位振清，李　陽，李偉華，婁佳成，張　波

1大連醫(yī)科大學(xué)　第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，遼寧大連 1160112大連醫(yī)科大學(xué)　第二臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，遼寧大連 116000

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·綜述·

垂體腺瘤與DNA甲基化的研究進展

位振清1，李陽1，李偉華1，婁佳成2，張波2

1大連醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，遼寧大連 1160112大連醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，遼寧大連 116000

DNA甲基化與垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明鉀電壓程控通道β2成員、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、棘皮動物微管相關(guān)蛋白、ras同族成員D、同源盒基因B1、NNAT和P16啟動子區(qū)域的高甲基化抑制基因的轉(zhuǎn)錄表達，從而調(diào)控垂體腺瘤的增殖；DNA甲基化與侵襲性垂體腺瘤密切相關(guān)。因此，深入研究垂體腺瘤DNA甲基化的分子機制，將為垂體腺瘤的診治提供一個新的策略。

DNA甲基化；垂體腺瘤；診斷；治療

ActaAcadMedSin，2016,38(4)：475-479

垂體腺瘤是人類常見的顱內(nèi)良性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的15%～25%。臨床上經(jīng)常見到有些垂體腺瘤呈侵襲性生長，侵犯鞍區(qū)周圍，侵入海綿竇包繞頸內(nèi)動脈等。這些腫瘤手術(shù)不易全切，術(shù)后易復(fù)發(fā)，藥物和放射治療也不能令人滿意，稱之為侵襲性垂體腺瘤，其治療一直是神經(jīng)外科的一個挑戰(zhàn)[1]。只有對其分子機制進行深入的研究，進行靶向藥物開發(fā)，才能徹底戰(zhàn)勝該腫瘤。目前，CpG島異常高甲基化所致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活以及整個基因組異常低甲基化所致原癌基因的激活，已經(jīng)成為腫瘤研究中的熱點問題。本文主要綜述DNA甲基化與垂體腺瘤的研究進展。

DNA甲基化

概述DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究的主要內(nèi)容之一。在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基基團，通常發(fā)生在5’胞嘧啶位置上，具有調(diào)節(jié)基因表達和保護DNA位點不受特定限制酶降解的作用。在人類基因組中存在著一些長度為300～3000 bp富含CpG二核苷酸的區(qū)域，主要存在于基因的5’區(qū)域，這些結(jié)構(gòu)被稱為CpG島。正常狀態(tài)下，CpG島的未甲基化狀態(tài)是基因轉(zhuǎn)錄所必需的，而其異常甲基化可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄受抑制。大約40%哺乳動物的CpG島延伸至DNA的啟動子區(qū)域，使轉(zhuǎn)錄因子沉默，并且這種特性可以穩(wěn)定遺傳，明顯抑制基因的表達作用[2]。

DNA甲基化與腫瘤傳統(tǒng)觀點認為腫瘤發(fā)生的主要機制是各種致癌因素造成DNA序列變異，從而導(dǎo)致細胞生長分化失控，最終導(dǎo)致腫瘤的形成。近年來，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)DNA序列以外的調(diào)控機制異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中更為普遍，這種調(diào)控機制稱為表觀遺傳學(xué)機制，該機制是與DNA突變無關(guān)的可遺傳的表型變化[3]，其中DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究最為深入的一種機制。啟動子區(qū)高甲基化導(dǎo)致的基因沉默是一個可以逆轉(zhuǎn)的過程，因此，抑制DNA甲基化，使已發(fā)生甲基化的基因去甲基化，從而激活失活的基因，可作為腫瘤治療的新靶點[4]。目前，參與DNA修復(fù)、細胞分化和凋亡、調(diào)節(jié)細胞周期、耐藥性及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的基因已被鑒定出在不同的腫瘤中較易出現(xiàn)高甲基化。

垂體腺瘤的異常DNA甲基化

垂體腺瘤研究的主要方向研究表明許多腫瘤細胞中都存在著DNA甲基化方式的顯著改變[5]，其發(fā)生發(fā)展與DNA甲基化模式密切相關(guān)，腫瘤DNA常呈現(xiàn)出基因特異性的CpG島高甲基化，抑制了基因的轉(zhuǎn)錄表達，是腫瘤抑制基因失活的重要途徑[6]。DNA的甲基化與垂體腺瘤也密切相關(guān)。Newey等[7]對7個無功能垂體腺瘤做外顯子測序，未發(fā)現(xiàn)明顯有意義的基因變異，其推測無功能垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展可能與表觀遺傳有關(guān)，如DNA的甲基化等。Fukuoka和Takahashi[8]分析總結(jié)基因和表觀遺傳在垂體腺瘤發(fā)生過程中的作用，其推測表觀遺傳如DNA甲基化、miRNA和非編碼RNA等在垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展中有更重要的作用。Farrell[9]指出：全基因組學(xué)研究結(jié)果表明表觀遺傳變異在垂體腺瘤中很常見，是今后垂體腺瘤研究的主要方向。其中DNA甲基化、miRNA等抑制基因表達，與腫瘤細胞增殖相關(guān)，而且應(yīng)用相應(yīng)靶向藥物(如去甲基化)，可使基因重新表達。

垂體腺瘤DNA甲基化的研究進展近幾年，許多學(xué)者都在做垂體腺瘤的甲基化研究。

KCNAB2：Ling 等[10]根據(jù)Knosp分級情況，將24例不同病理類型的垂體腺瘤分成兩組，進行甲基化芯片檢測和RNA測序，結(jié)果分析顯示無功能型較功能型垂體腺瘤呈現(xiàn)明顯的高甲基化，其中鉀離子電控通道基因KCNAB2啟動子區(qū)域的高甲基化，抑制下游離子通道蛋白的表達，這可能與無功能垂體腺瘤的激素分泌不活躍相關(guān)。由此，DNA甲基化的分析結(jié)果或許可以補充目前垂體腺瘤的分子病理分型標準，對于研究無功能垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展有指導(dǎo)意義。

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶：端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的異常表達是腫瘤發(fā)生的一個顯著特點，垂體腺瘤中基因變異少見，而甲基化很常見。K?chling等[11]通過特定的甲基化聚合酶鏈反應(yīng)測定85例初發(fā)和15例復(fù)發(fā)垂體腺瘤端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子區(qū)域甲基化情況，發(fā)現(xiàn)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子區(qū)域的甲基化很穩(wěn)定，與腫瘤亞型、大小、激素水平等無關(guān)聯(lián)，對判斷預(yù)后也無價值。

O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶：Arya 等[12]取30例垂體腺瘤患者的腫瘤組織，測定O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O- 6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)啟動子區(qū)域的甲基化情況，并做E3泛素蛋白連接酶1、p53和MGMT的免疫組織化學(xué)，其中40%的腫瘤有甲基化，甲基化腫瘤中MGMT蛋白表達的只有41.6%，而未甲基化MGMT蛋白表達的高達72.2%，未甲基化的患者術(shù)后腫瘤再生長率顯著增高，表明MGMT的甲基化與腫瘤的增殖密切相關(guān)。

CDKN2A：Pease等[13]認為表觀遺傳學(xué)在垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對其診斷和治療有指導(dǎo)作用，因此，其回顧了1993至2013年關(guān)于垂體腺瘤與表觀遺傳學(xué)的文獻，證據(jù)表明：有24個基因與表觀遺傳密切相關(guān)，其中16個是通過DNA甲基化抑制表達的，5個基因細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A、生長阻滯和DNA損傷誘生蛋白45y、成纖維生長因子受體2、半胱氨酸蛋白酶8和菱形區(qū)域基因3在垂體腺瘤組織中DNA異常甲基化高達50%以上，其中CDKN2A與腫瘤侵襲和組織病理亞型相關(guān)。

EML2、RHOD 和 HOXB1：Duong等[14]收集一組垂體腺瘤，包括無功能、泌乳素、生長激素和促腎上腺皮質(zhì)激素各型，在腫瘤全基因組內(nèi)高通量檢測(超過14 000個基因，包括27 578個CpG位點)DNA甲基化，通過焦磷酸測序進一步驗證篩選出12個基因，有3個基因EML2、RHOD 和HOXB1表現(xiàn)為甲基化和轉(zhuǎn)錄組表達負相關(guān)，即啟動子出現(xiàn)高甲基化，而基因表達明顯降低。13例無功能型中12例刺猬互動蛋白1和轉(zhuǎn)錄因子AP- 2E呈現(xiàn)明顯高甲基化。這類研究對于探索預(yù)測腫瘤生長的生物標記物和病因有重要意義，為進一步診斷和靶向治療提供了新的途徑。

印記基因NNAT：印記基因NNAT屬于腫瘤抑制基因，是垂體中最常見的轉(zhuǎn)錄基因之一，與垂體的生長發(fā)育及成熟密切相關(guān)。正常垂體的免疫組織化學(xué)定位顯示各種分泌細胞(如泌乳素、生長激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、卵泡刺激素和促甲狀腺激素)都表達NNAT。Revill等[15]取47例垂體腺瘤組織(包括11例生長激素型、10例泌乳素型、12例促腎上腺皮質(zhì)激素型和14例無功能型)，分別作實時定量-PCR和免疫組織化學(xué)，其中33例中NNAT轉(zhuǎn)錄體和蛋白均未表達，檢測其啟動子CpG區(qū)發(fā)現(xiàn)存在明顯的高甲基化。這些發(fā)現(xiàn)表明NNAT的高甲基化在垂體腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

P16：P16是編碼細胞周期蛋白依賴性激酶4的抑制蛋白，通過抑制RB轉(zhuǎn)錄輔抑制物1的磷酸化作用，控制細胞進入G1-S增殖周期，其功能減弱在很多腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究表明，在大多數(shù)人類垂體腺瘤中，P16表達喪失與其突變、純合性缺失無關(guān)，而與該基因CpG島完全被甲基化有關(guān)[16- 17]。WoloSchak等[16]研究顯示，20個垂體腺瘤中18個出現(xiàn)CpG島區(qū)異常甲基化，3個垂體腺瘤的外顯子2的HpaⅡ位點有甲基化，Western blot分析表明垂體腺瘤的P16蛋白表達缺失。Simpson[17]研究了大樣本的無功能垂體腺瘤，甲基化敏感限酶消化后PCR擴增的結(jié)果表明，70%無功能腺瘤P16基因內(nèi)的CpG島出現(xiàn)甲基化，其還用免疫組織化學(xué)技術(shù)評估P16蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)78%的甲基化腫瘤未能表達P16蛋白，提示異常甲基化與P16蛋白表達明顯相關(guān)，與垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

侵襲性垂體腺瘤的DNA甲基化研究侵襲性垂體腺瘤中視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白的表達降低，研究表明：PRb蛋白喪失與RB1基因內(nèi)標志物的雜合性丟失無關(guān)，而與RB1啟動子區(qū)域甲基化有關(guān)[18]。其他一些與垂體腺瘤侵襲性相關(guān)的腫瘤抑制基因P53和nm23也做了轉(zhuǎn)錄表達和蛋白水平的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與侵襲行為有關(guān)的一些變化，在遺傳學(xué)上也無異常改變[18]。DNA異常甲基化也是死亡相關(guān)蛋白激酶失活的重要表觀遺傳學(xué)機制，而它的表達與垂體腺瘤的侵襲性生長存在著明顯負相關(guān)[19]。如DNA損傷的修復(fù)蛋白MGMT在侵襲性垂體瘤中的表達明顯降低，造成其表達下降的原因就是其啟動子的高甲基化。MGMT的甲基化不但可以作為腫瘤診斷的生物標記，它還影響了腫瘤的生物學(xué)行為以及對化療的敏感性[20]。甲基化異常能使多種抑癌基因失活，它們的失活則會顯著促進腫瘤的生長[21]。由此可見，甲基化異常是促進垂體腺瘤侵襲性生長的重要原因。因此，深入研究導(dǎo)致腫瘤異常甲基化的原因，不但有助于更加清晰地理解侵襲性垂體腺瘤的發(fā)病機制，還有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。

DNA異常甲基化與垂體腺瘤的診療

診斷檢測基因異常甲基化可用于腫瘤診斷，腫瘤細胞與正常細胞間基因組甲基化差異就是其理論基礎(chǔ)。目前垂體腺瘤的診斷主要依靠磁共振影像和內(nèi)分泌檢查，基因異常甲基化對于垂體腺瘤的診斷和分型尚處于研究階段，未廣泛應(yīng)用于臨床。由于很多腫瘤患者血漿游離DNA明顯升高，且具備腫瘤細胞生物學(xué)特性，支持了血漿中游離DNA大多來自原發(fā)腫瘤的判斷[22- 23]，這點極具腫瘤早期診斷價值。

治療腫瘤抑制基因異常甲基化是腫瘤表觀遺傳治療靶點，其表達異常是可逆的，改變DNA的甲基化方式則可能影響腫瘤的生長[21]。CpG島甲基化對去甲基化劑十分敏感，使用去甲基化劑不可能引起正常組織中有功能基因表達異常。實驗室資料顯示去甲基化治療能明顯抑制垂體瘤細胞的生長，這可能與甲基化方式改變后使得某些抑癌基因的功能恢復(fù)有關(guān)，應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可使這些基因重新去甲基化，從而抑制腫瘤；可使腫瘤細胞提高對傳統(tǒng)治療(如放化療)的敏感性；可使多巴胺D2受體陰性和難治性垂體腺瘤恢復(fù)到受體陽性狀態(tài)。去甲基化治療與傳統(tǒng)治療方式(手術(shù)和放化療)相結(jié)合，有希望徹底治愈垂體腺瘤[21]。目前去甲基化治療尚未臨床應(yīng)用于垂體腺瘤。美國食品和藥品管理局已經(jīng)批準去甲基化方案進入部分血液病的臨床治療，該方案對白血病和骨髓異常增生綜合征都具有顯著的效果[24]。5-氮雜- 2’脫氧胞苷是去甲基化治療腫瘤的代表性藥物[25]，其作用機制是與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價結(jié)合，抑制其生物活性并改變基因甲基化狀態(tài)。但這類藥物無組織或基因特異性，并非所有高甲基化抑癌基因均可被其激活，故臨床應(yīng)用有限。近幾年，有學(xué)者利用小干擾RNA靶向抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1表達，發(fā)現(xiàn)可激活因異常甲基化而失活的抑癌基因，并顯著抑制腫瘤[2]。DNA甲基化程度可以評估腫瘤的病理分級、分期，呈正相關(guān)趨勢；DNA異常甲基化與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)密切相關(guān)，從而影響腫瘤患者的生存期[26- 27]。

綜上，DNA的甲基化異常和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系，同樣與垂體腺瘤密切相關(guān)，甲基化方式異常是促進垂體腺瘤侵襲性生長的重要原因。因此，深入研究垂體腺瘤異常甲基化的原因，有助于探索垂體腺瘤的發(fā)病機制和建立垂體腺瘤的分子病理分型，也為侵襲性垂體腺瘤的診治提供了一條新的途徑。

[1]位振清，王任直，姚勇，等.多技術(shù)輔助神經(jīng)內(nèi)鏡下侵襲海綿竇的垂體腺瘤的治療[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2014，36(2)：189- 193.

[2]錢芳，張剛. DNA甲基化與腫瘤的相關(guān)研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2013，19(3)：445- 448.

[3]McQuown SC，Wood MA. Epigenetic regulation in substance use disorders [J]. Curr Psychiatry Rep，2010，12(2)：145- 153.

[4]Humeniuk R，Mishra PJ，Bertino JR，et al. Molecular targets for epigenetic therapy of cancer [J]. Curr Pharm Biotechnol，2009，10(2)：161- 165.

[5]Jin B，Li Y，Robertson KD. DNA methylation： superior or subordinate in the epigenetic hierarchy? [J]. Genes Cancer，2011，2(6)：607- 617.

[6]Jin B，Robertson KD. DNA methyltransferases，DNA damage repair，and cancer [J]. Adv Exp Med Biol，2013，754：3- 29.

[7]Newey PJ，Nesbit MA，Rimmer AJ，et al. Whole-exome sequencing studies of nonfunctioning pituitary adenomas [J]. J Clin Endocrinol Metab，2013，98(4)：E796- E800.

[8]Fukuoka H，Takahashi Y. The role of genetic and epigenetic changes in pituitary tumorigenesis [J]. Neurol Med Chir (Tokyo)，2014，54(12)：943- 957.

[9]Farrell WE. Epigenetics of pituitary tumours： an update [J]. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2014，21(4)：299- 305.

[10]Ling C，Pease M，Shi L，et al. A pilot genome-scale profiling of DNA methylation in sporadic pituitary macroadenomas： association with tumor invasion and histopathological subtype [J]. PLoS One，2014，9(4)：e96178.

[11]K?chling M，Ewelt C，F(xiàn)ürtjes G，et al. hTERT promoter methylation in pituitary adenomas [J]. Brain Tumor Pathol，2016，33(1)：27- 34.

[12]Arya S，Majaid MA，Shwetha SD，et al. Implications of MGMT methylation status in pituitary adenoma [J]. Pathol Res Pract，2014，210(7)：407- 411.

[13]Pease M，Ling C，Mack WJ，et al. The role of epigenetic modification in tumorigenesis and progression of pituitary adenomas： a systematic review of the literature [J]. PLoS One，2013，8(12)：e82619.

[14]Duong CV，Emes RD，Wessely F，et al. Quantitative，genome-wide analysis of the DNA methylome in sporadic pituitary adenomas [J]. Endocr Relat Cancer，2012，19(6)：805- 816.

[15]Revill K，Dudley KJ，Clayton RN，et al. Loss of neuronatin expression is associated with promoter hypermethylation in pituitary adenoma [J]. Endocr Relat Cancer，2009，16(2)：537- 548.

[16]WoIoSchak M，Yu A，Post KD. Frequent inactivation of the P16 gene in human pituitary tumors by gene methylation [J]. Mol Carcinog，1997，19(4)：221- 224.

[17]Simpson DJ. Hypermethylation of the P16/CDKN2A/MTST gene and loss of protein expression is associated with nonfunctional pituitarv adenomas but not somatotrophinomas [J]. Genes Chromosomes Cancer，1999，24(4)：328- 336.

[18]王玉亭，王成東，張振興. DNA甲基化異常與垂體瘤[J].神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生，2001，1(2)：61- 62.

[19]Simpson DJ，Clayton RN，F(xiàn)arrell WE. Preferential loss of death associated protein kinase expression in invasive pituitary tumours is associated with either CpG island methylation or homozygous deletion [J]. Oncogene，2002，21(8)：1217- 1224.

[20]Bush ZM，Longtine JA，Cunningham T，et al. Temozolomide treatment for aggressive pituitary tumors： correlation of clinical outcome with O(6)-methylguanine methyltransferase (MGMT) promoter methylation and expression [J]. J Clin Endocrinol Metab，2010，95(11)：E280-E290.

[21]Yacqub-Usman K，Richardson A，Duong CV，et al. The pituitary tumour epigenome： aberrations and prospects for targeted therapy [J]. Nat Rev Endocrinol，2012，8(8)：486- 494.

[22]Sunami E，Vu AT，Nguyen SL，et al. Analysis of methylated circulating DNA in cancer patients’ blood [J]. Methods Mol Biol，2009，507：349- 356.

[23]Svrcek M，Buhard O，Colas C，et al. Methylation tolerance due to an O6-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) field defect in the colonic mucosa： an initiating step in the development of mismatch repair-deficient colorectal cancers[J]. Gut，2010，59(11)：1516- 1526.

[24]Muller CI，Ruter B，Koeffler HP，et al. DNA hypermethylation of myeloid cells，a novel therapeutic target in MDS and AML [J]. Curr Pharm Biotechnol，2006，7(5)：315- 321.

[25]強少盈，劉文超.甲基化和去甲基化在腫瘤發(fā)生與治療中的作用[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2011，19(11)：2352- 2355.

[26]Hildebrandt MA，Gu J，Lin J，et al. Hsa-miR- 9 methylation status is associated with cancer development and metastatic recurrence in patients with clear cell renal cell carcinoma[J]. Oncogene，2010，29(42)：5724- 5728.

[27]Park SY，Kook MC，Kim YW，et al. CpG island hypermethylator phenotype in gastric carcinoma and its clinicopathological features [J]. Virchows Arch，2010，457(4)：415- 422.

Research Advances in Pituitary Adenoma and DNA Methylation

WEI Zhen-qing1，LI Yang1，LI Wei-hua1，LOU Jia-cheng2，ZHANG Bo2

1Department of Neurosurgery，the First Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian，Liaoning 116011，China2Department of Neurosurgery，the Second Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian，Liaoning 116000，China

ZHANG BoTel：0411- 84671291- 5190，E-mail： zhangbodl@126.com

DNA methylation is closely related to the genesis and development of pituitary adenoma. Studies have shown that high methylation in the promoter region of potassium voltage-gated chanel，shaker related subfamily，beta member 2，O- 6-methylguanine-DNA methyltransferase，echinoderm microtubule associated protein like 2 ，ras homolog family member D ，homeobox B1 ，NNAT， and P16 inhibits the expression of these genes and regulates of the proliferation of pituitary adenoma. DNA methylation is also closely related to invasive pituitary adenoma. Therefore，further study on molecular mechanism of DNA methylation of pituitary adenoma will offer a new strategy for the diagnosis and treatment of pituitary adenoma.

DNA methylation；pituitary adenoma；diagnosis；treatment

國家自然科學(xué)基金(81372714)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81372714)

張波電話：0411- 84671291- 5190，電子郵件： zhangbodl@126.com

R651

A

1000- 503X(2016)04- 0475- 05

10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.04.019

2016- 03- 21)