農(nóng)　峰，藍(lán)常貢(審校)，廖林波

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，百色，533000)

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文獻(xiàn)綜述

siRNA技術(shù)誘導(dǎo)基因沉默在骨科疾病中的研究進(jìn)展

農(nóng)峰，藍(lán)常貢(審校)▲，廖林波

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，百色，533000)

【關(guān)鍵詞】RNAi；siRNA；基因；骨科疾病

自從1998年Fire等[1]證實(shí)Guo等[2]發(fā)現(xiàn)的正義RNA抑制同源基因表達(dá)的現(xiàn)象為RNA干擾(RNA interference，RNAi)以來(lái)，RNAi技術(shù)經(jīng)歷了一個(gè)迅速發(fā)展的過(guò)程。RNAi技術(shù)是利用雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)降解細(xì)胞內(nèi)同源信使RNA(messenger RNA,mRNA)，從而阻斷特定基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型[3]，具有高效、特異地沉默目的基因的特點(diǎn)[4]，其種類包括：小干擾RNA(Small Interfering RNAs,siRNA)、微小RNA(Micro RNAs，miRNA)和短發(fā)夾RNA(Short Hairpin RNAs,shRNA)。目前，RNAi技術(shù)已被視為分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重大突破?；赗NAi技術(shù)的性質(zhì)特點(diǎn)及作用，其已被廣泛應(yīng)用于腫瘤[5]、抗病毒[6]以及遺傳性疾病[7]等研究中。盡管RNAi技術(shù)用于骨科疾病的研究尚處于初步階段，但已經(jīng)取得了一定的進(jìn)步。筆者就近年來(lái)siRNA技術(shù)誘導(dǎo)基因沉默在相關(guān)骨科疾病(比如骨關(guān)節(jié)炎、骨肉瘤、骨質(zhì)疏松癥和股骨頭缺血性壞死)應(yīng)用方面的研究作一綜述。

1siRNA 技術(shù)在骨關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種最常見(jiàn)的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，可引起患者的關(guān)節(jié)活動(dòng)受限。隨著年齡的增長(zhǎng)，OA的發(fā)病率會(huì)逐漸增加。然而，OA在發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中所涉及的確切分子機(jī)制尚未闡明。研究表明[8，9]，OA的病因是多因素的，包括遺傳易感性、老化、肥胖、關(guān)節(jié)畸形或關(guān)節(jié)損傷等。針對(duì)嚴(yán)重OA的治療，目前除了全關(guān)節(jié)置換手術(shù)外，尚未發(fā)現(xiàn)明顯有效的干預(yù)措施來(lái)減緩OA的進(jìn)展或延緩軟骨的退化。隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，RNAi技術(shù)能靶向目的基因的表達(dá)。根據(jù)RNA干擾技術(shù)的獨(dú)特性質(zhì)，其已作為一種有效的工具，被廣泛應(yīng)用于OA的研究中。缺氧誘導(dǎo)因子-2α(hypoxia-inducible factor-2α,Hif-2α)是一種調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨代謝的因子，由EPAS1基因編碼生成。最近的研究表明[10]，在OA患者中，Hif-2α呈現(xiàn)出顯著的高表達(dá)狀態(tài)，與Muraki等[11]研究結(jié)果相一致。這表明，Hif-2α在OA的發(fā)生及發(fā)展中可能扮演重要的作用。Pi等[12]通過(guò)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切除術(shù)(ACLT)構(gòu)建小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型，單純向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射攜帶Hif-2α siRNA的靶向軟骨細(xì)胞納米顆粒發(fā)現(xiàn)，siRNA可下調(diào)包括Hif-2α在內(nèi)的多種代謝因子，并抑制降解酶的表達(dá)，阻礙關(guān)節(jié)軟骨的退化。這與Jaffe[13]研究結(jié)果相吻合，從而初步表明Hif-2α是誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨退變的重要因子。ADAMTS-5是蛋白多糖酶家族(ADAMTS)中的一員，與關(guān)節(jié)軟骨退變程度呈正相關(guān)[14]。在體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)[15]，抑制ADAMTS-5的表達(dá)能明顯減輕蛋白多糖的降解、丟失，從而起到保護(hù)軟骨旳作用。這說(shuō)明ADAMTS-5在OA的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在鼠類骨關(guān)節(jié)炎模型的研究中發(fā)現(xiàn)[16]，通過(guò)向膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)單純注射慢病毒載體介導(dǎo)的沉默ADAMTS-5基因的siRNA，可引起該基因表達(dá)下調(diào)，從而抑制關(guān)節(jié)軟骨的退變。以上學(xué)者利用Hif-2α和ADAMTS-5對(duì)OA進(jìn)行研究表明，這兩種因子能影響OA發(fā)生的進(jìn)程。但OA是否還存在其他重要基因需要進(jìn)一步研究。因此，構(gòu)建特異的siRNA抑制OA發(fā)生及發(fā)展相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，對(duì)OA的發(fā)生及發(fā)展有一定的抑制或延緩作用。

2siRNA技術(shù)在骨肉瘤中的應(yīng)用

骨肉瘤(Osteosarcoma)是一種最常見(jiàn)的潛在廣泛破壞性的原發(fā)性高度惡性骨腫瘤，其病因及相關(guān)發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前，骨肉瘤的治療僅局限于手術(shù)及手術(shù)前后的化療，雖然這種綜合治療方法在一定程度上能夠改善骨肉瘤患者的狀況，但仍未取得令人滿意的長(zhǎng)遠(yuǎn)效果。骨肉瘤仍然是目前致殘率和死亡率較高的惡性骨腫瘤之一[17]。最近的報(bào)道表明，一些關(guān)鍵基因及分子在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及分化的過(guò)程中起重要的作用，主要包括：脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(AP endonuclease class I,APE-1)、分化抑制因子(Inhibitor of DNA differentiation,Id)、熱休克蛋白75(Heat shock protein 75,HSP75)等。其中，作為惡性腫瘤之一的骨肉瘤，其發(fā)生與DNA修復(fù)相關(guān)酶的基因突變有密切關(guān)系，而APE-1為DNA修復(fù)相關(guān)酶的重要分子。因此，APE-1可能與骨肉瘤的發(fā)生密切相關(guān)。APE-1不僅能夠修復(fù)DNA，而且還可以氧化還原DNA?；贏PE-1這種功能，其可能有望成為治療骨肉瘤的潛在靶點(diǎn)。DAI等[18]在研究轉(zhuǎn)染了AEP-1-siRNA 質(zhì)粒的骨肉瘤細(xì)胞HOS中發(fā)現(xiàn)，13個(gè)miRNA發(fā)生顯著改變。其中，7個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)而其余6個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，發(fā)生顯著變化的13個(gè)miRNA及其靶基因參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，從而初步闡明AEP-1-siRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)miRNA靶基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。Id因子又稱DNA 結(jié)合抑制因子，是螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族中唯一具有抑制細(xì)胞分化、刺激細(xì)胞增殖的負(fù)性作用的因子。Id因子在多種腫瘤中的異常高表達(dá)已經(jīng)得到研究者的廣泛認(rèn)可[19～21]。Id因子在骨肉瘤的形成中呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)[22]。因此，可通過(guò)下調(diào)Id因子的表達(dá)來(lái)抑制骨肉瘤細(xì)胞的增值。有學(xué)者[23]應(yīng)用特異性針對(duì)小鼠 Id1 基因的小干擾 RNA 重組腺病毒(AdsimId1)感染骨肉瘤細(xì)胞K7M2-WT，進(jìn)一步研究 Id1 基因沉默后對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響，并通過(guò)RT-PCR 及 Western Blot 的方法檢測(cè)，結(jié)果顯示重組腺病毒 AdsimId1 感染3 d 后 K7M2-WT 細(xì)胞 Id1 基因 mRNA 及蛋白水平的表達(dá)較非處理組明顯降低，其增殖受到抑制。HSP75-siRNA能夠顯著降低骨肉瘤細(xì)胞HSP75蛋白的表達(dá)，明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移[24]，表明沉默HSP75能有效抑制人骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移。骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因綜合作用的結(jié)果，病理過(guò)程中既有抑癌基因又有促癌基因的作用。從骨肉瘤中發(fā)現(xiàn)更多抑癌基因并作為靶向治療的靶點(diǎn)是目前骨肉瘤基因治療的首選方向。因此，利用RNA干擾技術(shù)靶向目的基因的表達(dá)有望成為骨肉瘤治療的新途徑。

3siRNA技術(shù)在骨質(zhì)疏松癥的應(yīng)用

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨微環(huán)境受損及骨強(qiáng)度降低為特征，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折的全身性骨病[25]。隨著全球老齡人口的增加和人均壽命的延長(zhǎng)，OP的發(fā)病率也逐年上升。由于OP可使患者并發(fā)脆性骨折而導(dǎo)致殘疾，既影響患者的生活質(zhì)量又降低其預(yù)期壽命，給社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已經(jīng)成為危害公共健康的全球性問(wèn)題。因此，OP的預(yù)防與治療亟待解決。目前，OP的病因及發(fā)病機(jī)制尚未清楚，有待深入研究。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在OP的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，骨形成與骨吸收之間的平衡受到一些重要分子的調(diào)控，比如：Dickkopf-1(DDK1)、酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2 interacting protein 1,CKIP-1)。DKK1是DKKs (Dickkopfs) 家族中的一種分泌型糖蛋白，可抑制Wnt信號(hào)通路。原理是：其與Kremen2 結(jié)合形成二聚體，所形成的二聚體再與LRP5/6結(jié)合形成三聚體，使吸附在細(xì)胞膜上的LRP6 內(nèi)陷而脫離Wnt 復(fù)合物，阻斷Wnt信號(hào)通路，從而抑制骨的形成。DDK1與骨代謝疾病[26]及腫瘤[27]發(fā)生密切相關(guān)，在OP患者呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)。劉媛等人[28]針對(duì) DKK1 基因構(gòu)建兩段小干擾 RNA(siRNA) 真核表達(dá)載體來(lái)觀察其對(duì)OP大鼠的治療作用，并應(yīng)用RT-PCR和免疫組化的方法分別檢測(cè)股骨DKK1 mRNA及其蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，治療組大鼠 DKK1-mRNA 及其蛋白的表達(dá)明顯下降。此外，該實(shí)驗(yàn)還通過(guò)測(cè)定股骨骨密度及病理結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)，治療組大鼠股骨有新生骨小梁形成，骨小梁破壞減輕，從而初步闡明DKK1-siRNA 促進(jìn)骨形成， 抑制骨吸收， 減輕骨結(jié)構(gòu)的破壞。CKIP-1作為一種新的骨形成負(fù)調(diào)控因子，在骨細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、分化和凋亡中起關(guān)鍵作用。有研究報(bào)道，CKIP-1與OP有密切關(guān)系[29]。Guo等[30]發(fā)現(xiàn)，不論在體外實(shí)驗(yàn)還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將CKIP-1 siRNA轉(zhuǎn)入成骨細(xì)胞或老鼠體內(nèi)之后，CKIP-1 mRNA及其蛋白的表達(dá)明顯下降。另外，該研究的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，與非處理組相比，處理組的骨量及骨形成標(biāo)記物顯著增高，從而初步表明CKIP-1 siRNA可促進(jìn)成骨分化，刺激骨形成，減少骨量丟失。OP發(fā)生是一個(gè)非常復(fù)雜的變化過(guò)程，從以上研究提示CKIP-1和DDK1只是OP骨代謝過(guò)程中2個(gè)重要的調(diào)控因子，其他關(guān)鍵因子是否也參與了調(diào)控過(guò)程仍需研究探討。因此，siRNA特異性誘導(dǎo)目的基因沉默有望成為治療OP的新思路。

4siRNA技術(shù)在股骨頭缺血性壞死中的應(yīng)用

臨床上，股骨頭缺血性壞死(Osteonecrosis of the femoral head，ONFH)可導(dǎo)致患者髖關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限、跛行等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來(lái)，隨著股骨頭缺血性壞死發(fā)病率的增加，研究者們?cè)絹?lái)越關(guān)注該疾病。由于ONFH的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，這給骨科醫(yī)生對(duì)該疾病的預(yù)防和治療帶來(lái)了極大的困難。最近的研究[31，32]表明，過(guò)氧化物酶體增殖子活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)與ONFH密切相關(guān)，而關(guān)于PPARγsiRNA在ONFH的研究中鮮見(jiàn)。PPARγ是一種能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的成脂轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞發(fā)展的同時(shí)抑制骨的形成。2015年李勁峰等[33]構(gòu)建能夠沉默 PPARγ的PPARγsiRNA和表達(dá) CGRP 的雙基因重組載體，將載體轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)植入兔酒精性O(shè)NFH模型的股骨頭內(nèi)，觀察其對(duì)酒精性股骨頭壞死的預(yù)防效果，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組股骨頭組織內(nèi)PPARγmRNA及其蛋白的表達(dá)比對(duì)照組低，CGRPmRNA及其蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組。初步表明了沉默 PPARγ的PPARγsiRNA和表達(dá) CGRP 的雙基因重組載體能有效阻斷酒精誘導(dǎo)的BMSCs 內(nèi) PPARγ mRNA 和蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的成脂分化，同時(shí)增加了BMSCs 的成骨相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了其成骨分化的能力，從發(fā)病機(jī)制的初始關(guān)鍵環(huán)節(jié)上更高效地預(yù)防酒精性 ONFH 發(fā)生。ONFH的病因較多，環(huán)節(jié)復(fù)雜，酒精可能只是其中一種病因而已。從上述研究結(jié)果顯示PPARγ沉默后能阻斷ONFH的進(jìn)程，是一個(gè)比較理想的基因治療靶點(diǎn)。至于其他原因?qū)е碌腛NFH是否存在同樣的結(jié)果需進(jìn)一步探討。因此，siRNA誘導(dǎo)股骨頭缺血性壞死發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的沉默，對(duì)預(yù)防和治療股骨頭缺血性壞死有重要的應(yīng)用前景。

綜上所述，siRNA誘導(dǎo)目的基因沉默可應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、股骨頭缺血性壞死、骨肉瘤等多種骨科疾病，并取得了一定的成就，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。這只是siRNA對(duì)幾種相關(guān)骨科疾病的初步認(rèn)識(shí)。然而，RNAi技術(shù)尚未完全成熟，并且僅局限應(yīng)用于活體動(dòng)物及細(xì)胞等基礎(chǔ)研究，其相關(guān)藥物還處于臨床驗(yàn)證階段。雖然siRNA藥物真正應(yīng)用于臨床尚需時(shí)日，但隨著RNAi技術(shù)的深入研究，其必將成為治療更多骨科疾病或其他系統(tǒng)疾病的新工具。

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(編輯：梁明佩)

(收稿日期：2016-03-08修回日期：2016-04-22)

中圖分類號(hào)：R738.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.02.023

作者簡(jiǎn)介：農(nóng)峰，男，在讀碩士研究生。E-mail:nfeng123456@sina.cn▲通信作者：藍(lán)常貢。E-mail:landlong120@sina.com

基金項(xiàng)目：廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題(重2012083)；2011年廣西教育廳科研項(xiàng)目(201106LX431)；2010年廣西衛(wèi)生廳

重點(diǎn)科研課題(桂衛(wèi)科教〔2010〕22 號(hào))