鐘琴,張燕翔,錢鋒,楊波,任伯緒　(長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

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腦組織冰凍切片漂片法與石蠟切片貼片法的免疫組化效果比較

鐘琴,張燕翔,錢鋒,楊波,任伯緒(長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

[摘要]目的:比較腦組織冰凍切片與石蠟切片免疫組化的效果。方法:健康雄性昆明小鼠20只，腹腔注射匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)模型。24h后成功模型小鼠腦灌注固定，斷頭取腦，隨機分別取8只行冰凍切片40μm(A組)與石蠟切片4μm(B組)，采用羊抗鼠DCX(1：200)抗體，以SABC法進行免疫組化染色。結(jié)果:A組陽性神經(jīng)元數(shù)目與B組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且A組鏡下視野切片染色更加清晰，對比良好。結(jié)論:腦組織切片免疫組化染色采用冰凍切片漂片法效果更為可靠。

[關(guān)鍵詞]冰凍切片；石蠟切片；免疫組化；癲癇

隨著神經(jīng)科學(xué)的不斷發(fā)展，腦組織免疫組化技術(shù)越來越多地應(yīng)用于神經(jīng)學(xué)研究。由于腦組織本身具有柔軟、含水量大等特點，其石蠟切片的免疫組化染色結(jié)果易出現(xiàn)切片染色不清楚、脫片、假陽性、假陰性等問題[1]，很難得到高質(zhì)量的腦組織免疫組化切片。本實驗采用癲癇持續(xù)狀態(tài)模型(status epilepticus, SE)，用免疫組化的方法檢測海馬齒狀回下區(qū)編碼微管相關(guān)蛋白(DCX)陽性神經(jīng)元的表達，對比腦組織冰凍切片漂片法與石蠟切片貼片法免疫組化的效果，以期更好的開展實驗研究工作。

1對象與方法

1.1對象

健康雄性昆明小鼠20只，體質(zhì)量(30±5)g，由湖北省實驗動物研究中心提供；東莨菪堿、匹羅卡品由Sigma公司提供；免疫組化ABC試劑盒、DCX羊抗鼠一抗、驢血清、驢抗羊二抗由Santa cruze公司提供。

1.2方法

1)模型制備腹腔注射東莨菪堿1mg/kg，30min后腹腔注射匹羅卡品280mg/kg，觀察小鼠一般行為變化。按Racine的6級抽搐行為評估，表現(xiàn)為Ⅳ～Ⅴ級發(fā)作，且癲癇狀態(tài)至少持續(xù)60min以上，即為SE模型制備成功[4]。0級：無任何發(fā)作跡象；Ⅰ級：頭面部抽搐；Ⅱ級：節(jié)律性點頭或濕狗樣抖動；Ⅲ級：雙側(cè)前肢抽搐不伴后肢站立；Ⅳ級：全身強直-陣攣發(fā)作，并后肢站立，不伴摔倒；Ⅴ級：全身強直-陣攣性發(fā)作，并后肢站立伴摔倒。

2)樣本制作與分組成功模型小鼠24h后麻醉，開胸從左心室插管至升主動脈，剪開右心耳，先快速灌注生理鹽水，待流出的生理鹽水灌流液澄清后，再用三通管換成由0.1M PBS配制的4%多聚甲醛200～250mL，滴注約1～1.5h。待小鼠全身固定僵硬后，斷頭取腦。隨機分別抽取8只分為2組：A組行冰凍切片免疫組化、B組行石蠟切片免疫組化(4只死亡舍棄)。

3)免疫組化A組冰凍切片免疫組化漂片法:取腦后置于4%多聚甲醛4℃后固定8～10h，再將腦組織轉(zhuǎn)入由0.1M PB配制的30%蔗糖溶液中，4℃放置待腦沉底后取出，切取腦視神經(jīng)交叉根部與四疊體之間3～4mm的包含海馬層面的腦組織，用OCT包埋液氮速凍，行冰凍切片，片厚約40μm。逐一切片后，依次放入裝有0.1M PB的24孔板中。0.01M檸檬酸緩沖液微波修復(fù)后，采用SABC法進行免疫組織化學(xué)染色。

B組石蠟切片免疫組化貼片法:取腦后置于4%多聚甲醛室溫后固定24h后，常規(guī)石蠟脫水、包埋、切片約4μm。0.01M檸檬酸緩沖液微波修復(fù)后，采用SABC法進行免疫組織化學(xué)染色。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1小鼠一般行為學(xué)變化

小鼠注射匹羅卡品后平均15min左右出現(xiàn)節(jié)奏性咀嚼、肢體抽搐、吐涎等表現(xiàn)，甚至出現(xiàn)強直痙攣。本實驗造模過程中，小鼠癲癇大發(fā)作后死亡4只，成功造成SE模型16只。

2.2陽性結(jié)果大體觀察

A組冰凍切片漂片法：所有腦組織切片海馬齒狀回顆粒下區(qū)均可見DCX陽性神經(jīng)元細胞，染色背景清晰，對比明顯，但有小部分腦片染色不均，且部分腦片破損、碎爛(圖1)。

B組石蠟切片貼片法：所有腦組織切片海馬齒狀回顆粒下區(qū)均可見DCX陽性神經(jīng)元細胞，但腦片染色背景很深，不過基本上所有腦切片完整性保持較好(圖2) 。

圖1　冰凍切片漂片法顆粒下區(qū)DCX陽性　　　　　　　　　圖2　石蠟切片貼片法顆粒下區(qū)DCX陽性　神經(jīng)元的表達(×400)　神經(jīng)元的表達 (×400)

2.3海馬齒狀回顆粒下區(qū)DCX陽性神經(jīng)元計數(shù)分析

海馬齒狀回顆粒下區(qū)DCX陽性神經(jīng)元計數(shù)：冰凍切片漂片法陽性神經(jīng)元表達個數(shù)為(10.25±2.31)個，高于石蠟切片貼片法陽性神經(jīng)元表達個數(shù)(8.13±2.03)個(P<0.05)。

3討論

以匹羅卡品點燃大鼠癲癇模型具有同人類SE或顳葉癲癇相似發(fā)生、發(fā)展過程，如海馬門區(qū)神經(jīng)元的死亡、膠質(zhì)細胞增生、軸突絲狀芽生和突觸重建等，是理想的顳葉癲癇模型，常用于探討其機制及篩選抗癲癇藥物，另外還有其它化學(xué)藥物可制備癲癇動物模型如海人酸、戊四唑、青霉素等[2～5]。本實驗以匹羅卡品誘導(dǎo)建立SE模型，產(chǎn)生的行為表現(xiàn)與文獻報道一致，且實驗操作簡單方便，成功率高。

DCX是一種編碼微管相關(guān)蛋白，可促進微管聚合并穩(wěn)定其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。DCX作為研究神經(jīng)元遷移、分化、再生的標(biāo)記物，通過對其表達的研究可使我們了解神經(jīng)元的分化與再生情況。已有研究表明海人酸誘導(dǎo)的癲癇模型中，癲癇刺激后齒狀回顆粒下區(qū)DCX的表達明顯增加，并出現(xiàn)向細胞區(qū)遷移的趨勢[6～8]。本實驗結(jié)果顯示，所有SE模型小鼠腦組織切片在海馬齒狀回顆粒下區(qū)均可見DCX的明顯表達，且冰凍切片漂片法比石蠟切片貼片法的實驗效果好，染色背景清晰，對比明顯。

免疫組化常用的方法有漂片法和貼片法，但做共聚焦切片時，需要厚片一般30～50μm才能達到三維重建的效果。腦組織本身比較柔軟、含水量大等特點，造成腦組織免疫組化相對其他組織比較困難。冰凍切片最突出的優(yōu)點是能夠較完好地保存細胞在固定狀態(tài)的酶和抗原活性，出結(jié)果相對容易，但其缺點是不能長期存放，裱片時相當(dāng)困難，腦片易皺易破。而石蠟切片雖具有組織結(jié)構(gòu)保存良好、假陽性誤斷力減低、可永久保存的優(yōu)點，但制作過程較復(fù)雜，對組織損傷較大，難以保證連續(xù)切片。免疫組化過程中可能會碰到各種問題，要分析原因，去尋找相應(yīng)的解決辦法。本實驗在做免疫組化過程中，無論石蠟切片還是冰凍切片，都采用了微波熱修復(fù)抗原，可以提高陽性檢出率和陽性強度[9]。另外，為了克服爛片碎片，筆者認為需要注意以下幾點：①液氮速凍時，可以在腦組織周圍包裹適量OCT膠后，再將樣品連同樣品托放入液氮數(shù)10s左右，這樣可防止腦組織因冰凍不均而產(chǎn)生裂痕。②腦組織洗片時，不宜用移液槍正對腦片直接沖洗，或?qū)⒛X片吸入移液槍，或直接接觸腦片，槍頭應(yīng)貼壁、遠離腦組織。③裱片時，動作要輕柔，勿直接用毛筆牽拉腦片。

總之，匹羅卡品可成功誘導(dǎo)SE小鼠模型，小鼠致癇后其海馬齒狀回顆粒下區(qū)明顯可見DCX陽性神經(jīng)元的表達，其表達相對正常小鼠如何變化，有待進一步研究；通過兩種方法的對比，腦組織切片免疫組化染色采用冰凍切片漂片法效果優(yōu)于石蠟切片貼片法。

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[編輯]劉陽

[引著格式]鐘琴,張燕翔,錢鋒，等.腦組織冰凍切片漂片法與石蠟切片貼片法的免疫組化效果比較[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版)，2015，12(36):95～97.

[中圖分類號]R361

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]1673-1409(2015)36-0095-03

通信作者：

[作者簡介]鐘琴(1990-)，女，碩士生，主要從事醫(yī)學(xué)影像診斷研究工作；任伯緒，boxuren188@163.com。

[基金項目]荊州市2014年度科技發(fā)展計劃項目(2014AC47E)。