李　超，董浩迪，徐琳凱，王春雨，宋志琦，劉春法，李超斯，岳瑞超，程廣宇，

趙化佳，趙德明，尹曉敏，周向梅，楊利峰

( 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/國(guó)家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室，北京　100193)

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2014年北京地區(qū)嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的病理學(xué)評(píng)價(jià)

李超，董浩迪，徐琳凱，王春雨，宋志琦，劉春法，李超斯，岳瑞超，程廣宇，

趙化佳，趙德明，尹曉敏，周向梅，楊利峰

( 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/國(guó)家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室，北京100193)

【摘要】目的從病理學(xué)角度評(píng)價(jià)嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康情況，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)提供建議，確保相關(guān)科研結(jié)果的準(zhǔn)確性。 方法 本文主要對(duì)2014年10月北京市15家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位的嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理學(xué)抽檢情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采集嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心、肝、脾、肺、腎、大腸和小腸后經(jīng)甲醛鈣液固定，通過(guò)石蠟切片HE染色、PAS 染色、冰凍切片油紅O染色后于顯微鏡下觀察。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總體合格，但個(gè)別單位仍然存在問(wèn)題。檢出病變器官主要是肝臟和肺臟，肝臟病變檢出率小鼠為6%，大鼠為2.5%，豚鼠為8.2%，地鼠未檢出，肝臟病變表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，且經(jīng)特殊染色確證部分為脂肪變性；肺臟病變檢出率豚鼠為15.5%，其余未檢出，肺臟病變表現(xiàn)為淤血、滲出及間質(zhì)性肺炎。 結(jié)論 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理學(xué)檢測(cè)基本健康，肝臟出現(xiàn)損傷可能與飼料有關(guān)；而肺臟病變可能與墊料及空氣有關(guān)，而秋冬季霧霾及低溫可能對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康有所影響。

【關(guān)鍵詞】嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；病理學(xué)診斷；器官病變；油紅-O染色；PAS 染色

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的敏感性、準(zhǔn)確性及可重復(fù)性具有重要影響。北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例規(guī)定從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育工作的單位，應(yīng)當(dāng)根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，定期進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)室歷年承擔(dān)北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量抽查中的病理學(xué)檢查任務(wù)，本文就2014年10月北京市15家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位的嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康狀況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量總體合格，但個(gè)別單位仍然存在問(wèn)題，主要病變器官是肝臟和肺臟。分析肝臟出現(xiàn)損傷可能與飼料和墊料有關(guān)，而肺臟病變反映飼養(yǎng)環(huán)境有待改善。環(huán)境條件可影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量，環(huán)境控制程度越高，在該環(huán)境中的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化越高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果就更趨于穩(wěn)定一致[4]。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由中國(guó)食品藥品檢定研究院從北京市15家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位包括北京沙河通利實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)【SCXK(京)2013-0007】、斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司【SCXK(京)2014-0006】、北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2014-0008】、北京天壇生物制品股份有限公司【SCXK(京)2014-0005】、中國(guó)食品藥品檢定研究院【SCXK(京)2014-0013】、北京昌揚(yáng)西山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)【SCXK(京)2011-0010】、北大醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部【SCXK(京)2011-0001】、北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心【SCXK(京)2012-0004】、北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司【SCXK(京)2010-0001】、北京市海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠【SCXK(京)2011-0006】、維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(京)2012-0001】、北京芳元緣養(yǎng)殖場(chǎng)【SCXK(京)2014-0012】、北京?？葡槿饘?shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)【SCXK(京)2011-0009】、北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心【SCXK(京)2014-0003】及北京富龍騰飛養(yǎng)殖中心【SCXK(京)2013-0004】抽取不同品系的小鼠(BALB/c、KM、C57、裸鼠、NIH、ICR)、大鼠(Wistar、SD、Lewis)和豚鼠三種嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為 4 ～ 6 周齡(表1)。采樣工作在中國(guó)食品藥品檢定研究院【SYXK(京)2011-0037】動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行，制片及診斷在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)【SYXK(京)2013-0013】國(guó)家動(dòng)物性海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

表1　2014年10月嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采樣情況

1. 2實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1組織切片的制備和觀察

CO2窒息處死動(dòng)物，采集動(dòng)物的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、小腸和大腸，用甲醛鈣液(10%甲醛+1%氯化鈣)固定。按照常規(guī)方法制作石蠟切片，HE染色，OLYMPAS U-SRG數(shù)碼顯微鏡采圖并觀察。

1.2. 2肝臟油紅 O 染色

對(duì)于在 HE 染色下觀察疑似為脂肪變性的樣品肝臟，抽取部分進(jìn)行脂肪的油紅O 染色。具體步驟為：

1)組織塊用甲醛鈣液(10%甲醛+1%氯化鈣)固定一周，并于采樣后第二天換液;

2)制作肝組織冰凍切片，厚約10 μm;

3)用油紅O(5%)乙醇溶液染色約8 min;

4)用50%乙醇分化約30 s，自來(lái)水終止分化;

5)蘇木素復(fù)染核約1 min，自來(lái)水輕柔沖洗返藍(lán)約10 min;

6)甘油明膠封片，最后顯微鏡觀察。

1.2.3肝臟 PAS 染色

同時(shí)取做油紅 O 染色相同病例的肝組織做糖原的 PAS 染色。具體步驟為：

1)甲醛鈣液固定組織塊一周，并于采樣后第2天換液;

2)制作組織石蠟切片;

3)切片于梯度酒精中下行脫臘至水;

4)高碘酸液氧化5 min，蒸餾水洗2次;

5)切片置于密封Schiff 氏試劑中于37℃溫箱里染色30 min;

6)蒸餾水洗2次后，蘇木素復(fù)染10 min;

7)0.5%鹽酸酒精分化約10 s，自來(lái)水沖洗;

8)經(jīng)95%酒精及無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片觀察。

2結(jié)果(彩圖見(jiàn)封3)

2.1實(shí)驗(yàn)鼠的肝臟病理學(xué)變化及統(tǒng)計(jì)

2.1.1鏡下病變

本次調(diào)查表明，肝臟以細(xì)胞腫脹變性為主，與正常對(duì)照(圖1A)比較，病變樣本鏡下可見(jiàn)肝索結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞體積變大，內(nèi)有大小不等、數(shù)量不等的空泡，肝細(xì)胞核深藍(lán)染，大小不一，可清楚地觀察到枯否氏細(xì)胞和少量的新生細(xì)胞，肝血竇內(nèi)有大量紅細(xì)胞(圖1B)。對(duì)肝細(xì)胞腫脹樣本進(jìn)行油紅O染色，陽(yáng)性可見(jiàn)藍(lán)染肝細(xì)胞輪廓及細(xì)胞核，胞質(zhì)中可見(jiàn)大量大小不一的圓形紅色脂滴(圖1C)。病變肝臟同時(shí)進(jìn)行PAS染色可見(jiàn)陽(yáng)性樣本肝細(xì)胞胞漿部分呈紫紅色即是糖原物質(zhì)沉著的區(qū)域，與未著色部分的淡粉色形成明顯對(duì)比，胞核呈深紅著色(圖1D)。

2.1.2病變樣本統(tǒng)計(jì)

結(jié)果顯示100例小鼠樣本中，HE染色肝細(xì)胞腫脹有11例，其中輕度變性5例，中度6例，病變率為6%。油紅O染色未檢出脂肪變性，PAS染色確證其中4例為糖元沉積，特殊染色均呈陰性的細(xì)胞腫脹病例，可能是動(dòng)物死后血管滲透性增大，血管中血漿成分滲入細(xì)胞中所造成；大鼠肝細(xì)胞腫脹變性程度總體輕微，40例大鼠樣本中，HE染色肝細(xì)胞腫脹有1例，病變率2.5%。并由PAS染色確證為糖原沉積；豚鼠肝細(xì)胞腫脹變性病例相對(duì)較多，程度較嚴(yán)重，110例豚鼠樣本中，HE染色細(xì)胞腫脹有21例，輕度12例，中度9例，病變率為8.2%。其中確證7例為脂肪變性，8例為糖元沉積，剩余6例可能由于死后血管通透性增大，血液成分滲出所致；10例地鼠樣本肝臟均未見(jiàn)明顯病變。

2.2實(shí)驗(yàn)鼠的肺臟病理學(xué)變化及統(tǒng)計(jì)

2.2.1鏡下變化

肺臟病變主要以淤血、滲出及間質(zhì)性肺炎為主，與正常對(duì)照(圖1E)比較，病變樣本低倍鏡下可見(jiàn)肺組織密度增大，不見(jiàn)特征性肺泡結(jié)構(gòu)，肺靜脈、肺間隔以及肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量紅細(xì)胞，有的靜脈內(nèi)有大量蛋白樣液體，細(xì)支氣管上皮脫落，細(xì)支氣管周?chē)g質(zhì)有深染細(xì)胞聚集，肺泡隔增厚(圖1F)；高倍鏡下，細(xì)支氣管周深染細(xì)胞為淋巴樣細(xì)胞，肺間隔內(nèi)有增生的肺泡上皮細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞，紅細(xì)胞位于毛細(xì)血管內(nèi)，肺泡中有少量紅細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞、塵細(xì)胞及脫落上皮細(xì)胞，有的紅細(xì)胞崩解成均質(zhì)紅染團(tuán)塊。

2.2.2病變樣本統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，小鼠、地鼠肺臟未見(jiàn)明顯異常；大鼠肺臟以淤血、間質(zhì)增厚、肺泡腔漿液滲出為主，但無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，判斷為由于處死窒息造成的肺組織結(jié)構(gòu)異常。其中肺臟充血、淤血、肺泡腔漿液滲出可能為窒息處死造成的組織學(xué)反應(yīng)，而血管淤血可導(dǎo)致輕度的間質(zhì)增厚；110例豚鼠肺臟樣本中，出現(xiàn)31例異常病例，其中17例為嚴(yán)重的淤血、間質(zhì)增厚、肺泡腔漿液滲出，病變率為15.5%。

2.3實(shí)驗(yàn)鼠其他器官的病理學(xué)變化及統(tǒng)計(jì)

2.3.1心臟病變

豚鼠心臟檢出1例出血性心肌炎，表現(xiàn)為急性心外膜出血、心肌出血，低倍鏡下，心外膜充血、出血，心外膜增厚，心肌纖維之間血管破裂出血(圖1G)；高倍鏡下，心肌纖維之間充滿紅細(xì)胞，同時(shí)有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。可能與死前掙扎有關(guān)，由于窒息缺氧使血管通透性增加；腎上腺素分泌增多，使小血管、毛細(xì)血管內(nèi)壓升高發(fā)生破裂。

2.3.2脾病變

此外大鼠新發(fā)現(xiàn)1例脾組織含鐵血黃素沉著，鏡下可見(jiàn)脾臟紅髓內(nèi)少量出血和含鐵血黃素沉著(圖1H)，說(shuō)明可能存在陳舊性出血，可能是窒息死亡較慢，缺氧導(dǎo)致血管通透性增大、脾臟紅細(xì)胞增多，血管中紅細(xì)胞進(jìn)入組織后被吞噬細(xì)胞分解導(dǎo)致。

2.3.3腎臟病變

大鼠腎臟以腎小管，集合管官腔中出現(xiàn)均質(zhì)粉染滲出為主要病變，但未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，很可能是由于死后血管通透性升高，血漿成分滲出而形成(圖1I)。豚鼠腎臟檢出3例腎淤血、出血及蛋白管型，可能是由于處死應(yīng)激造成。

3討論

3.1結(jié)論

肝臟病變主要出現(xiàn)于小鼠和豚鼠，小鼠肝細(xì)胞腫脹主要由于糖元沉積造成，而豚鼠肝細(xì)胞脂肪變性和糖元沉積參半。

肺臟病變主要發(fā)生于豚鼠，表現(xiàn)為肺臟淤血、滲出及間質(zhì)性肺炎。

全部鼠的小腸、大腸等臟器在鏡下無(wú)明顯病理變化。

綜上所述，絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)用嚙齒動(dòng)物為健康狀態(tài)，排除由于處死過(guò)程造成的組織學(xué)病理變化，非健康動(dòng)物主要以肝臟，肺臟病變?yōu)橹鳌５w上看，各送檢單位的實(shí)驗(yàn)用鼠各器官病變發(fā)生率均在合格范圍內(nèi)，病理學(xué)檢測(cè)基本健康。

3.2分析

此次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)主要病變發(fā)生于肝臟和肺臟。

3.2.1肝臟病變反映的問(wèn)題

結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境級(jí)別來(lái)看，肝臟病變?cè)谒?00例普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中有7例，占7%，所有110清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中有6例，占5.5%，全部50例SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中有3例，占6%，肝臟病變?cè)谌齻€(gè)級(jí)別均有發(fā)生，且發(fā)生率差別極小(均值6.2%，極差1%，標(biāo)準(zhǔn)差0.6)。

通常肝臟病變反映進(jìn)食情況，而數(shù)據(jù)顯示不論動(dòng)物級(jí)別如何，肝臟均有一定程度病變，說(shuō)明肝臟損傷可能與飼料有關(guān)，而各受檢單位均使用目前市場(chǎng)上的成品飼料商品，可見(jiàn)其原料質(zhì)量及配方有待規(guī)范。而飲水來(lái)源則根據(jù)級(jí)別要求使用自來(lái)水或高壓滅菌自來(lái)水，故不排除自來(lái)水水質(zhì)如微生物含量，重金屬、消毒劑及農(nóng)藥殘留和硬度等對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康的影響。秋冬季低溫同樣不容忽視，在低溫環(huán)境下動(dòng)物能量代謝加強(qiáng)，需要通過(guò)增加采食量來(lái)維持熱平衡，如果飼料供應(yīng)不足，同樣會(huì)引起營(yíng)養(yǎng)不良和抗病力下降，飼料充足又易造成脂肪沉積，動(dòng)物患肥胖病，故應(yīng)注意固定飼喂次數(shù)及進(jìn)食量。

3.2.2肺臟病變反映的問(wèn)題

結(jié)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境級(jí)別分析，肺臟病變?cè)谌?00例普通級(jí)有15例，占比例較高(15%)，在全部110例清潔級(jí)有2例，所占比例較低(1.8%)，全部50例SPF級(jí)中無(wú)檢出病例(0%)，可見(jiàn)各級(jí)別肺臟病變發(fā)生率差異顯著(極差15%，標(biāo)準(zhǔn)差6)，且動(dòng)物級(jí)別越低，肺臟病變?cè)矫黠@。

肺臟病變主要反映飼養(yǎng)環(huán)境空氣情況?？梢?jiàn)普通級(jí)動(dòng)物的空氣及墊料有待改善，原因可能有墊料不合格、飼養(yǎng)密度過(guò)大、秋冬季霧霾天氣及低溫影響等。劣質(zhì)的墊料碎屑及塵埃較多，極易造成異物刺激引發(fā)肺部炎癥。秋飼養(yǎng)間密度過(guò)大、通風(fēng)不和飼養(yǎng)員清理不及時(shí)，室內(nèi)的氣味(臭味、氨味)濃度就大，空氣不潔可誘發(fā)氣管炎、肺炎等。開(kāi)放系統(tǒng)很大程度依賴于自然環(huán)境空氣質(zhì)量，而北京地區(qū)秋季的霧霾嚴(yán)重，空氣欠佳，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟也有所影響。而秋冬季的低溫也是動(dòng)物凍傷、感冒、支氣管炎和肺炎等疾病的直接誘因。

對(duì)比歷年肺臟病變檢出率可見(jiàn)(圖2)，歷年發(fā)生率呈波動(dòng)趨勢(shì)，且秋季較為高發(fā)，幾次肺臟病變檢出率高峰(2011年、2013年)均發(fā)生于秋季，更加說(shuō)明秋冬季霧霾天，空氣中可吸入顆粒物密度大，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺部病變有不可忽視的影響[1-2]。

圖2　2010年春至2014年秋北京市嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟病變檢出率Fig.2　The detectable rate of pulmonarydiseasesof rodent laboratory animal from 2010 to 2014

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[2]呂悅,付永瑤,王繼宏,等. 2014年春季北京地區(qū)嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康狀況的病理學(xué)調(diào)查和分析[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2014,4:6-10.

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[5]McGavin, M. Donald/Zachary, JamesF.,Ph.D., Pathologic Basis of Veterinary Disease. fourth edition, Elsevier Science Health Science div, 2006-2008.

〔修回日期〕2015-04-07

調(diào)查報(bào)告

Assessing the quality of rodent laboratory animals in

Beijing area by pathological diagnosis in October 2014

LI Chao，DONG Hao-di，XU Lin-kai，WANG Chun-yu，SONG Zhi-qi，LIU Chun-fa，LI Chao-si，YUE Rui-chao，

CHENG Guang-yu，ZHAO Hua-jia，ZAO De-ming，YIN Xiao-min，ZHOU Xiang-mei，YANG Li-feng

( Veterinary Medicine，China Agricultural University / National Animal TSE Laboratory，Beijing 100193，China)

【Abstract】ObjectiveTo assess the health status of rodent laboratory animals by pathological diagnosis, our lab has being take apart in investigating the quality of laboratory animals in Beijing area for years and offer some advices for standardized breeding to ensure accurate results of scientific research. This paper focuses on the analysis of laboratory rodent samples that collected in October 2014. Methods We collected the heart, liver, spleen, lung, kidney, large intestine and small intestine, and put these organs into 10%Calcium formaldehyde solution for fixation, and then prepared into two different sections for optical microscopy observation including all paraffin specimens stained with H&E and the frozen sections stained with Oil Red-O and PAS． ResultsThe vast majority of laboratory rodents were up to standard, but there still a problem in individual units. The main problem is liver and lung disease. The rate of Hepatocyte swellingis 6% (mouse), 2.5% (rat), 8.2% (guinea pig), moreover part of them were lipidosis, according to Oil Red-O stain. the mainly problem of lung is congestion ,edema and Interstitial pneumonia ,the detectable rate of pulmonarydiseases is 15.5%(guinea pig). ConclusionsThe vast majority of laboratory rodents were pathologically diagnosed as healthy animals．The liver disease may be caused by improper feeding.And disease of lung may led by haze, unqualified bedding and low temperature.

【Key words】Laboratory rodents；Pathological diagnosis；Organ diseases；Oil red-ostain；PAS stain

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.016

【中圖分類(lèi)號(hào)】R332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 05-0067-04

[通訊作者]楊利峰，副教授，研究方向：動(dòng)物病理學(xué)及Prion疾病致病機(jī)制研究，Email:yanglf@ cau.edu.cn。

[作者簡(jiǎn)介]李超(1990-)，女，碩士生，研究方向：動(dòng)物醫(yī)學(xué)病理診斷方面研究，Email:924313054@qq.com。

[基金項(xiàng)目]國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BAI15B01)。