胡培麗，張露勇，李　波，邢書(shū)霞

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京　100050)

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兩品系小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)結(jié)果比較

胡培麗，張露勇，李波，邢書(shū)霞

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050)

【摘要】目的分析比較BALB/c和CBA小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)結(jié)果。 方法 將已知致敏性的4種化學(xué)物(2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、己基肉桂醛和異丙醇)和未知致敏性的3種化妝品對(duì)BALB/c和CBA小鼠連續(xù)染毒3 d，第5天腹腔注射示蹤劑BrdU，第6天分離頜下淋巴結(jié)制取單細(xì)胞懸液，用ELISA試盒檢測(cè)細(xì)胞增殖。 結(jié)果 2,4-二硝基氯苯、丁子香酚、己基肉桂醛和3號(hào)燙發(fā)劑兩品系結(jié)果均呈致敏陽(yáng)性，3種化學(xué)物EC1.6值分別為0.08%(極強(qiáng))、4.02%(中)、6.68%(中)(BALB/c)和0.07%(極強(qiáng))、6.08%(中)、8.89%(中)(CBA)；異丙醇、1和2號(hào)化妝品兩品系結(jié)果均為致敏陰性，SI均小于1.6。 結(jié)論 兩品系小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)結(jié)果較一致，BALB/c可替代CBA小鼠應(yīng)用于化學(xué)物和化妝品的致敏性評(píng)價(jià)。

【關(guān)鍵詞】局部淋巴結(jié)試驗(yàn)；品系；化妝品

小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(local lymph node assay，LLNA)是皮膚致敏性多種替代方法中應(yīng)用最為廣泛的全球標(biāo)準(zhǔn)方法[1-3]，但該方法需要使用放射性標(biāo)記物、特定的設(shè)備和實(shí)驗(yàn)條件，不利于推廣；2010年OECD指南公布了基于摻入溴脫氧尿嘧啶核苷和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的改良方法(LLNA:BrdU-ELISA)[4]，用示蹤劑替代放射性標(biāo)記物，較易推廣。該指南中推薦使用CBA小鼠，由于該品系小鼠在國(guó)內(nèi)供應(yīng)量較少，價(jià)格昂貴，給國(guó)內(nèi)很多學(xué)者開(kāi)展該試驗(yàn)帶來(lái)了一定的困難。鑒于國(guó)內(nèi)外有使用BALB/c、NMRI、ICR、DBA/2、C57BL/6、SJL等品系的報(bào)道[5-10]，而B(niǎo)ALB/c小鼠是國(guó)內(nèi)應(yīng)用較多的品系，遺傳穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)嘗試分析比較國(guó)內(nèi)BALB/c和CBA兩品系小鼠對(duì)LLNA:BrdU-ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，從而為L(zhǎng)LNA實(shí)驗(yàn)選擇合適的動(dòng)物品系提供參考。

1材料和方法

1.1受試物

溶劑由丙酮/橄欖油(AOO)(4∶1 v/v)配制而成，2,4-二硝基氯苯(DNCB)(中國(guó)醫(yī)藥總公司北京分公司)與異丙醇(IPA，北京化工廠)分別用AOO配成0.1% (w/v)、0.3% (w/v)、1.0% (w/v) 和25%(v/v)、50%(v/v)、100%(v/v)3個(gè)濃度；丁子香酚(EUG)與己基肉桂醛(HCA)均購(gòu)自Sigma公司，均用AOO配成25%(v/v)、50%(v/v)2個(gè)濃度；3種化妝品原液直接涂抹于小鼠耳背皮膚。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c和CBA小鼠，雌性，8～10周齡，分別由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心和北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號(hào)分別為【SCXK(京)2009-0017】、【SCXK(京)2009-0004】。動(dòng)物試驗(yàn)環(huán)境為中國(guó)食品藥品檢定研究院屏障系統(tǒng)動(dòng)物房【SYXK(京)2011-0008】，溫度(22±2)℃，濕度50%～70%，動(dòng)物自由飲食，12 h人工照明。

1.3試劑和儀器

BrdU粉劑與BrdU-ELISA試劑盒均購(gòu)自德國(guó)Roche公司(編號(hào)10280879001、11647229001)。BrdU標(biāo)記液用生理鹽水配制成10 mg/mL。SYNERGY HT型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO TEK 公司)、CR22G III型低溫離心機(jī)(日本HitacHi公司)。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組和染毒[4, 11]

動(dòng)物隨機(jī)分為4只/組，4種化學(xué)物(己基肉桂醛、丁子香酚、2,4-二硝基氯苯、異丙醇)分別設(shè)為2～3個(gè)不同劑量組，共用一個(gè)AOO溶劑對(duì)照組；3種化妝品(1號(hào)精華霜、2號(hào)防曬霜、3號(hào)燙發(fā)劑)分別設(shè)一個(gè)最高劑量組，共用一個(gè)蒸餾水對(duì)照組。將受試物25 μL/耳/d涂抹于小鼠雙耳背部皮膚，連續(xù)涂抹3 d，對(duì)照組涂抹AOO或蒸餾水，第4天不處理，第5天腹腔注射BrdU標(biāo)記液0.5 mL，第6天處死動(dòng)物分離頜下淋巴結(jié)。

1.4.2淋巴細(xì)胞制備[4, 11]

BrdU標(biāo)記液腹腔注射后24 h，處死動(dòng)物，摘取頜下淋巴結(jié)，研磨后用不銹鋼篩網(wǎng)(200目)過(guò)濾制成單細(xì)胞懸液，PBS洗2次(離心1200 r/min，8 min)，每只小鼠的淋巴細(xì)胞定容于14 mL PBS中。

1.4.3ELISA檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞懸液100 μL /孔加至96孔板中，離心(1400 r/min，10 min)，棄上清，吹干細(xì)胞。經(jīng)ELISA試劑盒處理后用酶標(biāo)儀檢測(cè)Brdu值(發(fā)射波長(zhǎng)和參考波長(zhǎng)分別為370 nm，492 nm)，BrdU標(biāo)記指數(shù)為(A370-A空白370)-(A492-A空白492)。

1.4.4SI、EC1.6值計(jì)算與致敏性分級(jí)

刺激指數(shù)( stimulation index，SI)=受試物組BrdU標(biāo)記指數(shù)均值/溶劑對(duì)照組BrdU標(biāo)記指數(shù)均值；SI≥1.6，并有劑量-效應(yīng)關(guān)系，該受試物為致敏陽(yáng)性[4, 11]。根據(jù)SI計(jì)算EC1.6值和致敏級(jí)別，計(jì)算公式為[11]：①EC1.6=c+[(1.6-d)/(b-d)]×(a-c)(受試物各濃度組對(duì)應(yīng)SI值包括>1.6和<1.6)，②EC1.6=2^{log2(c)+[(1.6-d)/(b-d)]×[log2(a)-log2(c)]}(受試物各濃度組對(duì)應(yīng)SI值均>1.6)，其中設(shè)a、c為鄰近兩點(diǎn)受試物的濃度，b、d為對(duì)應(yīng)的SI值；當(dāng)SI=1.6時(shí)，其對(duì)應(yīng)的受試物濃度即為EC1.6值。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：EC1.6%<0.1極強(qiáng)，0.1≤EC1.6%<1.0強(qiáng)，1.0≤EC1.6%<10中,10≤EC1.6%<100弱[11]。

2結(jié)果

2.1染毒期間動(dòng)物狀態(tài)觀察

染毒期間動(dòng)物正常飲食，體重增長(zhǎng)良好。部分組別(1% 2,4-二硝基氯苯)小鼠染毒部位出現(xiàn)水腫、紅斑或結(jié)痂刺激性或致敏性癥狀，各臟器未見(jiàn)有任何病變，未觀察到明顯的其他毒性癥狀。

2.2兩品系小鼠BrdU標(biāo)記指數(shù)和刺激指數(shù)SI值比較

由表1可見(jiàn)，BALB/c和CBA小鼠：AOO和蒸餾水對(duì)照組的BrdU標(biāo)記指數(shù)較一致，淋巴結(jié)增生程度均較低；3種已知致敏物(2,4-二硝基氯苯，丁子香酚和己基肉桂醛)各濃度SI均大于1.6，且均有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系；非致敏物異丙醇各濃度SI均小于1.6，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。1、2號(hào)化妝品SI均小于1.6，判斷為無(wú)致敏性，3號(hào)染發(fā)劑SI大于1.6，為致敏陽(yáng)性。

表1　兩品系小鼠對(duì)4種化學(xué)物和3種化妝品LLNA:BrdU-ELISA測(cè)定結(jié)果

注：VS: 極強(qiáng)；M：中。

Note: VS: very strong; M: moderate.

2.3兩品系小鼠EC1.6值與致敏性分級(jí)比較

兩品系小鼠：2,4-二硝基氯苯EC1.6值較相近，為極強(qiáng)致敏物；丁子香酚和己基肉桂醛EC1.6值不是很一致，但均在1～10范圍內(nèi)，為中等強(qiáng)度致敏物(表1)。

3討論

由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬、性別、年齡等差異影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)尤為重要。OECD指南(TG429、TG442)推薦使用CBA雌性小鼠，給國(guó)內(nèi)各毒理實(shí)驗(yàn)室推廣該LLNA方法帶來(lái)了困難。BALB/c小鼠是國(guó)內(nèi)應(yīng)用較多的近交系，遺傳背景明確、穩(wěn)定，國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者將BALB/c小鼠應(yīng)用于LLNA研究[5-10]，但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于該兩品系小鼠LLNA:BrdU-ELISA法評(píng)價(jià)化學(xué)物和化妝品致敏性的比較研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究將BALB/c和CBA小鼠分別對(duì)不同致敏強(qiáng)度的4種化學(xué)物和3種化妝品進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果兩品系對(duì)AOO和蒸餾水溶劑對(duì)照反應(yīng)均較低，對(duì)2,4-二硝基氯苯、丁子香酚和己基肉桂醛和3號(hào)燙發(fā)劑反應(yīng)均呈致敏陽(yáng)性(SI>1.6)，且3種化學(xué)物劑量-反應(yīng)關(guān)系顯著；對(duì)異丙醇和1、2號(hào)化妝品反應(yīng)均呈致敏陰性(SI<1.6)。

從表1中我們可以發(fā)現(xiàn)CBA小鼠BrdU標(biāo)記指數(shù)和刺激指數(shù)SI值均偏高于BALB/c，推斷CBA小鼠較BALB/c表現(xiàn)出更高程度地BrdU攝取，但兩品系對(duì)4種化學(xué)物和3種化妝品的致敏性判斷一致，雖然2,4-二硝基氯苯、丁子香酚和己基肉桂醛的EC1.6值存在差異，但致敏強(qiáng)度分級(jí)均一致，表明該兩品系小鼠只是反應(yīng)程度有一定的差異，對(duì)化學(xué)物和化妝品致敏性判斷及致敏強(qiáng)度分級(jí)并無(wú)顯著影響。國(guó)際上也有學(xué)者將不同品系小鼠進(jìn)行了LLNA研究[5-6,12]，其結(jié)果與本研究一致。

綜上，BALB/c和CBA小鼠LLNA: BrdU-ELISA試驗(yàn)結(jié)果較一致，均可較好地評(píng)價(jià)化學(xué)物和化妝品的致敏性，BALB/c小鼠可替代CBA在國(guó)內(nèi)各毒理實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用于化妝品皮膚致敏性評(píng)價(jià)。

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〔修回日期〕2015-03-31

技術(shù)方法

The comparative study of two strains on results of Local lymph node assays

HU Pei-li，ZHANG Lu-yong，LI Bo，XING Shu-xia

(National Institutes for food and drug control，Beijing 100050，China)

【Abstract】ObjectiveTo analyze and compare results of local lymph node assays (LLNA) between BALB/c and CBA mice. Methods 4 chemicals (2,4-dinitrochlorobenzene, eugenol, hexyl cinnamic aldehyde and isopropanol) and 3 cosmetics were applied to the dorsum of both ears of Balb/c and CBA mice for three consecutive days. BrdU solution was injected inter-peritoneally on day 5. On day 6, the bilateral draining auricular lymph nodes were excised and made into single cell suspension, the lymph cell proliferation was measured by BrdU ELISA kit. Results2,4-dinitrochlorobenzene, eugenol, hexyl cinnamic aldehyde and NO.3 perm agent pretended positive for both strains, EC1.6 values of three chemicals were found to be 0.08% (very strong), 4.02% (moderate), 6.68% (moderate) and 0.07% (very strong), 6.08% (moderate), 8.89% (moderate) for BALB/c and CBA mice respectively. Isopropanol, NO.1 and NO.2 cosmetics pretended to be non-sensitizers with SI<1.6 for both strains. Conclusion This study showed that BALB/c mouse was essentially equal to CBA for LLNA: BrdU-ELISA, which suggested that BALB/c mouse was a good alternative for CBA used in chemicals and cosmetics allergenic evaluation.

【Key words】Local lymph node assay；Strain；Cosmetics

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.013

【中圖分類(lèi)號(hào)】R758.22R332

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 05-0054-04

[作者簡(jiǎn)介]胡培麗(1981-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：食品化妝品安全性評(píng)價(jià)，E-mail： hupeili-1981@163.com。

[基金項(xiàng)目]中檢院中青年基金項(xiàng)目(2013NC3)。