徐玉環(huán)，徐艷峰，劉　穎，黃　瀾，李彥紅，韓云林，鄧　巍，

許慶剛2，秦　川1，朱　華1

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,北京　100021;

2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院,北京　100730)

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視網(wǎng)膜血管鋪片技術(shù)的改進(jìn)

徐玉環(huán)1，徐艷峰1，劉穎1，黃瀾1，李彥紅1，韓云林1，鄧巍1，

許慶剛2，秦川1，朱華1

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,北京100021;

2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院,北京100730)

【摘要】目的探討視網(wǎng)膜血管鋪片技術(shù)的改進(jìn)及在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠，大鼠，狗和猴中的應(yīng)用。 方法 應(yīng)用蛋白酶K-胰蛋白酶聯(lián)合消化法制備視網(wǎng)膜血管鋪片，行HE及PAS染色觀察血管形態(tài)，免疫組化方法觀察CD31及VEGF的表達(dá)。結(jié)果用改進(jìn)方法制備的視網(wǎng)膜血管鋪片，血管網(wǎng)完整，無(wú)神經(jīng)組織殘留，可清晰顯示血管走向。各級(jí)血管形態(tài)清晰，血管分支清楚完整，無(wú)斷裂現(xiàn)象。血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)清晰。CD31在血管周細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)；VEGF主要在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。結(jié)論改進(jìn)的視網(wǎng)膜血管鋪片技術(shù)可成功應(yīng)用于不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為視網(wǎng)膜血管性疾病的研究提供了重要途徑。

【關(guān)鍵詞】視網(wǎng)膜血管鋪片; 聯(lián)合消化法; 抗原修復(fù)

視網(wǎng)膜是由大腦向外延伸的視覺(jué)神經(jīng)末梢組織，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、精細(xì)、脆弱而代謝旺盛。其血管屬于終末血管系統(tǒng)，任何病理性的破壞和血管梗阻等引起的組織缺氧，均能導(dǎo)致組織壞死，使其喪失感受和傳導(dǎo)光刺激的功能。因此血管改變是視網(wǎng)膜病變的重要特點(diǎn)。視網(wǎng)膜血管鋪片是研究視網(wǎng)膜血管病變的重要技術(shù)。但這項(xiàng)技術(shù)的消化時(shí)間不宜掌握，展片難度大，很難制備出理想的視網(wǎng)膜血管鋪片。國(guó)內(nèi)外學(xué)者多采用胰蛋白酶直接消化或胃蛋白酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化制備視網(wǎng)膜血管鋪片。在本研究中，我們總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)，不斷摸索改進(jìn)，建立了新的視網(wǎng)膜血管鋪片技術(shù)，現(xiàn)總結(jié)如下。

1材料和方法

1.1材料

BALB/c小鼠來(lái)源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(軍)2012-0004】，SD大鼠購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究中心【SCXK(京)2012-0001】，SYXK(京)2013-0019。犬購(gòu)自北京日新科技有限公司【SCXK(京)2011-0007】，恒河猴由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供【SCXK(京)2014-0011】，SYXK(京)2010-0030。蘇木素及伊紅Y染色液均為國(guó)產(chǎn)試劑(益利精細(xì))，高碘酸(批號(hào)011108，北京)，Schiff(UFG0108，上海)， Proteinase K (CALBIOCHEM, cat#539480)，Trypsin 1:250 Porcine Pancreas(AMRESCO, lot#2861C173), anti-CD31 antibody(ABCAM, ab28364), anti-VEGF antibody(BOSTER，cat#BA0407), 兔超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑 (中杉金橋，PV-9001)。正常羊血清工作液(中杉金橋，ZLI-9056)，抗體稀釋液(中杉金橋，ZLI-9030)。

1.2方法

1.2.1大鼠視網(wǎng)膜血管鋪片的制備

大鼠脫頸椎法處死，摘取眼球，固定于10%中性福爾馬林。

沿距齒緣剪開(kāi)眼球去除晶狀體，用蒸餾水漂洗，以視神經(jīng)乳頭為中心將眼球壁均勻地剪成4份，剝離眼球壁視網(wǎng)膜層，再用蒸餾水漂洗。

將剝離出的視網(wǎng)膜放在蒸餾水中37℃孵育1～2 h，蒸餾水漂洗，孵育后的視網(wǎng)膜放入1 g/L的蛋白酶K中，56℃消化13～17min，去除消化掉的感光層細(xì)胞，蒸餾水漂洗，再將視網(wǎng)膜層放入3%胰蛋白酶消化液中，37℃消化40～60 min。

用吸管將半透明狀的血管網(wǎng)移入蒸餾水中漂洗，用吸管輕輕吹打非透明狀區(qū)域，直到血管網(wǎng)成透明狀, 再將吹打成透明狀的血管網(wǎng)鋪到含多聚賴氨酸的載玻片上，展平，自然干燥。

在消化過(guò)程中，蛋白酶k消化時(shí)，每5 min輕柔搖動(dòng)一次，再以最低完成消化時(shí)間為觀察起點(diǎn)：蛋白酶K消化13 min時(shí)，肉眼觀察，輕柔搖動(dòng)，若見(jiàn)感光層細(xì)胞脫落，即完成第一步消化。若消化不完全，每2 min輕柔搖動(dòng)觀察一次，直至感光層脫落。胰蛋白酶消化時(shí)，每10 min輕柔搖動(dòng)一次，也是以最低完成消化時(shí)間為觀察起點(diǎn)，若消化不完全，每5min輕柔搖動(dòng)觀察一次。

1.2.2不同動(dòng)物的視網(wǎng)膜在消化酶中的消化時(shí)間

在大鼠鋪片基礎(chǔ)上，我們摸索了BALB/c小鼠，犬和恒河猴視網(wǎng)膜血管鋪片的消化時(shí)間表1。BALB/c小鼠眼球小，在剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜層之前，要將眼球壁均勻剪成2份。犬和恒河猴眼球較大，結(jié)構(gòu)特殊，取材后需立即固定4h，再用鋒利的刀片在眼球的上下部各切開(kāi)一個(gè)小口，繼續(xù)固定24h。將眼球壁均勻地剪成若干等份，每一等份大小約0.4 cm×0.4 cm，再剝離視網(wǎng)膜層。

表1　不同動(dòng)物的視網(wǎng)膜在消化酶中的消化時(shí)間

1.2.3視網(wǎng)膜血管鋪片HE染色

將視網(wǎng)膜血管鋪片置于自來(lái)水中水化15 min，蘇木蘇染核1 min，自來(lái)水沖洗，伊紅復(fù)染2 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。

1.2.4視網(wǎng)膜血管鋪片PAS染色

PAS染色方法參照文獻(xiàn)[1]：將視網(wǎng)膜血管鋪片置于自來(lái)水中水化15 min，蒸餾水洗2次，加入高碘酸氧化10 min，蒸餾水速洗2次，加入schiff試劑反應(yīng)5 min，自來(lái)水流水沖洗2 min，蘇木素染核2 min，自來(lái)水返藍(lán)5 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。

1.2.5視網(wǎng)膜血管鋪片免疫組化染色

免疫組化染色方法參照文獻(xiàn)[2]，略有改變：①將視網(wǎng)膜血管鋪片置于PBS中水化15 min；②微波中火修復(fù)5 min；③3%雙氧水封閉15 min；④正常羊血清工作液封閉20 min；⑤滴加用抗體稀釋液稀釋的一抗(CD31稀釋度為1∶50；VEGF稀釋度為1∶200)，室溫孵育1.5 h；⑥滴加二抗試劑1，室溫孵育10 min；⑦滴加二抗試劑2，室溫孵育10 min； ⑧ DAB顯色；⑨蘇木素復(fù)染4 s;⑩梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片

2結(jié)果

2.1大鼠視網(wǎng)膜血管鋪片

經(jīng)HE及PAS染色可見(jiàn)：鋪片完整，清晰顯示血管走向。各級(jí)血管形態(tài)清晰，血管分支清楚完整，無(wú)斷裂現(xiàn)象。細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞核可清晰顯示(彩插12圖1)。

酶消化會(huì)造成部分抗原的丟失，因此需要對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)。修復(fù)溫度太低造成修復(fù)不完全，溫度太高又會(huì)脫片。經(jīng)過(guò)摸索，我們發(fā)現(xiàn)，微波中火5min即可將抗原修復(fù)。免疫組化結(jié)果顯示：CD31和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在正常大鼠鋪片均有表達(dá)：CD31在血管周細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)；VEGF主要在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。

2.2小鼠、狗、猴視網(wǎng)膜鋪片

根據(jù)大鼠鋪片經(jīng)驗(yàn)，我們摸索了BALB/c小鼠，犬和恒河猴的視網(wǎng)膜血管鋪片消化時(shí)間。經(jīng)HE及PAS染色，可見(jiàn)血管網(wǎng)完整，無(wú)神經(jīng)組織殘留。各級(jí)血管結(jié)構(gòu)清楚，大動(dòng)物小動(dòng)脈可顯示血管壁的平滑肌。毛細(xì)血管網(wǎng)由內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞組成，細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清楚(彩插12圖2)。

3討論

1960年Kuwabara[3]用胰蛋白酶對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行消化制備了視網(wǎng)膜血管鋪片，為視網(wǎng)膜血管的研究提供了一種新的手段。1963年Ashton[4]改進(jìn)了Kuwabara的方法，用胃蛋白酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化法，成功制備了貓的視網(wǎng)膜血管鋪片。此后又經(jīng)過(guò)各國(guó)學(xué)者的不斷努力[5-8]，才有了今天的技術(shù)基礎(chǔ)。

視網(wǎng)膜血管消化鋪片技術(shù)難度較大：消化不完全，鋪片不能充分顯示出血管。消化過(guò)度，又會(huì)造成血管結(jié)構(gòu)不清晰，甚至斷裂，直接影響對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察和分析。蛋白酶K是一種高活性蛋白酶，能快速、有效地裂解組織細(xì)胞，因此在本研究中，我們選擇先用蛋白酶K消化掉視網(wǎng)膜感光層細(xì)胞。同時(shí)，蛋白酶K能穿透細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞核，于是我們將視網(wǎng)膜層漂洗后再移入到3%胰蛋白酶中進(jìn)一步消化。應(yīng)用蛋白酶K-胰蛋白酶聯(lián)合消化法，成功制備了不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的視網(wǎng)膜血管鋪片。

視網(wǎng)膜血管鋪片制備過(guò)程中，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①眼球的固定：大、小鼠眼球取材后直接固定于10%中性福爾馬林24 h以上。狗和猴眼球組織結(jié)構(gòu)特殊，各部分組織結(jié)構(gòu)的軟硬度不同，因此取材后立即固定4 h，再用鋒利的刀片在眼球的上下部各切開(kāi)一個(gè)小口，繼續(xù)固定24 h。由于固定液易造成視網(wǎng)膜血管的斷裂，因此固定時(shí)間最好不超過(guò)72 h。②視網(wǎng)膜的剝離：視網(wǎng)膜位于眼球壁的內(nèi)層，組織比較薄，而且附著在色素層上，剝離過(guò)程中很容易破碎。因此去除晶狀體后，以視神經(jīng)乳頭為中心，將眼球壁剪開(kāi)成若干等份，輕輕剝離出視網(wǎng)膜。③血管的消化：消化過(guò)程中，隨時(shí)注意觀察。蛋白酶K消化能力極強(qiáng)，每5 min輕微搖動(dòng)一次，再以最低完成消化時(shí)間為觀察起點(diǎn)，每2 min輕柔搖動(dòng)一次，待肉眼可見(jiàn)感光層脫落即可終止消化。換成胰蛋白酶消化時(shí)，每10 min輕微搖動(dòng)一次，再以最低完成消化時(shí)間為觀察起點(diǎn)，每5 min輕柔搖動(dòng)一次，待可見(jiàn)半透明血管網(wǎng)即終止消化。④鋪片：將消化好的血管網(wǎng)漂洗干凈，平鋪于含多聚賴氨酸的載玻片上，不要將載玻片上的水吸干凈，否則未貼壁的血管網(wǎng)漂移，影響對(duì)血管走向的觀察。⑤抗原修復(fù)：常規(guī)微波修復(fù)石蠟切片需要高火3 min，中火5 min，再低火3 min。而視網(wǎng)膜血管鋪片只需中火5 min即可完成抗原修復(fù)。

蛋白酶K-胰蛋白酶聯(lián)合消化法制備大鼠視網(wǎng)膜血管鋪片成功率高，穩(wěn)定性好，同時(shí)也適用于不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為視網(wǎng)膜血管性疾病的研究提供了重要途徑。

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[2]朱華，徐艷峰，劉穎，等. 鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病恒河猴胰島細(xì)胞數(shù)量的變化[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志. 2012, 22(12): 1-3.

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〔修回日期〕

技術(shù)方法

A modification of retinal vascular preparation

XU Yu-huan1，XU Yan-feng1，LIU Ying1，HUANG Lan1，LI Yan-hong1，

HAN Yun-lin1，DENG Wei1，XU Qing-gang2，QIN Chuan1，ZHU Hua1

(1. Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of medical Sciences. Key Laboratory of Human

Disease Comparative Medicine, Ministry of Health, Key Laboratory of Human Diseases Animal Model, State

Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100021, China; 2. Beijing Tongren Hospital Capital

Medical University, Beijing 100730, China)

【Abstract】ObjectiveTo improve the method of retinal vascular preparation and application in experimental animals of mice, rats, dogs and monkeys. Methods The retinal vessels were isolated with proteinase K-trypsin digestion technique. The samples were stained by hematoxylin-eosin(HE) and Periodic-Acid Schiff(PAS). The expression of CD31 and VEGF were detected by immunohistochemistry(IHC). ResultsThe spread sheets of vascular network are complete, and can clearly show the blood vessels. No nerve tissue residue is left. Different levels of vascular morphology are clear. The vascular branches are clear and complete with no fracture. The cell morphology is intact, and the cell nucleus is clearly dispayed. The entire process can be completed in a short time, and has a high success rate. The vascular antigen are successfully retained: Expression of CD31 can be seen in both pericytes and endothelial cells; VEGF is mainly expressed in endothelial cells. ConclusionsThe improved method is successfully applied in different experimental animals. This approach will provide an important contribution to the retinal vascular disease research.

【Key words】Retinal vascular preparation；Combined digestion；Antigen retrieval

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.012

【中圖分類(lèi)號(hào)】R332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 05-0051-04

[通訊作者]朱華(1971-),女，主任技師，研究方向：病理與病理生理學(xué)。E-mail： zhh@cnilas.org。

[作者簡(jiǎn)介]徐玉環(huán)(1980-),女，初級(jí)技師。E-mail: yuhuanxu1109@163.com。

[基金項(xiàng)目]國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973項(xiàng)目)(2011CB504903)。