王作軍，馬玉奎，賈玉萍，高　清

(1.山東省臨朐縣人民醫(yī)院，山東 臨朐　262600；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南　250033)

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毛蚶提取物輔助NP化療的增效減毒作用

王作軍1，馬玉奎2，賈玉萍2，高清1

(1.山東省臨朐縣人民醫(yī)院，山東 臨朐262600；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，濟(jì)南250033)

【摘要】目的研究毛蚶提取物和NP方案化療藥物合用后有無(wú)增效和減毒作用。方法采用人肺癌A549細(xì)胞株制備裸鼠移植瘤模型，通過檢測(cè)抑瘤率、體重、攝食量、血液學(xué)和血液生化學(xué)等指標(biāo)，全面評(píng)價(jià)毛蚶提取物和NP化療方案合用后的增效減毒作用。結(jié)果毛蚶提取物(125、250、500 mg/kg, i.g)與NP化療方案合用比單用NP化療方案抑瘤率明顯提高，明顯抑制化療引起的體重減輕、攝食量減少、減輕化療對(duì)血液系統(tǒng)和肝腎功能的毒副作用。結(jié)論毛蚶提取物對(duì)NP方案化療具有明顯的增效減毒作用。

【關(guān)鍵詞】毛蚶提取物；增效減毒；抑瘤率；化療

毛蚶(arca subcrenata lischke)俗稱毛蛤、麻蛤，屬雙殼軟體動(dòng)物，我國(guó)沿海地區(qū)資源豐富。毛蚶殼和肉均具有較高的營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值，《神農(nóng)本草經(jīng)》及歷代本草中均有記載。毛蚶提取物為毛蚶肉經(jīng)低溫提取純化加工制成，其主要的活性成份為毛蚶多糖和毛蚶多肽[1]。以往研究表明，毛蚶提取物具有抗氧化、提高免疫力、體外抗腫瘤等藥理活性[2-4]。盡管有部分中藥體外抗腫瘤活性較高，但藥物的體內(nèi)外活性會(huì)有較大差異，另外，單味中藥一般情況下直接抗腫瘤作用較弱，臨床上功效多體現(xiàn)在減輕臨床癥狀、提高生存質(zhì)量、防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、延長(zhǎng)生存期、預(yù)防腫瘤、提高患者免疫力、增強(qiáng)放、化療敏感性和減輕放、化療不良反應(yīng)等方面發(fā)揮作用[5]。故本文采用人肺癌A549裸鼠移植瘤模型初步考察了毛蚶提取物對(duì)NP化療的增效減毒作用，為毛蚶提取物進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供參考。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物及瘤株 裸小鼠，BALB/c nu，雄性，20～24 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部【SCXK(京)2011-0012】，選取54只用于試驗(yàn)。動(dòng)物飼養(yǎng)于山東省臨朐縣人民醫(yī)院獨(dú)立送風(fēng)IVC-Ⅱ型隔離籠具中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)【SYXK(魯)2010 -0004】。室溫20℃～25℃，濕度40%～70%，人肺癌A549細(xì)胞系，濟(jì)南天長(zhǎng)商貿(mào)有限公司提供。

1.1.2藥品與試劑 毛蚶提取物(青島海慈腫瘤醫(yī)院提供，批號(hào)100805)，淡黃棕色粉末，味微咸、微腥，密封、置陰涼處保存；酒石酸長(zhǎng)春瑞濱注射液(NVB，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：110301)；注射用順鉑(CDDP，齊魯制藥有限公司，批號(hào)：101003200)

1.1.3儀器Sysmex XT-2000IV型全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀(Sysmex Corporation制造)；BS300型生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司制造)。BC-J160S型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠制造)。BDS200型倒置生物顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司制造)。JY2001型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司制造)。電子數(shù)顯卡尺(廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司制造)。

1.2方法

1.2.1毛蚶提取物制備

將鮮活的毛蚶軟體組織洗凈后搗碎進(jìn)行勻漿，經(jīng)低溫提取、3000 r/min，離心15 min后去沉淀、生物澄清劑吸附后進(jìn)行冷凍分離、凍干后得凍干粉，將凍干粉用硫酸銨分級(jí)沉淀、Superdex75凝膠過濾層析、合并分子量為3000×103以下的洗脫峰，得肽類化合物洗脫液，最后凍干洗脫液、再用滅菌注射用水溶解凍干粉、經(jīng)SephadeG-25脫鹽柱脫鹽后所得提取液經(jīng)凍干即得毛蚶提取物。提取物中含總蛋白質(zhì)50%～60%，游離氨基酸3%，多糖2%，核糖核酸微量及少量的脂肪。

1.2.2裸鼠移植瘤模型建立及動(dòng)物分組

將人肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)傳代，增殖培養(yǎng)至所需細(xì)胞量后胰酶消化收集細(xì)胞，取細(xì)胞懸液置顯微鏡下計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞數(shù)。在無(wú)菌條件下，接種于裸小鼠右腋皮下，接種量1.0～2.0×107個(gè)細(xì)胞/0.1 mL/只。裸小鼠接種腫瘤細(xì)胞后，定期用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量瘤體積(V=3.14×長(zhǎng)徑×寬徑×高[6])，測(cè)得瘤體積為100～300 mm3時(shí)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、NP方案化療對(duì)照組、毛蚶提取物組500、250、125 mg/kg三個(gè)劑量同時(shí)應(yīng)用NP化療方案組、毛蚶提取物組500、250、125 mg/kg三個(gè)劑量組，每組6只。

1.2.3動(dòng)物給藥

毛蚶提取物組給予不同劑量的藥物，分組后每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥21 d；NP方案化療組第8、16天各腹腔注射1次NVB，劑量為3.4 mg/kg，第10、12、14天各腹腔注射1次CDDP，劑量為6.7 mg/kg。毛蚶提取物和NP方案化療合用組在NP方案化療的同時(shí)給予不同劑量的毛蚶提取物；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予等容積的蒸餾水和腹腔注射給予等容積的生理鹽水。

1.2.4指標(biāo)檢測(cè)和結(jié)果評(píng)價(jià)[7]

試驗(yàn)中每3 d稱量裸小鼠體重和攝食量，觀察裸小鼠的一般狀態(tài)。末次給藥后2 h摘眼球采血，檢測(cè)白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白 (HB)等血液學(xué)指標(biāo)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素氮(BUN)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TB)、白蛋白(ALB)等血液生化學(xué)指標(biāo)。采血后將所有動(dòng)物脫臼處死后解剖瘤塊稱瘤重，計(jì)算腫瘤抑制率。

腫瘤抑制率=(C-T)/C×100%，T為給藥組平均瘤重，C為陰性對(duì)照組平均瘤重。得出抑瘤率后，以q值評(píng)定兩藥合用的療效。

q值=E(AB)/[EA+(1-EA) ×EB]，E(AB)為兩藥合用的抑制率，EA、EB為兩藥單用的抑制率，q=0.85～1.15表示兩藥作用相加，q>1.15表示兩藥作用協(xié)同，q<0.85表示兩藥作用拮抗。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1毛蚶提取物對(duì)NP方案化療小鼠體重的影響

與模型對(duì)照組比較，NP方案化療后小鼠體重逐漸減輕，而同時(shí)給予毛蚶提取物后，隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，裸小鼠體重逐漸恢復(fù)，給藥21 d后體重稍低于模型對(duì)照組，而明顯高于化療組(表1)。

表1　毛蚶提取物對(duì)裸小鼠體重的影響

注：*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs模型組；#P﹤0.05, vs NP化療組。

Note：*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs model group；#P﹤0.05, vs NP chemotherapy group.

2.2毛蚶提取物對(duì)NP方案化療小鼠攝食量的影響

與模型對(duì)照組比較，NP方案化療后小鼠攝食量明顯減少，而同時(shí)給予毛蚶提取物后，隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，裸小鼠攝食量逐漸增多，其中NP方案化療和毛蚶提取物250、500 mg/kg合用給藥21 d后攝食量稍低于模型對(duì)照組，而明顯高于化療組(表2)。

2.3毛蚶提取物對(duì)NP方案化療的增效作用

與模型對(duì)照組比較，NP方案化療和毛蚶提取物合用后對(duì)腫瘤的抑制率明顯高于單用NP方案化療或者單用毛蚶提取物，其中NP方案化療和毛蚶提取物250、500 mg/kg合用后q值大于0.85，具有明顯的協(xié)同作用，說(shuō)明毛蚶提取物在250 mg/kg劑量以上對(duì)NP方案化療的抗腫瘤作用具有明顯的增強(qiáng)作用(表3)。

表2　毛蚶提取物對(duì)裸小鼠攝食量的影響±s，n=6)

表3　毛蚶提取物對(duì)NP方案化療的增效作用±s，n=6)

注：*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs模型組。

Note：*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs model group.

表4　毛蚶提取物對(duì)NP方案化療血液學(xué)副作用的減毒作用±s，n=6)

注：**P﹤0.01, vs模型組；#P﹤0.05, vs NP化療組。

Note：**P﹤0.01, vs model group；#P﹤0.05, vs NP chemotherapy group.

表5　毛蚶提取物對(duì)NP方案化療血液生化學(xué)的減毒作用±s，n=6)

注：*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs模型組；#P﹤0.05, vs NP化療組。

Note：*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs model group；#P﹤0.05, vs NP chemotherapy group.

2.4毛蚶提取物對(duì)NP方案化療后血液學(xué)副作用的減毒作用

與模型對(duì)照組比較，NP方案化療后小鼠的白細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而和毛蚶提取物合用后白細(xì)胞數(shù)量明顯增多，與單純NP方案化療組比較均有顯著性差異(P﹤0.05)，說(shuō)明毛蚶提取物可明顯抑制NP方案化療引起的白細(xì)胞減少。各個(gè)劑量組對(duì)紅細(xì)胞和血紅蛋白無(wú)明顯影響(表4)。

2.5毛蚶提取物對(duì)NP方案化療后血液生化學(xué)副作用的減毒作用

與模型對(duì)照組比較，NP方案化療后小鼠血清中ALT、AST和BUN明顯升高，說(shuō)明NP化療可以引起小鼠肝腎功能的損傷，而和毛蚶提取物250、500 mg/kg合用后以上指標(biāo)升高幅度減少，與單純NP方案化療組比較均有顯著性差異(P﹤0.05)，說(shuō)明毛蚶提取物對(duì)NP方案化療引起的肝腎功能的損傷有明顯保護(hù)作用(表5)。

3討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中占首位,嚴(yán)重危害人類的生命與健康。非小細(xì)胞肺癌屬于肺癌的一種，非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總敉的80%～85%[8]。目前臨床上非小細(xì)胞肺癌常采用化療的方式進(jìn)行治療。但是飽經(jīng)癌癥折磨的患者應(yīng)用化療藥物后，還要承受很大的毒副作用，有相當(dāng)一部分患者特別體質(zhì)比較差的患者根本無(wú)法承受。所以如何提高化療藥物的治療效果，降低不良反應(yīng)是臨床上亟待解決的問題，而中醫(yī)藥在這方面發(fā)揮了良好的作用。臨床上常會(huì)采用中藥作為輔助手段通過扶正培本和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等在降低毒副作用的同時(shí)增強(qiáng)治療效果，可以有效地改善患者的不良癥狀，提高患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期。

以往對(duì)中藥增效減毒作用的試驗(yàn)研究多集中在中藥與單個(gè)化療藥物合用后觀察其療效，而目前臨床上多采用多種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，故研究對(duì)單個(gè)化療藥物的增效和減毒無(wú)法完全模擬臨床實(shí)際情況。因此在動(dòng)物模型研究中采用臨床標(biāo)準(zhǔn)治療方案，完全模擬臨床治療情況，才能更有的放矢地評(píng)價(jià)中藥的功效。在非小細(xì)胞肺癌的國(guó)際治療指南中，NP是推薦的標(biāo)準(zhǔn)治療方案[9]，故本文采用A549裸鼠移植瘤模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究毛蚶提取物對(duì)NP方案化療的增效和減毒作用。本實(shí)驗(yàn)研究證明，單純NP化療后，裸小鼠出現(xiàn)了體重減輕、攝食量減少、白細(xì)胞降低、肝腎功能損傷等毒副反應(yīng)，與臨床上體現(xiàn)的副作用基本一致，而同時(shí)應(yīng)用毛蚶提取物后，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，以上毒副反應(yīng)逐漸減輕，體重和攝食量等均逐漸恢復(fù)，白細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，給藥21 d時(shí)與模型組基本一致，明顯高于NP化療組，而血清中AST、ALT和BUN含量明顯低于NP化療組。同時(shí)，毛蚶提取物與NP方案化療合用后對(duì)A549裸鼠移植瘤的抑制效果明顯增強(qiáng)。以上研究結(jié)果充分證明毛蚶提取物具有明顯的增效減毒作用，提示其具有進(jìn)一步研究和開發(fā)利用的價(jià)值。

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〔修回日期〕2015-03-31

研究報(bào)告

Synergism and attenuation effects of Scapharca

Subcrenata Extraction on NP chemotherapy

WANG Zuo-jun1，MA Yu-kui2，JIA Yu-ping2，GAO Qing1

(1. People’s Hospital of Linqu County，Shandong Linqu 262600，China；2. Shandong Pharmaceutical Academy，Jinan 250033，China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the synergism and attenuation effects of Scapharca Subcrenata Extraction on NP chemotherapy in model mice. Methods The models of nude mice were induced with A549 cell line xenograft. The tumor inhibiting rates, body weight, food intake, hematology and blood biochemistry index were determined to evaluate the synergism and attenuation effects of Scapharca Subcrenata Extraction (125、250、500 mg/kg, i.g) on NP chemotherapy. ResultsCompared with NP chemotherapy group, the tumor inhibiting rates, body weight, food intake, white blood cell number were increased and glutamate pyruvate transaminase, glutamic oxalacetic transaminase and urea nitrogen were decreased markedly in NP chemotherapy plus Scapharca Subcrenata Extraction groups. Conclusion Scapharca Subcrenata Extraction has a remarkable synergism and attenuation effects on NP chemotherapy.

【Key words】Scapharca Subcrenata extraction；Synergism and attenuation；Tumor inhibition rate；Chemotherapy

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.009

【中圖分類號(hào)】R332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 05-0037-05

[通訊作者]馬玉奎 (1975-)，男， 副主任藥師，博士，研究方向：新藥藥理毒理評(píng)價(jià)。 E-mail： yukuima@sina.com。

[作者簡(jiǎn)介]王作軍(1969-)，男，主管藥師，本科， 研究方向： 藥物不良反應(yīng)檢測(cè)。