阿旺旦增　呂廣超　趙　慧王凱忠　王　凱　(吉林大學白求恩第一醫(yī)院胸外科，吉林　長春　3002)

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STAT3，mTOR，ERK1/2磷酸化在非小細胞肺癌中的表達

阿旺旦增呂廣超趙慧1王凱忠王凱(吉林大學白求恩第一醫(yī)院胸外科，吉林長春130021)

〔摘要〕目的探討檢測信號傳遞與轉(zhuǎn)錄活化因子( STAT) 3、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白( mTOR)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶( ERK) 1/2的磷酸化在非小細胞肺癌( NSCLC)中的表達。方法收集49例手術治療的原發(fā)性NSCLC患者的病理組織及19例癌旁正常肺組織。免疫組化檢測肺癌組織及癌旁組織中的STAT3，mTOR和ERK1/2蛋白磷酸化的表達，將結(jié)果及患者的臨床基本信息及TNM分期、病理類型等因素的進行相統(tǒng)計學分析。結(jié)果在NSCLC中STAT3、mTOR和ERK1/2的磷酸化高表達。磷酸化的STAT3( p－STAT3)在鱗癌中的表達高于腺癌( P=0．001)。磷酸化的mTOR ( p－mTOR)在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中高表達( P = 0．043)。本實驗的肺癌組織中蛋白p－ERK1/2與p－STAT3、p－mTOR之間存在相關性( P = 0．033，P=0．015)。結(jié)論NSCLC的發(fā)生與STAT3、mTOR和ERK1/2的磷酸化表達有關。p－STAT3在鱗癌發(fā)病中意義更大。p－mTOR與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關。p－ERK1/2與p－mTOR、p－STAT3在NSCLC中的表達存在正相關性。

〔關鍵詞〕非小細胞肺癌; p－STAT3; p－mTOR; p－ERK1/2

1吉林大學白求恩醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室

第一作者:阿旺旦增( 1984－)，男，在讀碩士，主要從事肺癌的診斷與治療研究。

目前非小細胞肺癌( NSCLC)首選手術治療，但當確診時75%病人已經(jīng)失去手術機會，對于一線化療藥物鉑類，僅30%患者治療有效，分子靶向治療藥物已經(jīng)在臨床上取得了較滿意的效果。目前研究介導NSCLC增殖的主要通路中較為明確的有兩條通路:細胞外調(diào)節(jié)激酶－絲裂原化蛋白激酶( RAS－ERK/ MAPK)途徑;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白( P13K/AKT/mTOR)路徑。這些通路可以使細胞增殖增加，凋亡減少，并使新生血管數(shù)目更多，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象也更加頻繁。PI3K/AKT/mTOR信號通路的核心部位的關鍵蛋白是mTOR，mTOR磷酸化( p－mTOR)可以引起腫瘤細胞快速增殖，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔1〕。

絲裂原的活化蛋白激酶的胞質(zhì)信號傳遞路徑的終末蛋白激酶是細胞外信號調(diào)節(jié)激酶( ERK)，它被激活形成p－ERK，在細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中起重要作用。信號傳遞與轉(zhuǎn)錄活化因子3 ( STATs)作為一種癌基因，被認定為信號的轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄相關激活因子，常過度表達于多種腫瘤細胞中。STAT3的活化構(gòu)成即為磷酸化的STAT3( p－STAT3)，它能促進細胞的增殖、分化、凋亡等。張一方等〔2〕發(fā)現(xiàn)在微管結(jié)合蛋白4－間變淋巴瘤激酶( EML4－ALK)融合基因肺癌細胞株中STAT3表達有上調(diào)，ERK1/2與AKT及與其相應的磷酸化沒有顯著的改變，mTOR表達有所上調(diào)，磷酸化程度明顯升高。本實驗旨在探討STAT3、AKT、mTOR及ERK等蛋白的磷酸化在NSCLC中的表達及其相關性。

1資料與方法

1. 1資料收集原發(fā)性NSCLC患者的病理組織49例及癌旁的正常肺組織19例。所有病例均來源于2013年1～8月在我院胸外科予以手術治療的患者。手術前均未給予化、放療等抗腫瘤的治療。癌旁組織由病理科醫(yī)師診斷為正常肺組織。49 例NSCLC標本中鱗癌29例( 59．2%)，腺癌20例( 40．8%) ;其中男36例，女13例;年齡≥60歲的19例，＜60歲的30例;吸煙患者30例，不吸煙19例;存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例27例; NSCLC的分期:Ⅰ期23例，Ⅱ期13例，Ⅲ期13例。

1. 2方法

1. 2. 1標本收集本實驗收集了49例NSCLC病患的腫瘤組織的石蠟包埋標本。標本切除后20 min內(nèi)予以收集，甲醛固定，脫水后石蠟包埋，連續(xù)切片，每張4 μm。

1. 2. 2免疫組織化學檢測實驗步驟: ( 1)脫蠟至水:將組織標本放入二甲苯試劑中2遍，5 min/次，不同梯度酒精逐級脫水。( 2)標本用0．01 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液( PBS)漂洗3遍，5 min/次。( 3)滅活內(nèi)源性梓根過氧化物酶( HRP) :用3% H2O2去離子水孵育10 min，用PBS沖洗3遍，5 min/次。( 4)抗原修復:切片浸于0．01 mol/L構(gòu)椽酸鹽抗原修復液體中，加熱至煮沸10 min，自然冷卻即用PBS洗3遍，5 min/次。( 5)擦干切片周圍水分，切勿碰觸組織。在切片上滴注封閉用山羊血清工作液50 μl，并在室溫下孵育30 min，不沖洗，只倒去切片上封閉血清便可。( 6)滴加50 μl的一抗。分別為兔抗人p－STAT3、p－mTOR和p－ERK1/2，予以在4℃冰箱中貯存一晚。( 7)第2天，將從4℃冰箱中取出的過夜切片在室溫下復溫半小時，后用PBS沖洗3遍，5 min/次。( 8)每張切片在加入1滴生物素化二抗工作液后在室溫下孵育半小時，再用PBS沖洗3次，5 min/次。( 9)每張切片在滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液后室溫下孵育半小時，后予以PBS溶液沖洗3遍，5 min/次，二氨基聯(lián)苯胺( DAB)顯色:將DAB顯色液滴加于蓋玻片上，待顯微鏡下顯色結(jié)果為陽性時用自來水沖洗蓋玻片，終止顯色。( 10)用蘇木素復染2 min，后用鹽酸酒精予以分解，再用自來水沖洗返藍10 min。( 11)梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。

1. 2. 3結(jié)果判斷在對患者臨床資料等信息不知情的前提下，病理科醫(yī)師獨立觀察并分析各切片后判定病理結(jié)果。染色強度評分標準:無染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，褐色計為3分;

1. 3統(tǒng)計學方法應用SPSS19．0統(tǒng)計學分析軟件進行χ2檢驗。

2結(jié)果

2. 1 STAT、ERK1/2、mTOR在NSCLC組織和癌旁正常組織中的表達p－STAT3免疫組化陽性反應物為棕黃色小顆粒，主要存在于細胞核，p－ERK1/2陽性定位于細胞質(zhì)和細胞核，pmTOR為粗細不一棕黃色顆粒，主要染色位于細胞質(zhì)。免疫組織化學結(jié)果顯示，STAT3、ERK1/2、mTOR磷酸化在NSCLC組織的表達〔35例( 71．3%)、4例( 83．7%)、37例( 75．5%)〕明顯高于癌旁正常組織中的表達〔3例( 15．8%)、5例( 26．3%)、3例( 15．8%)〕( P＜0．001)。

2. 2 STAT蛋白在NSCLC中的磷酸化表達男性的表達率為75．0%( 27/36)，女性為61．5%( 8/13)，≥60歲患者中表達率為78．9%( 15/19)，＜60歲為66．7%( 20/30)，吸煙患者陽性率為76．7%( 23/30)，不吸煙患者中為63．2%( 12/19)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各期中表達率分別為69．6%，84．6%和61．5%，在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中表達率為68．2%( 15/22)，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中為74．1%( 20/27)，以上相關因素的比較中未見明顯統(tǒng)計學差別( P＞0．05)。p－STAT3在肺鱗狀細胞癌中的表達率為89．7%( 26/29)，明顯高于在腺癌中的表達率〔45．0%( 9/20)〕( P=0．001)。

2. 3 ERK1/2蛋白在NSCLC中的磷酸化表達在男性中表達率為80．6%( 29/36)，女性中為92．3%( 12/13)，≥60歲患者中表達率為89．5%( 17/19)，＜60歲為80．0%( 24/30)，吸煙患者陽性率為83．3%( 25/30)，不吸煙患者中為84．2%( 16/19)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各期中表達率分別為82．6%，100．0%和69．2%，在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中表達率為81．8%( 18/22)，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中為85．2%( 23/27)，在鱗癌中的表達率為86．2% ( 25/29)，在腺癌中為80．0%( 16/20)，以上相關因素的比較中未見明顯統(tǒng)計學差別( P＞0．05)。

2. 4 mTOR蛋白在NSCLC中的磷酸化表達在男性中表達率為72．2%( 26/36)，女性中為84．6%( 11/13)，≥60歲患者中表達率為73．7%( 14/19)，＜60歲為76．7%( 23/30)，吸煙患者陽性率為73．3%( 22/30)，不吸煙患者中為78．9%( 15/19)，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期中表達率分別為69．6%，76．9%和84．6%，在鱗癌中的表達率為79．3%( 23/29)，在腺癌中為70．0%( 14/20)，以上相關因素的比較中未見明顯統(tǒng)計學差別( P＞0．05)。在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中表達率為90．9%( 20/22)，明顯高于在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中的63．0%( 17/27) ( P=0．043)。

2. 5磷酸化STAT3和ERK1/2、mTOR在肺癌中表達的關系

在p－STAT3陽性表達的35例肺癌組織標本中p－ERK1/2有32例陽性表達，在p－STAT3陰性表達的14例肺癌組織標本中p－ERK1/2有5例陰性表達，兩者存在正相關性( P= 0．033)。在p－mTOR陽性表達的37例肺癌組織標本中p－ERK1/2有34例陽性表達，在p－mTOR陰性表達的12例肺癌組織標本中p－ERK1/2有5例陰性表達，兩者存在正相關性( P=0．015)。

3討論

肺癌是當今發(fā)生率與致死率最高的惡性腫瘤。我國衛(wèi)生部2006年統(tǒng)計資料顯示，城市居民死亡原因排在首位的是肺癌，在所有癌癥中死亡率排第一位，肺癌在農(nóng)村居民的死亡原因中也升至第三位〔3〕。有研究認為NSCLC組織中STAT3表達顯著增高，且腫瘤對該通路存在依賴性，但也有研究認為該通道在NSCLC中不活化。根據(jù)HPRD數(shù)據(jù)庫檢索到的Cytoscape制作的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，本文發(fā)現(xiàn)，STAT3與MAPK家族、mTOR等蛋白存在相互作用。張一方等〔2〕發(fā)現(xiàn)STAT3在EML4－ALK融合基因肺癌細胞株中表達上調(diào)，mTOR出現(xiàn)上調(diào)，磷酸化水平顯著提高。STAT3已被確認為是一種癌基因，在腫瘤的發(fā)生和進展過程中發(fā)揮重要功能，因此對于STAT3的進一步研究分析十分重要。本實驗結(jié)果提示在NSCLC中STAT3、mTOR，和ERK1/2的磷酸化高表達。p－STAT3在鱗癌中的表達高于腺癌。p－mTOR在存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中高表達，與肺癌的侵襲性、轉(zhuǎn)移能力、預后可能有關。p－STAT3與p－ERK1/2，p－ERK1/2與p－mTOR在NSCLC中的表達存在正相關性，或許是聯(lián)合使用抑制劑治療肺癌的一個方向。但是本次實驗只是從蛋白水平觀察了STAT3、ERK1/2、mTOR與NSCLC的關系，對于他們之間的具體調(diào)控機制，尚未進行基因水平的研究，仍需進一步研究，為了解NSCLC及有效地進行NSCLC的靶向治療提供了新的思路和依據(jù)。

STATs是在研究干擾素( IFN)信號轉(zhuǎn)導通路時發(fā)現(xiàn)的信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子，是一類能與DNA結(jié)合的蛋白家族〔2〕。目前為止，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關系比較密切的STATs家族成員包括STAT1、STAT3及STAT5，其中以STAT3最為活躍。STAT3與肺癌的相關性是本次試驗要解決的問題。STAT3的活化體現(xiàn)在羧基端705位酪氨酸的磷酸化位點被磷酸化〔4〕。磷酸化的STAT3單體通過與另外一個STAT3分子磷酸化的酪氨酸殘基彼此作用形成二聚體，而后進入細胞核〔5〕。后于特異DNA結(jié)合位點作用，直接或間接調(diào)節(jié)凋亡抑制基因，從而調(diào)控細胞增殖和細胞凋亡。

Ras/Raf/MEK/ERK途徑是最具代表性的MAPK信號傳導途徑之一，在NSCLC中起重要作用。MAPK信號系統(tǒng)是一組非常保守的絲氨酸(蘇氨酸)雙重磷酸化蛋白激酶家族，在信號傳遞的過程中占據(jù)著相當重要的地位。ERK是調(diào)控細胞增殖的重要途徑，在細胞分化發(fā)育、周期循環(huán)調(diào)控、胞間功能同步等多種生理病理過程中發(fā)揮作用。ERK1/2活化的形式即是p－ERK1/2。p－ERK1/2進入細胞核作用于c－jun、核轉(zhuǎn)錄因子( NF－κB)、Elk－1、c－fos、c－myc等轉(zhuǎn)錄因子，可磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子等多種底物，調(diào)節(jié)相關基因的轉(zhuǎn)錄，并在細胞惡性化過程中起重要作用〔6〕。Mi等〔7〕研究認為P13K/AKT/mTOR信號通路和MAPK/ERK通路之間或存在以下聯(lián)系，抑制mTOR將會通過負反饋方式激活MAPK/ERK通路。

mTOR屬于PI3K蛋白激酶類家族，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶。其對于細胞的調(diào)控作用通過PI3K/AKT/mTOR途徑來實現(xiàn)〔8〕。mTOR活化狀態(tài)即p－mTOR，在NSCLC中mTOR磷酸化程度隨惡性腫瘤進展增加。本實驗說明mTOR的磷酸化表達與NSCLC的侵襲性、轉(zhuǎn)移能力有密切關系，對肺癌患者的預后有影響。這在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌中早已有報道。有研究〔9〕顯示在74%的NSCLC中發(fā)現(xiàn)磷酸化或活化的mTOR，表明mTOR抑制劑與傳統(tǒng)放、化療聯(lián)合應用在肺癌治療中，可能會顯示出更明確的療效〔10〕。

4參考文獻

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〔2015－05－16修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者:王凱忠( 1968－)，男，副教授，碩士生導師，主要從事肺癌的診斷與治療研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0354-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 046