尹玉偉，孫 平，孫 杰，王書(shū)文，張紀(jì)亮，熊建利

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng)　471003)

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親代三丁基錫暴露對(duì)F1代KM小鼠血常規(guī)的影響

尹玉偉，孫 平，孫 杰，王書(shū)文，張紀(jì)亮，熊建利

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng)471003)

【摘要】目的 探討親代三丁基錫暴露對(duì)F1昆明小鼠血常規(guī)的影響。方法將雌、雄各40只小鼠隨機(jī)分別分為空、低、中、高濃度組(0、0.2、2和20 μg/kg)，每天進(jìn)行染毒，持續(xù)45 d。在第60天時(shí)，將同濃度組的雌:雄鼠按1:1進(jìn)行同籠配種。仔鼠出生60 d后取血，進(jìn)行血常規(guī)的檢測(cè)。結(jié)果與對(duì)照組相比，F(xiàn)1代雄性低濃度和高濃度組的紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白量顯著增加(P < 0.01)；F1代雄性低濃度組紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白含量(P < 0.01)和淋巴細(xì)胞絕對(duì)值(P < 0.05)顯著降低；F1代雌性高濃度組的紅細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P < 0.01), F1代雌性小鼠的血紅蛋白量、紅細(xì)胞壓積、血小板量三項(xiàng)指標(biāo)隨著TBT濃度的增加呈劑量依賴(lài)性。結(jié)論親代TBT暴露影響F1代小鼠的血常規(guī)，且低濃度時(shí)對(duì)F1代雄性小鼠的影響最大，高濃度時(shí)對(duì)F1代雌性小鼠的影響最大。

【關(guān)鍵詞】三丁基錫；小鼠；血常規(guī)指標(biāo)

有機(jī)錫因具有良好的殺菌滅藻以及防止軟體海洋生物附著于船體的功能而被廣泛用于船體和海洋建筑表面，但防污的同時(shí)它對(duì)海洋環(huán)境和海洋動(dòng)物造成嚴(yán)重的影響[1]，三丁基錫(tributyltin，TBT)被認(rèn)為是迄今為止由人為因素大量進(jìn)入海水環(huán)境的最毒的化學(xué)品之一[2]。目前在海水[3-4]、底泥[5-7]、紡織品[8-9]和尿樣[10]中均發(fā)現(xiàn)有機(jī)錫化合物的存在。海洋生物對(duì)TBT有很強(qiáng)的富集能力，使TBT通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類(lèi)的健康構(gòu)成潛在威脅[11]。駱煥榮等[12]的研究表明，人TBT急性中毒時(shí)表現(xiàn)出嚴(yán)重的胃腸系統(tǒng)毒性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性和腎臟毒性。近年來(lái)報(bào)道，TBT不僅具有急性毒性，還具有遺傳毒性、免疫毒性和環(huán)境內(nèi)分泌干擾毒性[13]。D.阿那尼等[14]的研究表明，氯化二丁基錫對(duì)雌性小鼠有生殖毒性，在劑量≥0.05 μg/kg作用下，母鼠食欲不振，體重下降，陰道、子宮萎縮，懷胎數(shù)下降等。鑒于TBT的廣泛地毒性，人們對(duì)其致毒機(jī)制進(jìn)行深入的探究。

血液在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定上起著重要的作用，具有運(yùn)輸、緩沖、營(yíng)養(yǎng)和防御等功能[15]。劉鳳軍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠鉬中毒時(shí)，嚴(yán)重影響小鼠的血常規(guī)。呂良炬等[17]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)家兔分別進(jìn)行0.03、0.3、3 mg/kg TBT和TBT的急性注射實(shí)驗(yàn)，觀察到TBT和TBT導(dǎo)致家兔的心率和動(dòng)脈血壓產(chǎn)生劑量依賴(lài)性的下降。張朝紅等[18]的研究表明，TBT與牛血清白蛋有明顯的相互作用，且程度和方式與濃度、酸度和有機(jī)溶劑等因素有關(guān)。然而親代TBT攻毒對(duì)子代小鼠血常規(guī)的影響尚未知，鑒于此，本實(shí)驗(yàn)以不同濃度的TBT暴露親代小鼠，研究對(duì)子代小鼠血常規(guī)產(chǎn)生的影響。

1材料和方法

1.1試劑與儀器

1.1.1試劑與配制方法

TBT(純度 ≥ 97%，F(xiàn)luka公司，4℃保存)，西王玉米胚芽油(山東西王食品有限公司)。

TBT母液配制：a．配180 μg/mL濃度的母液：用移液槍取10850 μL的玉米油裝入棕色廣口瓶中，在用移液槍取1.6 μLTBT注入該瓶中，混勻，即得到母液；b．用鋁箔紙將其全封住，放入4℃冰箱內(nèi)保存。

1.1.2主要儀器

電子天平(10200-3-G)(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)；不同量程的微量移液槍若干(鄭州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；XF9080A動(dòng)物血液自動(dòng)分析儀(南京皓海儀器)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)，4～5周KM小鼠，體重16～18 g，雌、雄各40只，飼養(yǎng)期間給予嚙齒類(lèi)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(豫)2010-0002】,飼養(yǎng)于洛陽(yáng)普萊柯生物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障系統(tǒng)【SYXK(豫)2013-0003】。12 h循環(huán)光照，室溫(23±2)℃，恒定濕度，自由飲食。并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則，給予人道關(guān)懷。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1親代(F0代)TBT暴露

F0代TBT暴露，將80只小鼠隨機(jī)分成8組(♂：4組；♀：4組)，每組10只，分別飼喂玉米油對(duì)照組(CK組)，0.2 μg/kg TBT低濃度組(LTBT組)，2 μg/kg TBT中濃度組(MTBT組)和20 μg/kg TBT高濃度組(HTBT組)。將TBT母液稀釋注入質(zhì)量為2 g左右的長(zhǎng)條狀胡蘿卜中，每天上午定時(shí)飼喂小鼠，對(duì)照組飼喂含玉米油的胡蘿卜，每天中午進(jìn)行檢查，對(duì)已經(jīng)吃完胡蘿卜的小鼠，在料槽中添加全價(jià)飼料，沒(méi)有吃完的等到吃完后再進(jìn)行添加。每3 d稱(chēng)重一次并記錄，計(jì)算下一次用藥量。暴露持續(xù)45 d。

1.3.2子代(F1代)小鼠血樣采集

F0代暴露結(jié)束后的第10天時(shí)，將同濃度組的雌:雄鼠按1∶1進(jìn)行同籠配種。仔鼠在出生后到達(dá)20日齡左右，斷奶并將雌、雄分籠飼養(yǎng)。F1代子鼠到達(dá)60日齡時(shí)，F(xiàn)1代小鼠體重在40～45 g，每一濃度組隨機(jī)取出雌、雄小鼠各6只進(jìn)行摘眼球取血，對(duì)血樣進(jìn)行常規(guī)檢查包括以下項(xiàng)目：紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、平均血紅蛋白量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差(RDW-SD)、紅細(xì)胞體積分布寬度變異系數(shù)(RDW-CV)、白細(xì)胞數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞百分比(LYM)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值(LYMPH)、大型血小板比率(P-LCR)、血小板分布寬度(PDW)、平均血小板體積(MPV)、血小板(PLT)。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和兩兩比較(LSD)，P< 0.05為顯著，P< 0.01為極顯著。

2結(jié)果

2.1親代TBT暴露對(duì)F1代雄性血常規(guī)的影響

如表1所示：與對(duì)照組相比：LTBT組在RBC數(shù)目增多極顯著(P< 0.01)、HGB含量升高顯著(P< 0.05)、MCV降低極顯著(P< 0.01)、MHC降低極顯著(P< 0.01)、RDW-SD降低極顯著(P< 0.01)、LYMPH降低顯著(P< 0.05)、P-LCR降低極顯著(P< 0.01)、PDW減小極顯著(P< 0.01)、MPV縮小極顯著(P< 0.01)；MTBT組在RDW-SD降低極顯著(P< 0.01)、P-LCR降低顯著(P< 0.05)；HTBT組在RBC數(shù)目增多極顯著(P< 0.01)、HGB含量升高極顯著(P< 0.01)、HCT升高顯著(P< 0.05)、RDW-SD降低顯著(P< 0.01)、P-LCR降低極顯著(P< 0.01)、PDW減少極顯著(P< 0.01)、MPV縮小極顯著(P< 0.01)。

2.2親代TBT攻毒對(duì)F1代雌性血常規(guī)

如表2所示：與對(duì)照組相比，LTBT組在HGB含量升高極顯著(P< 0.01)、HCT升高極顯著(P< 0.01)、PLT數(shù)目增加顯著(P< 0.05)；MTBT組在HGB含量升高極顯著(P< 0.01)、HCT升高極顯著(P< 0.01)、RDW-SD升高極顯著(P< 0.01)、RDW-CV升高極顯著(P< 0.01)、PLT數(shù)目增多極顯著(P< 0.01)、MCHC指標(biāo)顯著降低(P< 0.05)；HTBT組在RBC數(shù)目增多極顯著(P< 0.01)、HGB含量升高極顯著(P< 0.01)、HCT升高極顯著(P< 0.01)、RDW-SD升高極顯著(P< 0.01)、RDW-CV升高顯著(P< 0.05)、PLT數(shù)目增多極顯著(P< 0.01)、MCHC指標(biāo)顯著降低(P< 0.05)。

在F1代雌性血常規(guī)中，隨著對(duì)親代暴露TBT劑量的增高，部分血常規(guī)指標(biāo)存在一定的劑量效應(yīng)。隨著TBT濃度的增高：HGB含量、HCT含量、PLT數(shù)量呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性增加；MCHC指標(biāo)呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，但是TBT組都低于CK組；RDW-SD指標(biāo)、RDW-CV指標(biāo)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，但是TBT組都高于CK組。

表1　親代三丁基錫攻毒對(duì)子代雄性血常規(guī)的影響

注：同行數(shù)據(jù)與CK組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the CK group in the same line data，*P< 0.05，**P< 0.01.

表2　親代三丁基錫攻毒對(duì)子代雌性血常規(guī)的影響

注：同行數(shù)據(jù)與CK組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the CK group in the same line data，*P< 0.05，**P< 0.01.

3討論

近期大量研究表明，環(huán)境重金屬(包括有機(jī)錫)能夠?qū)?dòng)物的血液造成嚴(yán)重影響，而且環(huán)境重金屬暴露與肥胖有關(guān)[19-20]。Grün F等[21]在2007年提出“環(huán)境致肥因子”的概念，提出的第一批候選致肥因子，有機(jī)錫包括在內(nèi)。WhaIen等[22]研究發(fā)現(xiàn)，人體暴露于DBT、TBT和苯基錫后會(huì)削弱NK細(xì)胞殺死腫瘤的功能，導(dǎo)致人體NK細(xì)胞的功能產(chǎn)生不可逆的抑制作用，從而影響機(jī)體的免疫力。孔皓等[23]研究了三苯基錫對(duì)大鼠肥胖發(fā)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一定劑量的三苯基錫對(duì)大鼠有致肥作用，但是隨著濃度的改變，對(duì)雄性大鼠的致肥作用減弱，而對(duì)雌性大鼠各項(xiàng)指標(biāo)影響不明顯。通過(guò)對(duì)親代的體重記錄，分析后發(fā)現(xiàn)三丁基錫暴露后，對(duì)雌雄小鼠的體重的影響不一致，雌性中劑量組小鼠的體重顯著抑制，雄性低劑量組小鼠體重顯著促進(jìn)。

胎盤(pán)是胎兒發(fā)育過(guò)程中重要的臨時(shí)性器官。胎兒發(fā)育過(guò)程中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和代謝廢物排出都通過(guò)胎盤(pán)實(shí)現(xiàn)[15]。研究證實(shí)有機(jī)鉛、有機(jī)鎘、有機(jī)汞等都能通過(guò)胎盤(pán)屏障，特別是鉛，可在整個(gè)妊娠時(shí)期通過(guò)胎盤(pán)[24]，而錫作為鉛的同族元素，作用機(jī)理可能與之相似。TBT通過(guò)胎盤(pán)后，會(huì)對(duì)子代產(chǎn)生一定的影響。

血液是循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，參與機(jī)體的新陳代謝，所以血常規(guī)的檢查不管是在臨床還是科研都有很重要的意義。研究表明，各種重金屬急性中毒時(shí)，會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷動(dòng)物的血液系統(tǒng)[12,15,25]，而親代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物慢性攻毒對(duì)子代血常規(guī)影響的報(bào)道甚少。紅細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)的改變直接影響機(jī)體的氧化功能和免疫功能[15]，在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，盡管F1代雄性TBT組的RBC明顯增加，HGB也明顯增加，但LTBT組的MCV明顯縮小，且MCH也明顯降低，然而MTBT組與HTBT組的MCV和MCH指標(biāo)無(wú)顯著變化，這些結(jié)果都暗示紅細(xì)胞的運(yùn)輸功能有所降低。與對(duì)照組相比，F(xiàn)1代雌性TBT組HGB顯著增加，但MCV與MCH都無(wú)顯著差異這暗示紅細(xì)胞的運(yùn)氧能力并未下降。紅細(xì)胞運(yùn)氧能力的下降會(huì)使得機(jī)體的氧化反應(yīng)速度下降，從而增加脂肪的積累的趨勢(shì)。除了血常規(guī)之外，我們還記錄了F1代小鼠發(fā)育過(guò)程中的體重?cái)?shù)據(jù)，結(jié)果和我們預(yù)測(cè)的一樣，雄性LTBT組體重增加顯顯著，其他組體重增加不顯著，對(duì)于其中的一些機(jī)制，我們正在做進(jìn)一步的研究。

白細(xì)胞具有滲出、趨化、吞噬和分泌等生理特性主要是執(zhí)行防御功能。淋巴細(xì)胞主要參與機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，F(xiàn)1代雄性TBT組的WBC和LYM差異不顯著，而LTBT組LYMPH指標(biāo)顯著降低，MTBT組和HTBT組的LYMPH指標(biāo)無(wú)顯著差異，這暗示著TBT可能影響小鼠的免疫功能；與對(duì)照組相比，F(xiàn)1代雌性TBT組的WBC、LYM和LYMPH均無(wú)顯著差異。

血小板是從骨髓中成熟的巨核細(xì)胞胞質(zhì)裂解脫落下來(lái)的具有生物活性的細(xì)胞質(zhì)碎塊，形狀不規(guī)則，沒(méi)有細(xì)胞核，體積較小，主要功能參與凝血、生理性止血和保持血管內(nèi)皮的完整性[15]。本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，F(xiàn)1代雄性TBT組的P-LCR顯著降低，但是對(duì)PLT卻無(wú)顯著差異；F1代雌性TBT組的PLT指標(biāo)隨著TBT濃度的增高呈劑量依賴(lài)增加，其他指標(biāo)無(wú)顯著差異，所以初步推斷，TBT可能會(huì)影響巨核細(xì)胞裂解細(xì)胞質(zhì)的大小。

綜上所述不同濃度的TBT暴露親代小鼠時(shí)，會(huì)影響F1代小鼠的血常規(guī)，且低濃度時(shí)對(duì)F1代雄性影響最大，高濃度時(shí)對(duì)F1代雌性影響最大。

致謝：感謝河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院韓坤、孫偉杰和孫原野同學(xué)的大力幫助。感謝洛陽(yáng)普萊柯生物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和飼養(yǎng)。

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〔修回日期〕2015-04-10

研究報(bào)告

Effects of parents exposure to tributyltin(TBT)on blood

routine of F1 generation KM mice

YIN Yu-wei，SUN Ping，SUN Jie，WANG Shu-wen，ZHANG Ji-liang，XIONG Jian-li

(Animal Science and Technology College，Henan University of Science and Technology，Henan Luoyang 471003，China)

【Abstract】Objective To explore effects of parents exposure to TBT on blood routine of F1 generation mice. Methods 80 mice including 40 males and 40 females, were randomly divided into control groups (CK) , low dose groups (LTBT), middle dose groups (MTBT) and high dose groups (HTBT). They were given dose of TBT (0，0.2，2，20μg/kg) every day. The experiment lasted 45 days. At 60 days, one female and one male of the same concentration were bred in the same cage according to 1∶1. At postnatal day 60, blood was collected for the determination of blood routine. ResultsCompared with control group, the number of red blood cells and hemoglobin of F1 generation male mice in LTBT and HTBT groups were significantly increased (P < 0.01); Red blood cell volume, mean corpuscular hemoglobin (P < 0.01), and the lymphocyte absolute value in F1 generation male LTBT were significantly reduced (P < 0.05); HTBT of female mice were significantly increased about the number of red blood cells (P < 0.01). A dose-dependent increase of the hemoglobin, red blood cells, and platelet count of F1 generation female experimental groups was observed. Conclusion Parental TBT exposure affects the F1 mice blood routine. There is the greatest influence on LTBT in F1 generation male mice and on HTBT in F1 generation female mice.

【Key words】Tributyltin；Mice；Blood routine examination

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.010

【中圖分類(lèi)號(hào)】R332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 05-0042-05

[通訊作者]孫平(1975-)，男，博士，副教授，研究方向：動(dòng)物生態(tài)。E-mail： pingsunny@msn.com。

[作者簡(jiǎn)介]尹玉偉(1992-)，男，本科生，動(dòng)物醫(yī)學(xué)。

[基金項(xiàng)目]河南科技大學(xué)SRTP項(xiàng)目(2014264)。