王佳奇，陳凱，王月亮，李瑩，劉一桐，高銘彤，李靖毓，丁傳波，宋明銘，劉文叢

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院, 長春 130118)

二氫槲皮素與二氫楊梅素抗炎活性對比研究

王佳奇，陳凱，王月亮，李瑩，劉一桐，高銘彤，李靖毓，丁傳波，宋明銘，劉文叢*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院, 長春 130118)

構(gòu)建巨噬細(xì)胞驗(yàn)證模型，比較研究二氫槲皮素(Dihydroquercetin,taxifolin, TF)和二氫楊梅素(Dihydromyricetin, DMY)體外抗炎活性。以1 mg/L的脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立了體外炎癥模型；通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)(MTT)法檢測細(xì)胞存活率；Griess試劑法測定細(xì)胞上清液中NO(一氧化氮)釋放量；ELISA法檢測上清液中細(xì)胞因子IL-1β(白細(xì)胞介素-1β)、IL-6(白細(xì)胞介素-6)、TNF-α(腫瘤壞死因子α)和PGE2(前列腺素E2)的含量變化；通過RT-PCR法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達(dá)情況。MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，二氫槲皮素和二氫楊梅素各劑量組沒有表現(xiàn)出對巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞毒性。同時，二氫槲皮素高中低劑量組和二氫楊梅素高中低劑量組均能顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)細(xì)胞對NO、PGE2的釋放(P<0.01)，且均表現(xiàn)出劑量依賴性；二氫槲皮素高中低劑量組和二氫楊梅素高中低劑量組均能有效降低IL-1β、IL-6、TNF-α基因的表達(dá)，同時能夠降低脂多糖誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。二氫槲皮素和二氫楊梅素均具有良好的體外抗炎作用，且二氫槲皮素的抗炎作用較好。

二氫槲皮素；二氫楊梅素；RAW264.7細(xì)胞；炎癥

二氫槲皮素和二氫楊梅素是兩種典型的類黃酮化合物，它們有相似的母體結(jié)構(gòu)，其差別僅為B環(huán)5’位上是否存在酚羥基。它們的結(jié)構(gòu)如圖1所示。目前，體外抗炎作用一般多以脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為模型，然后通過測定用藥前后炎癥因子含量的變化以及相關(guān)基因的表達(dá)量研究藥物的抗炎活性。有研究表明[1-3]，二氫槲皮素(taxifolin, TF)和二氫楊梅素(Dihydromyricetin, DMY)均具有抗炎活性，對一些炎癥模型均體現(xiàn)出良好的抗炎效果。但目前就市場價格，二氫槲皮素非常昂貴，是二氫楊梅素的10倍，本實(shí)驗(yàn)以二氫槲皮素和二氫楊梅素作為研究對象，將兩種類黃酮化合物的抗炎活性進(jìn)行對比研究，旨在為抗炎藥物的開發(fā)利用提供依據(jù)。

圖1 二氫楊梅素和二氫槲皮素化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法

1.1 材料 二氫槲皮素(TF) HPLC>97%，實(shí)驗(yàn)室自制；二氫楊梅素(DMY),HPLC>98%，批號：K140511, 西安開來生物工程有限公司。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.2 試劑及儀器 地塞米松(Dexamethasone，DXM)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS), Sigma；二甲基噻唑(MTT)， Amresco；二甲基亞砜(DMSO)，Sigma；青鏈雙抗，Gibco；DMEM高糖培養(yǎng)基，hyclone；小牛血清，hyclone；小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，小鼠白介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，小鼠白介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，小鼠前列腺素E2(PGE2)酶聯(lián)免疫試劑盒均購自R&D公司；蒸餾水(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))。

美國Costar 6孔和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板; 美國Forma Scientific CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱; 倒置顯微鏡(Olympas); 北京六一電泳儀；美國BIORAD 凝膠成像儀；美國SBP PCR儀；Haier -70 ℃低溫冰箱；美國Thermo Electron MK3型酶標(biāo)儀。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中, 內(nèi)含10%滅活新生小牛血清及100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素, 置于37 ℃、5.0% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 MTT法測定二氫槲皮素和二氫楊梅素毒性 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞至離心管內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個細(xì)胞/mL，以100 μL/孔的量鋪至96孔板中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，加入含不同濃度的TF(2.5,5,10,20,40 μg/mL)和DMY(2.5,5,10,20,40 μg/mL)DEME高糖培養(yǎng)液，每孔100 μL，空白組加入等體積的DMEM高糖培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，每孔各做三個平行孔。在終止細(xì)胞培養(yǎng)前4 h，加入20 μL/孔MTT(5 mg/mL)。終止細(xì)胞培養(yǎng)后，輕輕吸去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，震蕩5 min，待甲瓚充分溶解，用酶標(biāo)儀測定570 nm處的各孔吸光度，相對于空白組計算細(xì)胞存活率。

1.5 ELISA法檢測RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子(TNF-α，IL-6和IL-1β)和PGE2的水平 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞至離心管內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個細(xì)胞/mL，以500 μL/孔的量鋪至24孔板中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為9組，即空白對照組，LPS模型組，陽性對照組，TF高、中、低劑量組和DMY高、中、低劑量組，每組設(shè)三個平行組。棄上清，空白對照組和LPS對照組加入DMEM培養(yǎng)液，陽性對照組加入含DXM的DEME高糖培養(yǎng)液250 μL，給藥組分別加入含不同濃度的TF和DMY的DEME高糖培養(yǎng)液250 μL，干預(yù)2 h，向空白對照組加入DMEM高糖培養(yǎng)基，其余組加入含1 mg/L LPS的DEME高糖培養(yǎng)液250 μL，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束時，吸取細(xì)胞上清液，上清液按照TNF-α，IL-6，IL-1β和PGE2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書測定其中TNF-α，IL-6，IL-1β和PGE2的水平。

1.6 NO的檢測 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞至離心管內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個細(xì)胞/mL，以500 μL/孔的量鋪至24孔板中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為9組，即空白對照組，LPS模型組，陽性對照組，TF高、中、低劑量組和DMY高、中、低劑量組。棄上清，空白對照組和LPS對照組加入DMEM培養(yǎng)液，陽性對照組加入含DXM的DEME高糖培養(yǎng)液250 μL，給藥組分別加入含不同濃度的TF和DMY的DEME高糖培養(yǎng)液250 μL，干預(yù)2 h，向空白對照組加入DMEM高糖培養(yǎng)基，其余組加入含1 mg/L LPS的DEME高糖培養(yǎng)液250 μL，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束時，吸取培養(yǎng)液100 μL于另一96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔各加入100 μL Griess reagent 試劑(1% sulfanilamide 和0.1% N-[1-naphthyl]- ethylenediamine dihydrochloride in 5% phosphoric acid)，室溫避光放置10 min，于540 nm處測定OD值。

1.7 RT-PCR檢測TNF-α，IL-6，IL-1β mRNA的表達(dá) 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞至離心管內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個細(xì)胞/mL，將細(xì)胞以2 mL/孔的量接種于6孔板中，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄除培養(yǎng)液，空白對照組和LPS對照組加入DMEM培養(yǎng)液，陽性對照組加入含DXM的DEME高糖培養(yǎng)液2 mL，給藥組分別加入含不同濃度的TF和DMY的DEME高糖培養(yǎng)液2 mL，干預(yù)2 h，向空白對照組加入DMEM高糖培養(yǎng)基，其余組加入含1 mg/L LPS的DEME高糖培養(yǎng)液2 mL，培養(yǎng)24 h。去除細(xì)胞上清液，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，然后利用高純總RNA快速提取試劑盒提取細(xì)胞中RNA,取1 μg總RNA配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板利用Bio Teke super RT Kit試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)中使用的引物序列如表1所示。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，運(yùn)用數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，成像觀察。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 二氫槲皮素及二氫楊梅素的細(xì)胞毒性評價 選取藥物濃度為2.5～40 μg/mL的二氫槲皮素和二氫楊梅素分別作用于RAW264.7細(xì)胞24 h，采用MTT法測得不同濃度的TF和DMY對小鼠RAW264.7細(xì)胞是否具有毒性作用，從而確定使用劑量。如圖2所示，藥物濃度在2.5～20 μg/mL內(nèi)的TF組和DMY組與空白組相比，細(xì)胞活力沒有顯著差異(P>0.05)，結(jié)果表明TF在2.5～20 μg/mL，DMY在2.5～20 μg/mL范圍內(nèi)對小鼠RAW264.7細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用。

圖2 TF和DMY對小鼠RAW264.8細(xì)胞活力的影響(*P<0.05，**P<0.01與空白對照組比較)

2.2 TF和DMY對LPS刺激的小鼠RAW264.7細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)NO、PGE2的影響 由表2可知，LPS模型組NO、PGE2含量與空白組相比均顯著升高。TF和DMY各劑量組對LPS刺激的小鼠RAW264.7細(xì)胞釋放NO、PGE2均具有不同程度的抑制作用，且呈劑量依賴性關(guān)系。TF高劑量組的NO含量與陽性對照組相比無顯著性差異。

表2 TF和DMY對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)NO、PGE2的影響

注：##P<0.01與空白對照組比較；**P<0.01與LPS組比較；△△P<0.01與陽性對照組比較

2.3 TF和DMY對LPS刺激的小鼠RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(TNF-α，IL-6和IL-1β)的影響 與空白對照組相比，LPS模型組細(xì)胞因子含量均顯著升高。與LPS模型組相比，TF和DMY各劑量組對炎癥模型細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量均顯著性降低，并且隨著藥物濃度的升高，分泌的水平逐漸降低，呈劑量依賴性關(guān)系。TF高劑量組的細(xì)胞因子IL-6含量，與陽性對照組相比無顯著性差異(表3)。

表3 TF和DMY對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的影響

##P<0.01與空白對照組比較；**P<0.01與LPS組比較；△P<0.05、△△P<0.01與陽性對照組比較

2.4 TF和DMY對LPS刺激的小鼠RAW264.7細(xì)胞基因TNF-α，IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明(圖3)，LPS構(gòu)建巨噬細(xì)胞驗(yàn)證模型導(dǎo)致細(xì)胞中TNF-α，IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)量提高，由于這三種細(xì)胞因子是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵標(biāo)志物，因此通過PCR鑒定驗(yàn)證成功構(gòu)建了炎癥模型。地塞米松通過抑制細(xì)胞因子TNF-α，IL-6和IL-1β 基因的表達(dá)而表現(xiàn)出了對炎癥反應(yīng)的抑制作用。相比之下，二氫槲皮素高中低劑量組和二氫楊梅素高中低劑量組對TNF-α，IL-6和IL-1β基因表達(dá)也分別表現(xiàn)出了不同的抑制作用，其中二氫槲皮素高劑量組對三種細(xì)胞因子的基因表達(dá)量的抑制作用最為明顯。

A:空白對照組 B：LPS模型組 C：陽性對照組 D～E：二氫槲皮素低劑量組(5mg/L)、中劑量組(10 mg/L)、高劑量組(20 mg/L) G～I(xiàn):二氫楊梅素低劑量組(5 mg/L)、中劑量組(10 mg/L)、高劑量組(20 mg/L)圖3 TF和DMY對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞基因TNF-α，IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)的影響

3 討論與小結(jié)

炎癥是指機(jī)體受到了自身及外界損害或者處于應(yīng)激狀態(tài)時，呈現(xiàn)的以快速動力循環(huán)、快速代謝反應(yīng)為特征的生理及病理過程。在多數(shù)的細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)中常用脂多糖誘導(dǎo)炎癥發(fā)生[4-7]。巨噬細(xì)胞會在炎癥啟動的過程中通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，釋放具有生物活性的酯類介質(zhì)、細(xì)胞因子及活性氧等炎癥介質(zhì)起著至關(guān)重要的作用[8-9]。

3.1 二氫槲皮素及二氫楊梅素的細(xì)胞毒性評價 本實(shí)驗(yàn)以脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞為模型，將二氫槲皮素和二氫楊梅素的體外抗炎活性進(jìn)行對比。首先采用MTT法檢測了二氫槲皮素和二氫楊梅素對小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性影響。結(jié)果顯示，藥物濃度在2.5～20 μg/mL內(nèi)的二氫槲皮素組和二氫楊梅素組與空白組相比，細(xì)胞活力沒有顯著差異(P>0.05)，結(jié)果表明二氫槲皮素在2.5～20 μg/mL，二氫楊梅素在2.5～20 μg/mL范圍內(nèi)對小鼠RAW264.7細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用。有研究證實(shí)，醫(yī)學(xué)上將選擇性調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)水平的方法用于炎癥疾病治療[10-11]，因而只要可以增加抗炎細(xì)胞因子分泌或抑制促炎細(xì)胞因子表達(dá)的藥物均可用于治療炎性疾病。

3.2 二氫槲皮素及二氫楊梅素對炎癥介質(zhì)的影響 在炎癥發(fā)生的過程中，參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，具有調(diào)節(jié)作用的內(nèi)源性化學(xué)因子稱為炎癥介質(zhì)。在這些炎癥介質(zhì)中，有兩種主要的炎癥介質(zhì)共同參與了機(jī)體的抗炎反應(yīng)，即NO和PGE2。一氧化氮(NO)主要是由誘生性一氧化氮合酶(iNOS)催化生成的，當(dāng)機(jī)體受到某些因素(TNF、LPS等)刺激時，iNOS蛋白大量合成，導(dǎo)致大量NO釋放，從而對機(jī)體產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥和急慢性炎癥的發(fā)生都與NO有關(guān)[12-13]，而極微量的PGE2就可以對機(jī)體引發(fā)炎性反應(yīng)[14-16]。本實(shí)驗(yàn)通過對細(xì)胞培養(yǎng)液中NO和PGE2的含量檢測發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比，LPS對照組NO和PGE2分泌量顯著增加；與LPS對照組相比，二氫槲皮素和二氫楊梅素各劑量組對LPS刺激的小鼠RAW264.7細(xì)胞釋放NO和PGE2均具有不同程度的抑制作用，且呈劑量依賴性關(guān)系。因此可推想二氫槲皮素和二氫楊梅素的抗炎作用大概與其抑制PGE2和NO的合成相關(guān)。

3.3 二氫槲皮素及二氫楊梅素對炎癥因子的影響 當(dāng)機(jī)體被LPS刺激后，體內(nèi)巨噬細(xì)胞會分泌出大量細(xì)胞因子。其中抗炎因子TNF-α在整個炎癥反應(yīng)進(jìn)程中起到最為關(guān)鍵的作用。TNF-α可以誘導(dǎo)IL-6、IL-1β等細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放[17-18]，從而啟動細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)[19]，增強(qiáng)血管通透性。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)作為IL-1基因家族的一員，可由LPS刺激直接產(chǎn)生，也可以通過TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生，是一種具有廣泛調(diào)節(jié)作用的促炎因子，誘導(dǎo)TNF、IL-6及其自身分泌，并同TNF互相促進(jìn)彼此釋放。此外，LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的發(fā)熱反應(yīng)與炎癥的主要誘發(fā)者IL-6有密切關(guān)系。當(dāng)機(jī)體因炎癥感染初期，血液中IL-6表達(dá)量一般會相對較高，然而當(dāng)血液中IL-6的表達(dá)量持續(xù)增高，便會對機(jī)體形成重大的損害，如燒傷、器官衰竭等[20]。因此阻斷炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)展的核心就是通過約束這些細(xì)胞因子的過度表達(dá)，恢復(fù)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的平衡狀態(tài)。通過對細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子含量的檢測結(jié)果顯示，當(dāng)小鼠RAW264.7細(xì)胞被LPS刺激后， LPS組的TNF-α、IL-6和IL-1β的含量與空白對照組相比顯著升高，說明體外炎癥模型造模成功。與LPS模型組相比，TF和DMY各劑量組對炎癥模型細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量均顯著性降低，并且隨著藥物濃度的升高，分泌的水平逐漸降低，呈劑量依賴性關(guān)系。TF高劑量組的細(xì)胞因子IL-6含量，與陽性對照組相比無顯著性差異。結(jié)果表明，二氫槲皮素和二氫楊梅素可以通過抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放起到抗炎作用。

綜上所述，二氫槲皮素和二氫楊梅素均可呈劑量依賴性的抑制LPS刺激的小鼠RAW264.7細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)NO、PGE2，并且降低IL-1β、IL-6、TNF-α基因的表達(dá)，阻礙分泌細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α，起到抗炎作用。通過對比發(fā)現(xiàn)，二氫槲皮素比二氫楊梅素抗炎活性更好，但對它們的抗炎的作用機(jī)理需要進(jìn)行更加深入的研究，從而為抗炎藥物的開發(fā)利用提供依據(jù)。

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(編輯：侯向輝)

Comparison of Anti-inflammatory Activity of Dihydroquercetin and Dihydromyricetin

WANG Jia-qi, CHEN Kai, WANG Yue-liang, LI Ying, LIU Yi-tong, GAO Ming-tong,LI Jing-yu, DING Chuan-bo, SONG Ming-ming, LIU Wen-cong*

(CollegeofTraditionalChineseMedicine,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

Construction of macrophages to validate the model, comparative study dihydroquercetin(also known as taxifolin, TF) and dihydromyricetin(DMY)invitroanti-inflammatory activity was made. To 1 mg/L lip polysaccharide (LPS) - induced RAW264.7 macrophagesinvitromodel of inflammation was established；Cell viability was detected by the cytotoxicity test (MTT) method；Griess reagent method was used to determine the amount of NO released from cell supernatant；The content of cytokine IL-1β, IL-6, TNF-α and PGE2in supernatant was detected by ELISA assay; Gene expression were detected with the methods of RT-PCR. TF and DMY 2.5～20 μg/mL showed no cytotoxicity on macrophages of RAW264.7. Meanwhile, TF high, medium and low dose group and DMY high, medium and low dose group significantly inhibited LPS-induced cells to release of NO and PGE2(P<0.01), and showed a dose-dependent manner; TF high, medium and low dose group and DMY high, medium and low dose group could effectively reduce IL-1β, IL-6, TNF-α gene expression, while reducing LPS-induced cells to produce cytokines levels. Dihydroquercetin and DMY have good anti-inflammatory effectsinvitroand anti-inflammatory effect of TF was better.

dihydroquercetin; dihydromyricetin; RAW264.7 cells; inflammation

科技型中小企業(yè)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項目(20160308002YY)

王佳奇，碩士研究生，從事中藥新藥研究與開發(fā)。

劉文叢。E-mail：jwlw6803@126.com

2016-05-13

A

1002-1280 (2016) 07-0046-07

S859.796