李瑩，高銘彤，李婧毓，劉一桐，曾露露，丁傳波,2，劉文叢*，鄭毅男*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林省長春市，130118；2.琿春華瑞參業(yè)生物工程股份有限公司,吉林省琿春市，133300)

黃秋葵醇提物對順鉑致急性腎損傷的保護(hù)作用

李瑩1，高銘彤1，李婧毓1，劉一桐1，曾露露1，丁傳波1,2，劉文叢1*，鄭毅男1*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林省長春市，130118；2.琿春華瑞參業(yè)生物工程股份有限公司,吉林省琿春市，133300)

為了探討黃秋葵嫩果醇提物對順鉑致小鼠急性腎損傷是否具有保護(hù)作用，將50只SPF級ICR雄性小鼠隨機(jī)均分為空白對照組(0.9%生理鹽水)、模型組(0.9%生理鹽水)、黃秋葵醇提物(HQK)高中低劑量組(400、200、100 mg/kg),分別灌胃給藥7 d，除空白對照組，于第7天給藥1 h后灌胃給順鉑20 mg/kg。再灌胃給藥3 d后，眼球取血，測定血清中尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量；測定腎臟勻漿中SOD、GSH和MDA含量；并觀察蘇木精-伊紅(HE)病理切片組織病理學(xué)變化。結(jié)果表明：與模型組比較，HQK高、中劑量組中BUN、CRE含量均降低，腎組織GSH、SOD含量均升高(P<0.01，P<0.05)，HE染色觀察HQK高劑量組可顯著保護(hù)順鉑致腎組織病理損害。黃秋葵醇提取物對CDDP誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷均有一定的保護(hù)作用。

順鉑；黃秋葵醇提取物；腎毒性；血尿素氮；肌酐

順鉑(cis-diamminedichloroplatinum, CDDP)是廣泛應(yīng)用于臨床的抗腫瘤化療藥物，治療多種實(shí)體腫瘤[1]，但CDDP具有一定的毒副作用，其中腎毒性最為常見，成為限制CDDP在臨床大量使用的主要原因。已有研究表明，CDDP的腎毒性與多種因素有關(guān)，包括一氧化氮應(yīng)激[2]、氧化應(yīng)激等[3]。因此，研究一種藥物在使用CDDP治療腫瘤的過程中與CDDP結(jié)合使其降低毒副作用，是目前藥理學(xué)、毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)。

黃秋葵(AbelmoschusesculentusLinn．)屬于錦葵科(Malvaceae)秋葵屬(Abelmoschus Medic)一年生草本植物，別名咖啡黃葵、補(bǔ)腎草等[4-5]。在歐美國家被譽(yù)為“植物偉哥”，日本稱其為“綠色人參”，具有一定保護(hù)腎臟功效[6]。目前，對于黃秋葵醇提物(Okra alcohol extract，HQK)對順鉑致急性腎損傷的保護(hù)作用尚未見報(bào)道，試驗(yàn)通過建立順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷模型，研究黃秋葵醇提物其對腎臟保護(hù)作用的研究，以期為黃秋葵對腎臟保護(hù)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 黃秋葵采購于江西萍鄉(xiāng)，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院鄭毅男教授鑒定為錦葵科(Malvaceae)秋葵屬(Abelmoschus Medic)黃秋葵；順鉑(sigma公司，CAS號15663-27-1)；MK3型酶標(biāo)儀(美國Thermo Electron公司)；肌酐、尿素氮、MDA、SOD、GSH、考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20151130)；SPF級ICR雄性小鼠，體質(zhì)量(18～22)g(長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK-(吉)-2011-0004)50只。

1.2 方法

1.2.1 藥物準(zhǔn)備 黃秋葵醇提物(HQK)制備：1 kg黃秋葵嫩果，冷凍干燥，粉碎，20、15、10倍量的70%乙醇超聲提取3次，每次30 min，抽濾，合并濾液，減壓濃縮，用真空干燥機(jī)干燥的HQK 367.5 g。分別取HQK 100、200、400 mg分別定容到10 ml容量瓶中，即得10、20、40 mg/mL HQK溶液。

順鉑：精確稱取CDDP 0.2 g,置于100 mL容量瓶中，加入5‰羧甲基纖維素鈉定容，即得2 mg/mL順鉑溶液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物分組 ICR雄性小鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為空白對照組、模型組、HQK高、中、低劑量組(100、200、400 mg/kg)，每組10只，空白對照組和模型組每天灌胃生理鹽水，其他給藥組分別灌胃相應(yīng)藥物,按0.1 mL/10 g劑量給藥，共給藥10 d，每次灌胃前記錄小鼠體重，計(jì)算小鼠順鉑造模前后體重變化率。于給藥第6天晚上禁食不禁水，第7天正常給藥1h后，除空白對照組灌胃給藥0.1 mL/10 g順鉑后，繼續(xù)正常給藥3 d。第9天晚上禁食不禁水，第10天正常給藥后1 h，眼球取血，脊椎處死，取兩側(cè)腎臟組織，去包膜脂肪稱重，并計(jì)算腎臟指數(shù)=(腎臟濕重/體重)×100%。全血室溫靜置30 min后，3500 r 離心10 min分離血清，4℃下保存。按照試劑盒說明書分別測定血清BUN、CRE、MDA、GSH、SOD。取一定量的右腎組織制備10%勻漿以備分別測定MDA、GSH、SOD。另取左腎于4%甲醛中固定,切片處理，HE染色法觀察腎組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

與空白對照組相比，模型組小鼠少動，毛色稀疏無光澤，飲食飲水量明顯下降，體重明顯減輕；HQK給藥組(200、400 mg/kg)較模型組，狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，活動量明顯增加，毛色較有光澤，體重略有上升。

2.1 各組體重、臟器指數(shù)比較 各組小鼠初始體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。建立模型后，模型組與空白對照組和HQK給藥組相比，小鼠體重變化率、腎臟系數(shù)顯著下降；HQK給藥組(200、400 mg/kg)與模型組相比，小鼠體重、腎臟指數(shù)變化率顯著增加(P<0.01，P<0.05)，如表1、表2所示。

表1 HQK對順鉑所致小鼠體重變化的影響

表2 HQK對順鉑所致小鼠腎臟重量和腎臟指數(shù)的影響±s,n=10)

與空白組，#P<0.05，##P<0.01；與模型組，*P<0.05，**P<0.01

2.2 各組血清BUN、CRE比較 模型組與空白對照組相比BUN和CRE均顯著升高，分別是空白對照組的1.4和1.5倍；與模型組相比，HQK高劑量組BUN和CRE分別降低了26%和32%；HQK中劑量組分別降低了14%和21%；HQK低劑量組分別降低了9%和16%，如表3所示。

表3 HQK對順鉑所致小鼠血清BUN、CRE影響

與空白組，#P<0.05，##P<0.01；與模型組，*P<0.05，**P<0.01

2.3 各組血清、腎組織的MDA、GSH、SOD比較 與空白對照組相比，模型組血清與腎組織丙二醛(MDA)均顯著升高27%和58%；谷胱甘肽(GSH)顯著性降低19%和41%；超氧化物歧化酶(SOD)均顯著性降低28%和40%。各給藥組與模型組相比，HQK高、中、低劑量組血清與腎組織中MDA均顯著性降低24%、17%、13%與31%、24%、14%(P<0.01，P<0.05)； HQK高、中劑量組血清與腎組織中GSH均有顯著性升高1.17倍、1.15倍與1.52倍、1.23倍(P<0.01，P<0.05)； HQK高、中劑量組血清與腎組織中SOD均有1.32倍、1.07倍與1.65倍、1.28倍增加，呈顯著性差異(P<0.01，P<0.05)，證明HQK高、中劑量可以改善抗氧化性指標(biāo)，緩解腎組織損傷程度，如圖1所示。

2.4 黃秋葵對小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)影響 空白對照組小鼠腎臟呈鮮紅色，表面光滑。模型組小鼠的腎臟呈灰白色，表面粗糙，有水泡樣密集小點(diǎn)。HQK給藥組小鼠的腎臟呈暗紅色，表面稍有粗糙，個(gè)別小鼠有水泡樣的小點(diǎn)。選擇“2.3”“2.4”項(xiàng)下作用較明顯組小鼠的腎臟進(jìn)行HE染色。如圖2可見：與空白對照組比較，模型組小鼠的腎臟組織有明顯的腎小管腔阻塞出血，管腔擴(kuò)張，腎小管上皮見扁平細(xì)胞，細(xì)胞核大片固縮。與模型組相比，HQK給藥組小鼠腎臟病理變化均有所改善；HQK高劑量組沒有明顯的腎小管腔阻塞出血，腎小管排列規(guī)則，少量細(xì)胞核固縮，變性壞死現(xiàn)象減輕。

圖1 黃秋葵醇提物對小鼠血清及腎臟組織中MDA、GSH、SOD的影響

圖2 空白對照組(A)、CDDP模型組(B)、黃秋葵高劑量組(C)、黃秋葵中劑量組(D)、黃秋葵低劑量組(E)結(jié)果圖(HE×400)

3 討論與小結(jié)

順鉑(CDDP)為臨床上常用于治療實(shí)體腫瘤且有效的化療藥物，但是其對正常組織中有嚴(yán)重的副作用，限制其在臨床中的應(yīng)用。其副作用有有耳毒性、 胃腸道毒性、 骨髓抑制、 變態(tài)反應(yīng)及急性腎功能損傷[7-8],其中急性腎損傷最常見。有研究表明CDDP對腎臟損傷的最主要的原因可能是氧化應(yīng)激損傷，因此，探索一種具有抗氧化作用的天然藥物，并且能夠降低順鉑致腎毒性和保護(hù)腎功能損傷狀況的藥物具有重要意義。近年來，學(xué)者們對黃秋葵活性成分進(jìn)行了許多研究，周兆祥[9]研究表明黃秋葵茶葉富含黃酮、多糖等活性成分，具有較好抗氧化能力。劉愛靜[10]等黃秋葵中黃酮成分具有較強(qiáng)的自由基清除能力及還原能力。進(jìn)而，對黃秋葵醇提物對順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷的保護(hù)作用提供了重要理論依據(jù)。

本試驗(yàn)中血清中BUN和CRE的濃度在于機(jī)體氮的分解代謝和腎臟的排泄功能有關(guān)，在一定程度上BUN和CRE的濃度可以反映腎小球?yàn)V過率功能的損傷程度，臟器指數(shù)的變化可以有效的反映藥物對該器官的毒性作用[11]。結(jié)果表明，黃秋葵醇提物高劑量肌酐(BUN)和尿素氮(CRE)均顯著性降低，對腎小球有一定的保護(hù)作用。

血清和腎臟組織中的丙二醛(MDA)和超氧化歧化酶(SOD)測定相互結(jié)合[12]，MDA的高低間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，而SOD又間接的反映了機(jī)體清除自由基的能力[13]。并且血清與腎臟組織中的谷胱甘肽(GSH)是一種低分子清除劑，缺乏或耗竭GSH會促使CDDP對腎臟的急性損傷或加重其中毒作用[14]。本試驗(yàn)中黃秋葵醇提物高劑量組中，血清與腎臟組織的MDA顯著性降低，GSH和SOD顯著性增加(P<0.01)。黃秋葵醇提物可以減輕CDDP引起氧化應(yīng)激的損傷，降低其中毒作用。并通過觀察蘇木精-伊紅(HE)病理切片組織病理學(xué)變化，認(rèn)為黃秋葵醇提物高劑量對CDDP致急性腎損傷有一定的保護(hù)作用,其保護(hù)機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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(編輯：陳希)

Protective Effects of Alcohol Extract of Okra CisplatinInduced Acute Kidney Injury

LI Ying1, GAO Ming-tong1,LI Jing-yu1, LIU Yi-tong1,ZENG Lu-lu1,DING Chuan-bo1,2, LIU Wen-cong1*,ZHENG Yi-nan1*

(1.CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.HunchunHuaruiGinsengIndustryBioengineeringCo.,Ltd.,Hunchun133300 ,China.)

The study of okra tender fruit alcohol extract protective effects against cisplatin-induced acute kidney injury in mice．The 50 SPF ICR male mice were randomly divided into five groups: control (0.9% normal saline), model (0.9% normal saline), okra alcohol extraction from high, medium and low dose group(400、200、100 mg/kg). Respectively, 7 d of intragastric administration. After 7 d, in addition to the control group, were given one hour after administration of gastric administration of cisplatin 20 mg/kg. And then intragastric administration 3 d，after eyeball plasma, serum centrifugal stay. We tested the content of serum blood urea nitrogen(BUN), serum creatinine (CRE),superoxide dismutase(SOD), glutathione (GSH) and malondialdehyde(MDA).Also measured SOD, GSH and MDA content in kidney homogenates; and inspected the changes of pathological by hematoxylin-eosin (HE). The experimental results show ,compared with the model, the okra alcohol extract high and middle dosage group, BUN, CRE content decreased and kidney tissues by GSH, SOD levels were increased (P<0.01，P<0.05). We discovered the okra alcohol extract better than the model could protectd renal pathological damage by HE. Therefore okra alcohol extract on cisplatin-induced acute kidney injury in mice has a protective effect.

cisplatin; okra extract; renal toxicity; blood urea nitrogen; serum create- nine

吉林省自然科學(xué)基金(20160101017JC)；吉林省大學(xué)生創(chuàng)業(yè)資金項(xiàng)目(20160521011HJ)

李瑩，碩士研究生，從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。

劉文叢, E-mail:jwlw6803@126.com;鄭毅男，E-mail:zhengyinan@tom.com

2016-05-13

A

1002-1280 (2016) 07-0052-05

S853.74