時，對甲醛衍生化方法進行考察，試驗表明超聲時間、衍生化溫度對衍生化結(jié)果影響不大，以環(huán)己烷作為萃取劑萃取率高于正己烷14%。 為保證衍生過程反應(yīng)充分、衍生化產(chǎn)物萃取完全，取對照品溶液(1 mg/L)，分別比較了衍生時間(30、45、60 min)、衍生化劑加入量(1、2、3 mL)、萃取劑加入量(2.0、3.0、4.0 mL)等因素對衍生化后測定靈敏度的影響，見圖1。為保證充分反應(yīng)且節(jié)省時間，綜合紀(jì)宏等[3]的研究結(jié)果，確定衍生時間為45 min。比較衍生劑加入量和萃取劑加入量對含量測定結(jié)果的影響，最終確定加入1 mL的衍生劑，萃取劑為3.0 mL環(huán)己烷。

圖1 衍生化條件的考察結(jié)果

2.2 色譜系統(tǒng)的專屬性 取雞新城疫滅活疫苗供試品溶液，首先按1.5項下處理樣品，然后按1.3項下色譜條件測定，游離甲醛衍生物與相鄰最近色譜峰的分離度均大于6.0，理論塔板數(shù)大于200000，主峰保留時間約為5.53 min?？梢娫撓到y(tǒng)能夠滿足甲醛衍生物和其他雜質(zhì)成分達(dá)到基線分離的要求(圖2)。

A 空白；B 對照品；C 供試品圖2 游離甲醛衍生化氣相色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取適量甲醛對照品儲備液，加水稀釋成濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、1、2、3、5 mg/L的系列溶液。按1.5項下衍生化，供氣相色譜分析。以各色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，對照溶液濃度為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)得到回歸方程Y=2781.9X+14.525(r=0.9999)。表明游離甲醛含量在0.05～5 mg/L范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖3 甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 精密度試驗 取對照品溶液(1 mg/L)，按1.5項下衍生化后，照1.3項下色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄色譜圖，按峰面積計算RSD為1.34%。表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗 精密取同一供試品溶液6份(批號：2015003)各5.0 mL，分別置50 mL容量瓶中，按1.4.3項下稀釋定容后。吸取1.0 mL，置于15 mL離心管中，按1.5項下衍生化，照1.3項下色譜條件測定，計算游離甲醛平均含量為0.0701 mg/mL，RSD值為1.82%，表明該方法重復(fù)性好。

2.6 定量限的確定 精密吸取質(zhì)量濃度為1 mg/L的對照品溶液1.0 mL，用水逐步稀釋得到質(zhì)量濃度為0.5 、0.1、0.05 mg/L的溶液，按1.5項下衍生化后，以1.3色譜條件測定。試驗結(jié)果表明，在滿足信噪比大于10︰1時，0.05 mg/L甲醛溶液的基線波動與空白溶液的基線波動接近，故確定甲醛的最低定量限為0.05 mg/L。

2.7 甲醛衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性考察 精密吸取已知濃度的供試品溶液1.0 mL，按1.5項下衍生化后，將待測樣品放入氣相小瓶，密封瓶口，置4 ℃冰箱中，分別在0、2、4、6、8、12、24 h時測定峰面積(測定峰面積前要將供試品溶液放置至室溫)。計算峰面積平均值為1941，RSD值為0.85%，表明甲醛衍生化產(chǎn)物24 h內(nèi)測定較為穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗 精密量取6份2.5 mL濃度為0.0701 mg/mL的供試品試液，分別置50 mL容量瓶中，加入0.1 mg/L的甲醛溶液1.8 mL，按1.5項下衍生化后，照1.3項下色譜條件測定。結(jié)果顯示，加樣回收率在96.72%～102.22%之間，RSD為1.87%，表明該方法回收率高(表1)。

表1 甲醛的加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)

2.9 樣品中游離甲醛含量的測定 取各樣品溶液，按1.5項下衍生化后，照1.3項下色譜條件測定，計算雞疫苗中游離甲醛含量(表2)。試驗結(jié)果表明，4批雞疫苗中游離甲醛含量的測定結(jié)果與本課題組新開發(fā)的利用紫外可見分光光度法、高效液相色譜法所測得的甲醛含量基本一致。

表2 雞疫苗中游離甲醛含量測定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

為建立甲醛氣相色譜條件，試驗前期對色譜柱、進樣口溫度、色譜柱溫度、檢測器、檢測器溫度等因素進行了系統(tǒng)考察。使用不同極性的色譜柱，色譜柱型號包括DB-1、HP-5、DB-WAX，結(jié)合甲醛或甲醛衍生物的性質(zhì)，在不同進樣口溫度(200～300 ℃)、色譜柱溫度(150～250 ℃)、檢測器溫度(250～350 ℃)下，使用FID或ECD檢測器，探究氣相色譜對甲醛或甲醛衍生物的分離測定情況。試驗結(jié)果表明，HP-5型色譜柱分別對甲醛或甲醛衍生物的分離效能最好。進樣口溫度、色譜柱溫度及檢測器溫度只要在上述范圍內(nèi)，可確保檢測器對甲醛或甲醛衍生物有響應(yīng)。但對響應(yīng)值起決定性因素的，是檢測器的選擇。試驗結(jié)果表明，F(xiàn)ID檢測器對甲醛靈敏度極低，對甲醛衍生化產(chǎn)物幾乎無響應(yīng)。而ECD檢測器對甲醛衍生化產(chǎn)物非常靈敏，有極低的檢測限。故測定甲醛含量應(yīng)使甲醛與2,4-DNPH衍生化后，使用ECD檢測器進行檢測。

綜上所述，本文建立了測定雞疫苗中游離甲醛含量的衍生氣相色譜法。實驗結(jié)果表明，本方法線性范圍廣，精密度好，準(zhǔn)確度高，可以用于雞疫苗中游離甲醛的含量測定。

[1] 徐守振, 尹燕博, 王新. 動物疫苗中常用抗原滅活劑的研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37(9): 162-167.

[2] 孟迪, 劉哲翔, 曹金元, 等. 禽流感滅活疫苗甲醛含量測定及對產(chǎn)蛋雞雌二醇的影響[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2008, 44(5): 86-87.

[3] 紀(jì)宏, 馬迅, 祁進, 等. 衍生化GC法測定重組乙型肝炎疫苗中游離甲醛的含量[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報, 2015, 32(4): 289-293.

[4] 中華人民共和國獸藥典[M]. 2010年版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社.

(編輯：李文平)

Determination of Free Formaldehyde in Poultry Vaccine by Derivatization Capillary GC

ZHANG Lu，MA Qiu-ran，DAI Qing，DONG Ling-ling， ZHAO FU-hua，YANG Xing，YU Xiao-hui*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugsControl，Beijing100081,China)

A GC method for the determination of free formaldehyde in poultry vaccine has been developed. The samples were derivatized by 2,4-dinitrophenylhydrazine, extracted by cyclohexane, purifid with HP-5 capillary column, seperated by GC with an electron capture detector and qualified by external standard calibration curves. The free formaldehyde in the vaccine showed a good linear relationship to peak area within a concentration range of 0.05～5 mg/L, the regression equation was:Y=2781.9X+14.525(r=0.9999). The average recovery using the established method was 99.44% (RSD=1.87%). The derivatization capillary gas chromatography method is developed, which is accurate, stable, sensitive, reproducible and might be used for determination of free formaldehyde in poultry vaccine.

poultry vaccine; formaldehyde; 2,4-dinitrophenylhydrazine derivative; GC

張璐，碩士，從事獸藥檢驗及相關(guān)研究。

于曉輝。E-mail：yuxiaohui@ivdc.org.cn

2015-05-25

A

1002-1280 (2016) 07-0030-04

S858.31