王貴華，于萍萍，滿坤，吳珊珊，劉明明，孟萌，趙亞榮*

(1. 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司動物醫(yī)學(xué)研究中心，北京100195；2. 北京市畜禽生物制品工程技術(shù)研究中心，北京100195)

五株豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及序列分析

王貴華1,2，于萍萍1,2，滿坤1,2，吳珊珊1,2，劉明明1,2，孟萌1,2，趙亞榮1,2*

(1. 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司動物醫(yī)學(xué)研究中心，北京100195；2. 北京市畜禽生物制品工程技術(shù)研究中心，北京100195)

為研究豬流行性腹瀉病毒的流行情況并分析該病毒的培養(yǎng)特性，對甘肅、北京、河北、山西、浙江五個豬場送檢的疑似豬流行性腹瀉病豬小腸內(nèi)容物，用RT-PCR方法進(jìn)行檢測，證明為豬流行性腹瀉病毒核酸陽性。然后將陽性病料進(jìn)行傳代培養(yǎng)、病毒含量測定以及特異性檢驗(yàn)，證明獲得五株豬流行性腹瀉病毒，分別命名為Ningxia9、Beijing5、Gaocheng8、Shanxi1、Zhejiang08。對分離的毒株進(jìn)行S基因全長測序及氨基酸序列分析。結(jié)果表明：五株分離毒株在盲傳19代開始出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，盲傳到24代，出現(xiàn)穩(wěn)定的細(xì)胞病變且五株分離毒株的24代病毒含量在104.5～5.0TCID50/mL之間；用S蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析表明，五株分離毒株與近年來國內(nèi)流行毒株親緣關(guān)系很近，在同一個進(jìn)化分支上；分離的五株野毒株之間的氨基酸同源性高達(dá)99.2%～99.9%，而這五株野毒與GenBank上提交的2011年、2012年分離的野毒株的之間的氨基酸同源性為98.4%～99.9%；實(shí)驗(yàn)室分離毒株及國內(nèi)近年流行毒株均與國內(nèi)外經(jīng)典毒株存在一定的共性，即特定位置氨基酸的插入、缺失或置換。

豬流行性腹瀉病毒；分離鑒定；序列分析

豬流行性腹瀉病毒( porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 為豬的一種冠狀病毒，可引起豬的急性、高度接觸性腸道傳染病豬流行性腹瀉( porcine epidemic diarrhea, PED)。該病主要特征為脫水、嘔吐和腹瀉。各種年齡和品種的豬均易感，尤其是對哺乳仔豬危害最為嚴(yán)重，發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率為30%～80%，是導(dǎo)致仔豬早期死亡的主要疾病之一[1-2]。1971年英國首次報(bào)道了本病，隨后在日本、德國和比利時等許多國家均有報(bào)道，我國1976年首次報(bào)道[3]，2013年美國爆發(fā)疫情，2014年德國、加拿大報(bào)道了PED的流行[4-5]，目前該病已經(jīng)成為影響?zhàn)B豬業(yè)的重要腹瀉病之一。

PEDV為單股正鏈RNA病毒，S糖蛋白位于病毒粒子表面，在刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體過程中發(fā)揮重要作用，其中的S1結(jié)構(gòu)域包含主要中和抗原表位[6-7]。S基因序列分析發(fā)現(xiàn)，在不同地區(qū)不同時間分離的毒株之間變異都很大，近幾年的流行毒株和2010年以前的毒株以及傳統(tǒng)疫苗毒株的差異主要存在于S基因[8]，因此S基因是分析PEDV流行毒株的遺傳變異和流行特點(diǎn)的主要切入點(diǎn)。

本研究對甘肅、北京、河北、山西、浙江五個豬場疑似豬流行性腹瀉病豬采集小腸內(nèi)容物，RT-PCR方法進(jìn)行檢測確定為豬流行性腹瀉病毒感染。采用細(xì)胞培養(yǎng)法分離五株豬流行性腹瀉病毒，通過對S基因序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明該分離株與國內(nèi)當(dāng)前流行株同源性很高，為進(jìn)一步疫苗的研究和豬流行性腹瀉的防控奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 病料 疑似豬流行性腹瀉病豬小腸內(nèi)容物，收集于甘肅、北京、河北、山西、浙江五個地方豬場。

1.2 細(xì)胞和培養(yǎng)基 Vero細(xì)胞由北京大北農(nóng)集團(tuán)動物醫(yī)學(xué)研究中心保管和供應(yīng)，DMEM購自Hyclone公司。

1.3 主要試劑 PCR反應(yīng)用試劑、DNA Marker、RNA 提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、T載體等購自天根生化公司；胎牛血清和胰蛋白酶均購自GIBCO公司；PEDV特異性血清由大北農(nóng)集團(tuán)動物醫(yī)學(xué)研究中心制備。

1.4 引物合成和基因測序 由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 方法

2.1 病料的處理 取病豬小腸適量，刮取腸粘膜和內(nèi)容物，充分研磨，按照1︰5的比例(重量︰體積)加入PBS，混勻，反復(fù)凍融3次，離心取上清，0.22 μm濾膜過濾，濾液分裝備用。

2.2 RT-PCR檢測 將病料進(jìn)行RT-PCR檢測，根據(jù)病毒S蛋白編碼基因的序列設(shè)計(jì)引物：正向引物為5’-GGATACTTTGGCCTCTTGTG-3’;反向引物5’-CGCACTCGGATTACTCACAGC-3’。 PEDV預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為484 bp。取處理好的病料上清液，按照QIAamp柱式RNA提取試劑盒(Qiagen)提取RNA。用M-MLV合成cDNA，總反應(yīng)體系20 μL：RNA 3 μg、Oligo(dT)18 Primer (10 μmol/L) 0.5 μL、dNTPs1 μL、5×First-Stand Buffer 4 μL、RNAsin 0.5 μL、M-MLV 0.5 μL、RNase-free Water補(bǔ)足至20 μL。輕輕混勻，37 ℃水浴60 min，95 ℃水浴5 min后，立即冰浴。以cDNA為模板，建立50 μL PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL、dNTPs 2 μL、正向引物1 μL、反向引物1μL、cDNA2 μL、Taq酶0.5 μL、ddH2O補(bǔ)足至50 μL。將PCR反應(yīng)體系置PCR儀內(nèi)，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 45 s、50 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min進(jìn)行32個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1% 瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測。

2.3 接種細(xì)胞和傳代 取長滿單層的Vero細(xì)胞，用pH7.4的PBS洗三次，按照10%的比例接種上述處理物，添加胰蛋白酶至終濃度10 μg/mL，37 ℃吸附1 h，然后加入含終濃度10 μg/mL胰蛋白酶的無血清DMEM維持液，37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察，若無CPE則72 h收獲，反復(fù)凍融3次后按上述方法傳代。如此操作盲傳，觀察是否產(chǎn)生CPE。同時設(shè)置空白細(xì)胞作為對照。

2.4 病毒含量測定 將分離毒株第24代毒用細(xì)胞維持液進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7四個稀釋度，每個稀釋度分別接種長滿Vero細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板6孔，100 μL/孔，同時設(shè)陰性對照細(xì)胞6孔，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72～120 h，觀察細(xì)胞病變，細(xì)胞顆粒增多、圓縮、細(xì)胞破損、脫落判為感染。同時陰性對照組細(xì)胞孔應(yīng)不出現(xiàn)細(xì)胞病變。采用Reed-Muench法，計(jì)算TCID50。

2.5 病毒的特異性檢驗(yàn) 將第24代毒用DMEM液稀釋至103.0TCID50/mL與等量的PEDV特異性血清混合，置37 ℃中和1 h，接種長滿Vero細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板4孔，同時設(shè)不中和的病毒陽性對照細(xì)胞4孔和僅接種細(xì)胞維持液的陰性對照細(xì)胞4孔，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72～120 h，觀察細(xì)胞病變，中和組和陰性對照組均應(yīng)不出現(xiàn)細(xì)胞病變，而病毒對照組應(yīng)出現(xiàn)細(xì)胞病變。

2.6 S基因序列分析 參照GenBank中的PEDV-S基因序列設(shè)計(jì)三對特異性引物。S1-p1：5′-GTTGAAGAATGGTAAGTTGCTAG-3′；S1-p2：5′-ATAAAGAATACGCTGAATGGC-3′；

S2-p1：5′- GGCACTGACGATGACGTTTC-3′；S2-p2：5′-CCATTAGAACAGCGCTTATAGTCT-3′；S3-p1：5′-TTTTTAATAAAGTGGTTACTAATGG-3′；S3-p2：5′-CTGTGTCAATCGTGTATTGAAAAAG-3′。

按照2.2的方法分別提取五株分離毒株24代病毒的RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR，S1片段PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 50 s 、52 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min進(jìn)行32個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。S2片段PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 50 s 、50 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min進(jìn)行32個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。S3片段PCR反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 50 s、54 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，進(jìn)行32個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳和回收后連接到T載體進(jìn)行測序分析，對S1、S2、S3序列進(jìn)行拼接，將拼接完全的S基因進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)，并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析和序列比對。

3 結(jié)果

3.1 RT-PCR檢測結(jié)果 將病料提取物進(jìn)行RT-PCR檢測，擴(kuò)增S基因片段為484 bp，結(jié)果見圖1。

M：DNA Marker；1-5：樣品；6：陰性對照圖1 病料中PEDV的RT-PCR檢測結(jié)果

3.2 病毒的分離培養(yǎng)結(jié)果 將上述樣品處理后接種于Vero細(xì)胞，經(jīng)過19代盲傳后開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，再繼續(xù)傳5代以后，細(xì)胞病變出現(xiàn)時間和病變類型基本穩(wěn)定，約在接種后48-52 h出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞顆粒增多，圓縮，細(xì)胞破損，脫落(圖2)。

3.3 病毒含量測定 將第24代病毒進(jìn)行病毒含量測定，Ningxia9為104.5TCID50/mL，Beijing5為104.75TCID50/mL，Gaocheng8為105.0TCID50/mL，Shanxi1為104.5TCID50/mL，Zhejiang08為105.0TCID50/mL。

3.4 病毒的特異性檢驗(yàn) 病毒中和試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的PEDV具有特異性，病毒被特異性血清中和后接種細(xì)胞沒有出現(xiàn)CPE，陰性對照也沒有出現(xiàn)CPE，接種病毒組細(xì)胞出現(xiàn)典型的CPE。3.5 S基因序列分析結(jié)果 五株分離毒株24代病毒的S蛋白全長氨基酸序列進(jìn)化樹分析結(jié)果見圖3。

A-E：5個分離株；F：陰性對照圖2 豬流行性腹瀉病毒病變圖(400×)

圖3 S蛋白全長氨基酸序列進(jìn)化樹分析

PEDV主要分為三個進(jìn)化群，群Ⅰ由本實(shí)驗(yàn)室分離的五株野毒株(Ningxia9、Beijing5、Gaocheng8、Shanxi1、Zhejiang08)以及2011年腹瀉病爆發(fā)后各大高校和科研院所分別于2011年、2012年分離的野毒株(HB-2012-4、HB-2012-1、BJ-2011-1、BJ-2011-2、BJ-2011-3、GD-B、CH17-GZ、CH-SDLY-2011、ZMDZY-2011、ZB)組成；群Ⅱ主要由國內(nèi)外經(jīng)典毒株組成，包括中國2004年到2007年分離毒株(DX、LJB-03、JS-2004-2、LZC、CH-S)，韓國毒株(Parent DR13、attenuated DR13)，比利時毒株(CV777)，法國毒株(Brl-87)，日本毒株(MK、83P-5)；群Ⅲ由一株韓國分離株(Chinju99)和兩株日本分離株(KH、NK)組成。

根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)化樹結(jié)果將群Ⅰ中本實(shí)驗(yàn)室分離的五株野毒株以及GenBank上提交的2011年、2012年分離的五個野毒株(HB-2012-4、HB-2012-1、BJ-2011-1、BJ-2011-2、BJ-2011-3)與群Ⅱ中國內(nèi)外經(jīng)典毒株(attenuated CV777、attenuated DR13、CV777、Parent DR13、DX、LJB-03、JS-2004-2、LZC)的全長S蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對分析，采用ClustalW法比對，有如下結(jié)果：實(shí)驗(yàn)室分離的五株野毒株Ningxia9、Beijing5、Gaocheng8、Shanxi1、Zhejiang08之間的氨基酸同源性高達(dá)99.2%～99.9%，而這五株野毒與GenBank上提交的2011年、2012年分離的野毒株之間的氨基酸同源性為98.4%～99.9%，其中BJ-2011-2與Beijing5、Shanxi1、Gaocheng8之間的氨基酸同源性稍低,分別為98.5%、98.8%、98.7%，CH-ZMDZY-2011與本實(shí)驗(yàn)室分離的五株野毒同源性也較低為98.4%～99.1%，說明本實(shí)驗(yàn)分離的野毒株與2011年腹瀉大流行的毒株具有很高的同源性(表1)。

表1 群Ⅰ中流行毒株與群Ⅱ中國內(nèi)外經(jīng)典毒株之間S蛋白氨基酸序列比較

群Ⅰ中的十個毒株與群Ⅱ中的國內(nèi)外經(jīng)典毒株，無論是野毒株還是疫苗株，氨基酸序列變化存在如下共性：存在兩個部位的氨基酸插入，一個是位于59～62aa位，插入了QGVN四個氨基酸，另一個是位于140 aa位，插入了N一個氨基酸；存在一個部位氨基酸的缺失,位于163～164位的兩個氨基酸缺失，N(D)I(T)；存在26處氨基酸置換，氨基酸置換個數(shù)由1個到5個不等(圖4、表2)。

4 討論

PEDV對細(xì)胞、培養(yǎng)條件的要求較高，自20世紀(jì)70年代報(bào)道以來，直到1988年Hoffman等通過在培養(yǎng)基中添加胰酶的方法才首次利用細(xì)胞培養(yǎng)方法成功分離到一株P(guān)EDV[9]，此后陸續(xù)有采用相同的方法成功分離到PEDV的報(bào)道[10-11]。本研究參考國內(nèi)外文獻(xiàn)，在維持液中加入終濃度10 μg/mL的胰蛋白酶，利用Vero細(xì)胞成功分離到五株P(guān)EDV。

已知PEDV為冠狀病毒，可將其S蛋白人為劃分為S1區(qū)(1～789aa)和S2區(qū)(790～1387aa)。其中，S1區(qū)為主要的抗原表位存在區(qū)[12-13]，序列分析表明26處置換全位于S1蛋白氨基酸序列之中，主要位于前369 aa中，且氨基酸的插入和缺失也位于該區(qū)域中。位于中和抗原表位83～276 aa處的的替換有19處；位于線性表位248～280為2處。

表2 群Ⅰ中變異毒株與群Ⅱ中國內(nèi)外經(jīng)典毒株之間S蛋白全長的氨基酸差異

變異情況氨基酸個數(shù)氨基酸變化位置替換3QST→SAN27～294SMNS→IGEN55～581S→T645GTGIE→AGQHP68～721L→V821Y→H842DS→RG86～871Q→H891I→T1202DN→SI130～1311V→A1383DGK→EHS161～1621A→S1791H→Y1841I(L)→F1871R→K1973K(R)RS→SGG201～2031T→E2111Y→S2281E→Q2301S(T)→I2382DS→EP247～2481L→V2711M→I3051L→F3471T→I369插入4QGVN59～621N140缺失2N(D)I(T)163～164

冠狀病毒S1基因的變化能體現(xiàn)病毒的變異情況。由氨基酸序列比對分析表明流行毒株的氨基酸序列變化主要存在于S1區(qū)，氨基酸序列的變化有可能是導(dǎo)致病毒變異的原因[14-17]。S基因氨基酸進(jìn)化樹分析表明，本實(shí)驗(yàn)室分離的五株豬流行性腹瀉病毒株與國內(nèi)當(dāng)前流行株同源性很高，將其致弱作為候選疫苗株，對于豬流行性腹瀉防控具有重要的實(shí)踐意義。

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(編輯：李文平)

Isolation and Identification of Five Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strains and Sequence Analysis

WANG Gui-hua1,2, YU Ping-ping1,2, MAN Kun1,2, WU Shan-shan1,2,LIU Ming-ming1,2, MENG Meng1,2, ZHAO Ya-rong1,2*

(1.VeterinaryMedicineResearchCentreofBeijingDaBeiNongGroup,Beijing100195,China;2.BeijingEngineeringResearchCenterofBiologicalproductsinLivestockandPoultry,Beijing100195,China)

In order to research epidemiology and culture specificity of porcine epidemic diarrhea virus(PEDV), five feces samples from piglets suffering severe diarrhea in farms from Gansu, Beijing, Hebei, Shanxi and Zhejiang, were confirmed as PEDV positive by RT-PCR. Then these five samples were cultured by vero cell line to 24 passages, the five cultures were titrated and sequenced full long of S gene. Results showed that cytopathic effect (CPE) appeared from 19thto 24thpassages, and virus titer were between 104.5～5.0TCID50/mL.Sequence analysis showed that the amino acid homology was 99.2%～99.2%among five wild strains, 98.4%～99.9% among these five strains and the wild strains on GenBank from 2011 to 2012. Furthermore, the isolates, domestic pandemic strains and classic strains had certain commonality such as specific amino acid insertions and deletions or replacement.

porcine epidemic diarrhea virus; isolation and identification；sequence analysis

王貴華，博士，從事動物疫苗與診斷制品研究。

趙亞榮。E-mail: zhaoyarong@live.cn

2015-04-18

A

1002-1280 (2016) 07-0013-07

S852.65