陳沛沛，秦　巖，李雪梅

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院　北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100730

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·綜述·

尿外泌體在腎臟疾病的研究進展

陳沛沛，秦巖，李雪梅

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100730

外泌體是細胞主動分泌到微環(huán)境中直徑為30～100 nm的雙層質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)外泌體可廣泛分布于各種體液中，其含有的母細胞來源的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)不僅能反映來源細胞的生理狀態(tài)，還可能在生理和疾病狀態(tài)下的細胞間通訊過程中發(fā)揮重要作用。本文主要介紹尿外泌體的生物學(xué)特性及其可作為腎臟疾病的新興生物學(xué)標志物、干預(yù)治療目標和靶向治療載體的潛力，概述目前存在的問題及展望該液體活檢的臨床應(yīng)用前景。

尿外泌體；腎臟疾病；液體活檢；生物學(xué)標志物；靶向治療載體

ActaAcadMedSin，2016,38(4)：464-469

雖然外泌體被發(fā)現(xiàn)至今已有30多年，但尿外泌體的研究歷史僅有短暫的10年，將其應(yīng)用在腎臟疾病診療方面的研究尚處于起步階段。隨著分子檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體內(nèi)載的RNA和蛋白質(zhì)不僅可以反映來源細胞的生物學(xué)信息，還可以體現(xiàn)來源細胞的生理病理狀態(tài)，并且參與泌尿系統(tǒng)微環(huán)境中細胞間的信息交流，與腎臟疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可以成為潛在的腎臟疾病的生物標志物、干預(yù)介導(dǎo)的目標[1]和未來靶向治療[2]的載體。本文主要綜述尿外泌體與腎臟疾病的研究進展。

外泌體的生物學(xué)特性

外泌體的起源及分泌外泌體是一種直徑30～100 nm、具有雙層質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡，由細胞通過胞吐作用主動釋放到細胞外的微環(huán)境中。1987年Johnstone等[3]首次在網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)并報道了外泌體。此后的研究發(fā)現(xiàn)外泌體可由樹突細胞、腫瘤細胞、成纖維細胞等多種細胞釋放分泌，并廣泛存在于尿液[4]、外周血、唾液、腹水、羊水、乳汁、腦脊液等各種體液中[5- 7]，曾一度被認為是一種細胞的廢棄物。然而近幾年，隨著分子檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)外泌體表面富含膽固醇、神經(jīng)鞘磷脂、神經(jīng)酰胺等脂類物質(zhì)，其內(nèi)載有大量的母細胞來源蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA等生物信息[8]，在細胞通訊和組織微環(huán)境中具有重要的作用。這些發(fā)現(xiàn)重新點燃了人們對外泌體的關(guān)注。以外泌體為代表的體液活檢不僅能夠檢測異常細胞、蛋白質(zhì)、核酸和母細胞來源的相關(guān)信息，還能避免組織活檢的創(chuàng)傷性及穿刺手術(shù)潛在的并發(fā)癥風(fēng)險，被麻省理工大學(xué)科技論壇評為“2015年度十大突破之一”。

在細胞內(nèi)，外泌體主要經(jīng)過核內(nèi)體途徑生成。當細胞經(jīng)胞吞作用將外源性抗原吞入形成早期核內(nèi)體后，隨后早期核內(nèi)體囊膜向內(nèi)出芽形成管腔狀囊泡，并選擇性地分揀細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白及脂質(zhì)成分，形成晚期核內(nèi)體，即為具有動態(tài)亞細胞結(jié)構(gòu)的多囊體[8]。多囊體是真核細胞重要的蛋白運輸與分揀中心，與信號傳導(dǎo)、胞質(zhì)分裂、基因沉默、自噬、病毒出芽等過程密切相關(guān)[9]。細胞內(nèi)多囊體的去向主要有3個方面：(1)接受細胞質(zhì)中的大分子和囊泡結(jié)構(gòu)，形成內(nèi)涵體，與溶酶體融合后使內(nèi)載物降解；(2)直接與溶酶體結(jié)合后降解其內(nèi)載物；(3)以鈣離子依賴的方式與細胞膜融合，將其內(nèi)部所包含的多個囊泡結(jié)構(gòu)釋放至細胞外基質(zhì)中，即形成外泌體[8]。

尿外泌體的來源及分離方法現(xiàn)通過蛋白質(zhì)組學(xué)等方法已證實幾乎所有的腎臟固有細胞均可分泌外泌體。通過透射電鏡可直接觀察到大鼠腎組織的足細胞、近端小管上皮細胞、髓袢升支及降支小管上皮細胞、集合管主細胞和閏細胞均有多囊體和外泌體的存在[10]。另外，泌尿系統(tǒng)的前列腺和膀胱等器官固有細胞也分泌外泌體[11]。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析進一步驗證了尿外泌體還攜帶母細胞來源的標志蛋白，如腎組織中足細胞的頂端膜蛋白Podocalyxin、平足蛋白和腎母細胞瘤基因蛋白- 1(Wilm’s tumor- 1，WT- 1)；近曲小管的鈉氫交換蛋白3、鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白- 1/2、水通道蛋白- 1；髓袢升支粗段的鈉鉀氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2；遠曲小管的Na-Cl同向轉(zhuǎn)運體蛋白和集合管的水通道蛋白2等蛋白[12]。另有研究顯示尿液中存在部分“跨腎”的尿外泌體miRNA，它們來源于泌尿道之外的細胞，經(jīng)血液循環(huán)通過腎臟，最終以尿外泌體形式排出[13]。尿外泌體的雙層膜結(jié)構(gòu)將內(nèi)載物與外界尿液中大量的核糖核酸酶相隔絕，穩(wěn)定地保護了母細胞來源的基因、蛋白、抗原及抗體等相關(guān)信息。因此，尿外泌體不僅具備作為泌尿道疾病診治的新型分子生物標志物的潛力，還反映泌尿道外母細胞的生理病理狀態(tài)。

尿外泌體是由Pisitkun等[14]首次從尿液中通過兩步超速離心法分離純化獲得的。隨著研究技術(shù)及手段的不斷成熟，近年可通過超速離心法、超濾法、色譜法、磁珠法和一些試劑盒提取分離尿外泌體[15]，上述方法各有利弊，但仍無一種方法能夠同時保證外泌體的含量、純度及生物學(xué)活性。截至目前，業(yè)界對尿外泌體的分離、富集和純化尚無統(tǒng)一的標準，國際上公認最經(jīng)典的分離方法是以差異離心為原理的超速離心法，該方法依次清除細胞與細胞碎片，最后沉淀尿外泌體達到分離、富集的目的，但因為每次處理的樣本量較小，時間較長，并且依賴昂貴的超高速離心機，在臨床上較難推廣應(yīng)用。后期出現(xiàn)通過濾過膜分離的超濾法需要考慮膜的孔徑范圍和尿外泌體在濾過膜上堵塞堆積造成損失的情況；另外使用試劑盒雖然可大大縮短分離提取的時間，但其處理的樣本量相當有限，對濃縮前的預(yù)處理條件有一定的要求，價格也比較昂貴。這些方法學(xué)的優(yōu)缺點為針對研究對象和目的如何更好地選擇收集尿外泌體的方法學(xué)帶來更多的思考。

尿外泌體與腎臟疾病的研究進展

人類尿外泌體包含腎臟來源母細胞的相關(guān)特異性蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)，提示其具有腎臟疾病的生物標志物、干預(yù)介導(dǎo)的目標[1]和未來靶向治療[2]載體的潛在臨床價值。同時，相對于其他體液，尿液具有取樣安全簡單、樣本量大且無創(chuàng)的優(yōu)點，所以尿外泌體對泌尿系統(tǒng)疾病的早期診斷、治療和監(jiān)測靶點以及疾病的機制研究具有重大的前景。

尿外泌體作為腎臟疾病的生物標志物近年尿外泌體相關(guān)研究篩選出了大量的腎臟疾病相關(guān)候選生物標志物，與尿外泌體相關(guān)的新型生物學(xué)標志物可能與腎臟結(jié)構(gòu)和功能損害相關(guān)，主要集中在急性腎損傷、各種腎小球及腎小管和多囊腎等疾病。

在急性腎損傷方面急性腎損傷動物模型研究顯示，尿外泌體的胎球蛋白-A[16]、活化轉(zhuǎn)錄因子3[17- 18]和足細胞骨架巢蛋白[19]在損傷早期(2～6 h)即出現(xiàn)高表達，比常規(guī)的血肌酐提前(18～48 h)出現(xiàn)明顯改變；另外，水通道蛋白- 1[20]及鈉氫交換體[21]在早期(6～48 h)明顯下降，比傳統(tǒng)指標鈉排泄分數(shù)及尿視黃醇結(jié)合蛋白具有更高的敏感性和特異性。上述結(jié)果均在臨床急性腎損傷患者的尿液中得到驗證，其中活化轉(zhuǎn)錄因子3僅表達在急性腎損傷患者的尿外泌體中，提示其具有作為特異性標志物的前景。

在腎小球疾病方面尿外泌體內(nèi)載有腎小球足突細胞損傷狀態(tài)的標志物，如腎母細胞瘤WT- 1基因[17]。WT- 1在局灶節(jié)段性腎小球硬化動物模型的尿外泌體中表達增高，并早于蛋白尿出現(xiàn)。同樣，足細胞標記蛋白頂端膜蛋白Podocalyxin在IgA腎病[22]及糖尿病腎病[23]患者尿外泌體中升高的幅度明顯。研究表明IgA患者的尿外泌體中miRNA變化(miR- 200a、miR- 200b、miR- 429[24]的豐度減少及miR- 146、miR- 155[25]的豐度增高)、糖尿病腎病患者尿外泌體中miR- 192、微小病變患者及局灶節(jié)段性腎小球腎炎患者尿液中的miR- 200水平變化均與疾病的嚴重程度呈明顯相關(guān)性。另有研究通過檢測患者尿外泌體中與足細胞功能和結(jié)構(gòu)相關(guān)的B7- 1和NPHS1基因的表達程度區(qū)分不同病理類型的腎小球疾病，可有助于鑒別微小病變和局灶節(jié)段性腎小球硬化[26]。

在腎小管疾病方面尿外泌體在腎小管通道損傷[27- 28]或突變?nèi)笔嚓P(guān)的家族性高鉀性高血壓患者[29]、Bartter[11]和Gitelman綜合征[30]等疾病診斷方面均顯示能提高疾病早期診斷率的優(yōu)勢。在經(jīng)典腎小管酸中毒V-ATPase B1基因敲除小鼠模型研究中顯示，尿液外泌體與腎組織中的V-ATPase B1 mRNA和水通道蛋白- 2 mRNA的表達趨勢是平行的，具有相關(guān)一致性[10，31]。另有研究顯示大鼠尿外泌體中水通道蛋白- 2的蛋白含量可以受到加壓素和尿液pH值的調(diào)節(jié)作用[32]。另外，在腎缺血再灌注損傷大鼠模型研究中證實，急性損傷早期觀察到的尿外泌體中水通道蛋白- 1含量的下降與腎組織的分泌和表達量下降有關(guān)[20]。上述研究進一步支持了尿液外泌體所攜帶的信息能夠反映腎臟的病理生理變化的觀點，具有無創(chuàng)性且取材方法簡單的優(yōu)點。

在其他腎臟疾病方面尿外泌體攜帶的多囊蛋白[33]及胱氨酸、ADP核糖基化類似因子[34]等信息對參與多囊腎疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程、相關(guān)病因及診斷和評估病情程度有重要的提示作用。另外，尿外泌體內(nèi)的miRNA組還可以提示腎臟的代謝活動，有研究證實尿外泌體內(nèi)miRNA參與了高血壓發(fā)病相關(guān)信號通路中重要蛋白質(zhì)的調(diào)控，并有利于診斷鑒別鹽敏感性高血壓[35]。有研究顯示尿外泌體來源的噻嗪類敏感性Na-Cl同向轉(zhuǎn)運體蛋白、前列腺蛋白(可激活ENaC的活性)、水通道蛋白- 2蛋白表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律表達變化，并且與循環(huán)中腎素-血管緊張素醛固酮系統(tǒng)相關(guān)激素的表達趨勢平行[36]。筆者團隊前期研究已證實正常大鼠的血壓、尿鈉排泄、腎組織的生物鐘基因及鐘控基因Na-Cl同向轉(zhuǎn)運體蛋白及ENaC的mRNA呈現(xiàn)“晝低夜高”的節(jié)律變化[37]，在腎遠曲小管受激素影響的兩個重要轉(zhuǎn)運體和通道Na-Cl同向轉(zhuǎn)運體蛋白和ENaC的活性具有晝夜節(jié)律表達規(guī)律，能夠節(jié)律性表達調(diào)節(jié)腎臟水鈉平衡和血壓節(jié)律[38]。提示尿外泌體可作為一個良好的腎臟生物鐘系統(tǒng)晝夜節(jié)律診斷與監(jiān)測的生物標志物，為人類血壓節(jié)律和腎臟時間生物學(xué)研究提供新的媒介。

尿外泌體作為腎臟疾病的干預(yù)介導(dǎo)目標和靶向治療載體

近年來，外泌體新興的靶向治療載體的作用在腫瘤治療等領(lǐng)域有了新進展，腎臟領(lǐng)域相關(guān)研究也有新的發(fā)現(xiàn)。

外泌體干預(yù)介導(dǎo)靶細胞的方式外泌體可以介導(dǎo)細胞間的信號傳導(dǎo)，主要通過細胞表面配體直接刺激受體細胞、與靶細胞的胞膜附著或融合、內(nèi)陷胞吞作用轉(zhuǎn)移其所攜帶的母細胞來源信息，從而完成細胞微環(huán)境的信號傳導(dǎo)信息通訊過程[39]，也可通過選擇性包裹mRNA和miRNA并轉(zhuǎn)運進入靶細胞，影響下游通路的改變，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[40]。

外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境形成及為轉(zhuǎn)移做準備過程的關(guān)鍵事件中發(fā)揮重要作用。例如，乳腺癌的小鼠模型中，癌細胞來源外泌體中的miR- 181c可以下調(diào)基因PDPK1，發(fā)揮聚集肌動蛋白進而破壞血腦屏障的作用，從而推測這可能是乳腺癌患者通過血腦屏障造成腫瘤腦轉(zhuǎn)移而造成死亡的分子機制之一[41]；黑色素瘤來源的外泌體和毛細血管壁之間的互動可引起血管通透性改變，有助于腫瘤細胞從血管中逃逸，進入下一個新位點。另外，有研究提示外泌體可促進腫瘤發(fā)生器官特異性轉(zhuǎn)移，外泌體的整合素類型決定了其傾向性的聚集黏附于相應(yīng)配體的器官細胞中，并且外泌體內(nèi)含物會引起靶器官的環(huán)境改變進而為癌癥細胞的轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)[42]。該研究同時顯示，轉(zhuǎn)移到肺部的乳腺癌細胞的外泌體能把另一類常發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞重定向到肺部。這些研究擴展了外泌體在腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移的作用，但腫瘤轉(zhuǎn)移的分子通路還受到眾多因素影響，如何將其轉(zhuǎn)化為臨床干預(yù)治療手段尚需后續(xù)更充分的研究證實。

尿外泌體在腎臟疾病中的治療應(yīng)用在腫瘤領(lǐng)域中了解到外泌體具有干預(yù)介導(dǎo)及靶向治療的潛力，越來越多研究提示尿外泌體在腎臟疾病的治療方面也具有可觀的前景。

在急性腎損傷動物模型和細胞研究中均顯示，干細胞來源的外泌體可以改善由長春新堿或順鉑導(dǎo)致的腎小管細胞凋亡，促進腎小管形態(tài)和功能的恢復(fù)；并且熒光標記的外泌體僅特異性的沉積在AKI小鼠的腎小管細胞，健康對照小鼠的腎小管并未捕獲到相應(yīng)熒光，預(yù)示著外泌體治療也許存在著一定靶向性[43]。在缺血再灌注損傷動物研究中同樣也證實干細胞來源外泌體可通過抑制細胞凋亡和刺激小管上皮細胞增殖發(fā)揮腎臟保護作用[44]。

另有研究提示尿液來源干細胞外泌體具有防治1型糖尿病大鼠腎臟并發(fā)癥的作用，使用人尿液來源的干細胞外泌體連續(xù)12周尾靜脈注射給鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠，隨后出現(xiàn)尿量和尿白蛋白排泄減少的情況，同時腎組織病理提示系膜細胞增生情況得到改善；在體外高糖培養(yǎng)的足細胞中使用上述外泌體進行處理，可改善細胞凋亡的現(xiàn)象，并證實其可能是通過caspase- 3途徑介導(dǎo)足細胞和腎小管上皮細胞的凋亡[2]。干細胞是目前糖尿病腎病新治療法的主要候選者，這一研究提示干細胞來源的外泌體為腎臟疾病的治療提供了一個新思路。

存在的問題與展望

盡管尿外泌體體現(xiàn)出的獨特優(yōu)點使其逐漸走進了腎臟病學(xué)者的視野，但同時相關(guān)的研究也提示存在居多的問題與挑戰(zhàn)。雖然尿外泌體來源的尿液樣本量取材可比其余細胞上清或體液充足，但尿液的成分復(fù)雜，并存在個體差異性，同時尿外泌體的提取受到尿液中生理性存在大量的Tamm-Horsfall 蛋白的干擾。如果尿液中存在高豐度的Tamm-Horsfall蛋白或病理性的大量尿蛋白，會增加尿外泌體的提取分離復(fù)雜性，從而影響后續(xù)的分析。此外，關(guān)于尿液標本的收集、預(yù)處理、保存等流程尚缺較統(tǒng)一的觀點，針對尿外泌體的分離、富集和純化以及對其成分的定量和校正方法也需要制定一致認可的標準方法。

綜上，雖然尿外泌體的研究史仍然處在初期的前10年階段，但外泌體在其余領(lǐng)域的相關(guān)研究提示進一步深入探索尿外泌體可在腎臟領(lǐng)域突破固有思維，更全面地理解尿外泌體在腎臟生理與病理狀態(tài)下可能發(fā)揮的作用機制，為腎臟疾病的診斷和治療帶來更多的期待和新的突破。與此同時，將尿外泌體廣泛應(yīng)用于臨床尚需要解決完善現(xiàn)階段存在的問題，最大程度地避免因為前期分離處理尿外泌體造成誤差而影響后續(xù)分析。尿外泌體動態(tài)、穩(wěn)定地攜帶了腎臟固有細胞來源的相關(guān)核酸和蛋白質(zhì)等生物學(xué)信息，并具有可無創(chuàng)性監(jiān)測的特點，使得其具備成為腎臟疾病防治的生物標志物、未來干預(yù)介導(dǎo)目標和靶向治療載體的潛力，具有研究和應(yīng)用的實際價值。

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Advances in the Urinary Exosomes in Renal Diseases

CHEN Pei-pei，QIN Yan，LI Xue-mei

Department of Nephrology，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

QIN YanTel：010- 69155058，E-mail：qinyanbeijing@126.com

Cells secrete around 30- 100 nm membrane-enclosed vesicles that are released into the extracellular spaceis termed exosomes(EXs). EXs widely present in body fluids and incorporated proteins，nucleic acids that reflect the physiological state of their cells of origin and they may play an important role in cell-to-cell communication in various physiological and disease processes. In this article we review the recent basic and clinical studies in urinary EXs in renal diseases，focusing on their biological characteristics and potential roles as new biological markers，intervention treatment goals，and targeted therapy vectors in renal diseases.However，some issues still exist；in particular，the clinical application of EXs as a liquid biopsy technique warrants further investigations.

urinary exosomes；renal diseases；liquid biopsy；biological markers；target therapy vector

國家自然青年科學(xué)基金(81100545)、北京市科委項目(D131100004713007、D09050704310901)和協(xié)和青年基金(3332016012)Supported by the National Natural Sciences Foundation for Young Scholar of China(81100545)，State Commission of Science Technology of Beijing(D131100004713007，D09050704310901)，and PUMC Youth Fund(3332016012)

秦巖電話：010- 69155058，電子郵件：qinyanbeijing@126.com

R446.12+2

A

1000- 503X(2016)04- 0464- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.04.017

2016- 03- 07)