張麗波，周立君

· 綜述 ·

糖原合酶激酶-3β與心肌疾病的研究進展

張麗波1，周立君1

糖原合酶激酶3β（GSK-3β）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調(diào)節(jié)多種細胞功能，包括代謝、轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞生長和凋亡［1］，GSK-3β在心肌細胞的生長與凋亡中也扮演著重要角色，參與調(diào)控心肌細胞肥大［2，3］、心力衰竭（HF）［4，5］、缺血再灌注損傷（I/R）［6-8］、心肌纖維化［9，10］，本文就其與心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展進行總結(jié)。

1　GSK-3家族概述

GSK-3是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛表達于多種細胞中，1980年首次被鑒定出參與調(diào)節(jié)糖原代謝，并且是糖原代謝的限速酶。1990年，基于部分多肽序列首次克隆出GSK-3基因［11］。GSK-3高度保守，從果蠅到人類GSK-3激酶結(jié)構(gòu)域序列上有90%以上的同源性［12］。GSK-3家族包括兩個亞型，即GSK-3α（51 kDa）和GSK-3β（47 kDa），二者的激酶結(jié)構(gòu)域有98%的同源性，主要區(qū)別在于N端和C端，GSK-3α包含一個功能不明的富含甘氨酸的N末端。所以這種在激酶結(jié)構(gòu)域異常高的同源性有可能阻礙研究異構(gòu)體小分子抑制劑的發(fā)展前景。兩種亞型既有重疊功能，又有各自的獨特性［13］，例如：只有GSK-3β在Ser389/Thr390位點磷酸化；GSK-3β在AA-13具有神經(jīng)元特異性剪切位點；某些作用底物具有亞型特異性。此外，兩種亞型全基因刪除的生物表型亦有差異，在小鼠模型中，全基因刪除GSK-3β是胚胎致死性的，但缺失GSK-3α基因型的小鼠是正常的并能存活數(shù)年［13］。

2　GSK-3β活性的調(diào)節(jié)

GSK-3β參與很多生理或病理過程，包括細胞新陳代謝，細胞的增殖、凋亡、遷移、細胞周期的調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)翻譯和基因轉(zhuǎn)錄等，是眾多細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的交叉匯點，要完成如此多的功能，GSK-3β活性必然受到極其復(fù)雜且精細的調(diào)節(jié)［14］。

2.1GSK-3β的磷酸化調(diào)節(jié) GSK-3β N端的第9位絲氨酸（Ser 9）磷酸化可顯著抑制其活性，絲氨酸殘基的磷酸化使GSK-3β的N端自身變成假底物，從而占據(jù)真正底物的起始磷酸鹽保留的結(jié)合位點［15］。蛋白激酶B（PKB/Akt）/GSK-3β信號通路是最常見的磷酸化調(diào)節(jié)通路，Akt的激活常依賴于其上游分子磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的活性，PI3K激活A(yù)kt，Akt磷酸化下游信號分子GSK-3β N-端的Ser9而抑制其活性，隨后激活下游靶點，發(fā)揮細胞調(diào)節(jié)作用［16］。此外，哺乳類雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物-2（mTORC2）磷酸化Akt的第473位絲氨酸位點可完全激活A(yù)kt［17］。多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑均經(jīng)過GSK-3β的Ser9磷酸化位點，例如蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC）、核糖體S6激酶體系（p90RSK和p70S6K）等。近幾年有研究報道［18］，p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）通過磷酸化GSK-3β C末端Ser389和Thr390抑制其活性，具體機制尚未完全清楚。與N端絲氨酸磷酸化的抑制作用相反，磷酸化GSK-3β C端第216位酪氨酸殘基（Tyr216）可促進其活性［19］。

3　GSK-3β與心肌疾病

3.1GSK-3β在心肌缺血再灌注（I/R）損傷中的作用 缺血再灌注損傷是缺血組織器官在恢復(fù)血流后，其細胞代謝紊亂、功能障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而加重的現(xiàn)象，近年來減輕I/R損傷以獲得更有效的心肌保護一直是心臟研究的一個主要方向。大量研究表明［24］，GSK-3β Ser9磷酸化對于缺血預(yù)適應(yīng)的心肌保護作用是必須的。Juhaszova等［25］報道抑制GSK-3β活性會延遲線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的開放，這對心肌保護有重要影響。該研究團隊應(yīng)用小分子RNA干擾技術(shù)同樣證明了保護性信號通路主要是GSK-3β亞型介導(dǎo)的，而與GSK-3α無關(guān)。Ludovic等［26］用GSK-3β-Ser 9轉(zhuǎn)基因小鼠證明GSK-3β Ser9磷酸化對于缺血后的保護作用亦是重要的，并且通過一種非依賴親環(huán)蛋白D（cyclophilin-D，CypD）的模式抑制mPTP開放來產(chǎn)生這種作用。有報道［27］稱磷酸化GSK-3β在線粒體內(nèi)膜與腺嘌呤核苷酸移位酶（ANT）結(jié)合增加，使ANT和CypD的相互作用減少來升高mPTP的開放閾值發(fā)揮心肌保護作用。然而GSK-3β在線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔調(diào)控靶點尚不清。

Woulfe等［28］應(yīng)用可誘導(dǎo)型的心肌細胞特異性的GSK-3β基因敲除小鼠模型證實心肌細胞GSK-3β的敲除對陳舊性心肌梗死有保護作用。GSK-3β敲除鼠模型（GSK-3β KO）可以減少心室重構(gòu)、保護左室和減輕心肌梗死后心臟擴張。這種保護作用并未通過減少GSK-3β KO模型心肌的梗死面積發(fā)揮，因為應(yīng)用的是永久性閉塞的心肌梗死模型，也就是梗死已經(jīng)完全形成后才敲除該基因。在GSK-3β KO心肌梗死模型中觀察到外層心肌的肥大更傾向于生理性而非病理性。

但有些研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β對缺血性心肌的作用與前面研究結(jié)果大相徑庭。Webb等［29］建立持續(xù)激活GSK-3α和GSK-3β基因的雙植入（double KI）小鼠模型，結(jié)果顯示二者的持續(xù)活性對心肌梗死后慢性壓力重構(gòu)無影響，這說明局部心肌梗死后的左室重構(gòu)和GSK-3無關(guān)。最近Peiyong等［30］通過應(yīng)用GSK-3β轉(zhuǎn)基因小鼠驗證不管是單純延長缺血亦或再灌注后短暫的缺血GSK-3β在心臟中的作用，表明抑制GSK-3β會加重缺血損傷，但可以通過調(diào)節(jié)mTOR通路及自噬功能來對抗缺血再灌注損傷，即自噬功能改善缺血延長及再灌注時GSK-3β產(chǎn)生的心肌損傷作用。總結(jié)來說，現(xiàn)有的文獻表明GSK-3β調(diào)節(jié)心室功能的作用很復(fù)雜，該激酶過表達或過度激活是有害的，但若完全抑制其活性，同樣產(chǎn)生弊端。在GSK-3β抑制劑作為臨床治療缺血相關(guān)心臟病藥物之前，仍需深入的臨床研究作為保證。

3.2GSK-3β在心肌肥厚中的作用 作為終末分化細胞，心肌細胞通過代償性肥大來適應(yīng)各種生理或病理負荷，如：鍛煉、高血壓等。眾所周知，生理性的肥大可以通過增加耗氧量和搏出量來增強心功能，但病理性肥大多與心肌纖維化增加、細胞死亡和心功能不全有關(guān)且可致心力衰竭［31］。

Haq等［32］和 Morisco等［33］首次發(fā)現(xiàn)GSK-3β是心臟肥大的負性調(diào)控因子。Antos等［34］研究發(fā)現(xiàn)腺病毒轉(zhuǎn)基因GSK-3β-Ser9突變模型的心肌細胞能顯著抑制心肌對腎上腺素及內(nèi)皮素-1刺激而引起的肥大反應(yīng)。該研究團隊還建立了轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并在心臟特異性啟動子的控制下使GSK-3β持續(xù)激活，在壓力超負荷模型和慢性β腎上腺素刺激模型中心臟特異性表達活化的GSK-3β都能起到減弱心臟肥大的作用［34］。另外，有研究報道在心肌細胞過表達GSK-3β，GSK-3β的持續(xù)激活使正常出生后心肌細胞死亡增加，并導(dǎo)致心臟縮小及伴有收縮功能顯著異常［35］，證明GSK-3β可以調(diào)節(jié)正常和病理狀態(tài)的心臟生長發(fā)育。這些研究證明了GSK-3β是心臟肥大信號通路的負性調(diào)節(jié)因子，提高心臟GSK-3β的活性可能在病理性肥大的治療中增加臨床獲益。

近年來有研究表明MicroRNA（miRNA）能從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控GSK-3β的表達，miRNA是一組廣泛存在于真核生物中短小、不編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA。Nagalingam等［36］利用去氧腎上腺素（PE）刺激培養(yǎng)的原代心肌細胞，發(fā)現(xiàn)miRNA-378的過表達抑制PE誘導(dǎo)的Akt/GSK-3β的磷酸化，下調(diào)活化T細胞核因子（NFAT）核內(nèi)活性，抑制PE誘導(dǎo)的心肌肥厚。Li等［37］研究表明miRNA-145下調(diào)心肌轉(zhuǎn)錄因子6（GATA6）在核內(nèi)的表達和定位，抑制異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的心肌肥厚，其對心臟的保護作用與抑制蛋白質(zhì)合成的多條信號通路有關(guān)，包括Akt/GSK-3β、ERK1/2、JNK等，在基因水平抑制心肌肥厚。

3.3GSK-3β在心肌纖維化中的作用 纖維化可以影響機體大部分組織，嚴重的纖維化甚至導(dǎo)致器官功能障礙和死亡。心肌梗死后誘發(fā)心肌纖維化、心室擴張、心功能障礙等都與心肌成纖維細胞的過度激活有關(guān)。

已有研究報道［38，39］，GSK-3β通路和成纖維細胞轉(zhuǎn)化成心肌纖維細胞及纖維化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)均有關(guān)，靶向抑制成纖維細胞中的GSK-3β證明缺失GSK-3β導(dǎo)致過度纖維化及不良的心肌梗死后心室重構(gòu)。GSK-3β調(diào)節(jié)心肌纖維化的機制可能有：①GSK-3β調(diào)節(jié)TGF-β1-SMAD-3信號通路，TGF-β是成纖維細胞激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，TGF-β1與受體結(jié)合后作用于SMAD轉(zhuǎn)錄因子的C末端結(jié)構(gòu)域使其磷酸化和激活，GSK-3β通過負性調(diào)控SMAD-3活性而起到抗纖維化作用［40］；②通過Wnt/β-catenin信號通路，β-catenin在系統(tǒng)性硬化中是纖維化發(fā)生的中心調(diào)節(jié)因子，抑制GSK-3β的活性，減少β-catenin的泛素化降解，導(dǎo)致眾多器官成纖維細胞激活和纖維化［41］。

3.4GSK-3β在心肌細胞凋亡中的作用 細胞凋亡是在多種生理性或病理性刺激下，為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活啟動細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞的程序化死亡。心肌細胞在受到缺血、缺氧、壓力超負荷、線粒體毒素、長期酒精攝入等刺激下，會引起心肌細胞凋亡，長期而持續(xù)的凋亡導(dǎo)致心室重構(gòu)，進而發(fā)展為心力衰竭［42］。GSK-3β在細胞凋亡與生存調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。GSK-3β的激活促進線粒體途徑誘導(dǎo)的內(nèi)源性細胞凋亡，但是抑制由死亡受體（TNF-R1，F(xiàn)as，DR4，DR5）介導(dǎo)的外源性細胞凋亡［43］。線粒體凋亡通路起始于mPTP的開放，釋放細胞色素C于胞質(zhì)中，進而激活Caspase-9及下游半胱天冬蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡，而mPTP的開放閾值隨著GSK-3β活性降低而升高［23］。

Mokhtari等［44］研究糖尿病大鼠在缺血再灌注條件下，給予曲克蘆丁150 mg/kg/天灌胃4周，發(fā)現(xiàn)曲克蘆丁通過增加GSK-3β的磷酸化抑制其活性，減少再灌注損傷時的細胞凋亡。Daniels等［45］在應(yīng)用ISO誘導(dǎo)的小鼠心肌重構(gòu)模型中發(fā)現(xiàn)β腎上腺素受體（β-AR）刺激可提高細胞外泛素化水平，可使Akt活性升高，隨之磷酸化GSK-3β-Ser9，抑制c-Jun氨基末端激酶（JNKs）的活性，減少心肌細胞凋亡，改善心室重構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)在敲除乙醛脫氫酶-2小鼠模型中，急性乙醇攝入加重心肌細胞凋亡，心臟收縮功能障礙，這種損傷是通過蛋白磷酸酶2A介導(dǎo)的Akt/GSK-3β脫磷酸化作用［46］。由此，可以推斷GSK-3β的過表達可以促進細胞凋亡，抑制GSK-3β的活性有可能保護組織器官。

4　小結(jié)與展望

綜上所述，GSK-3β是細胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交叉點，其在心臟疾病的保護作用受到越來越多的關(guān)注，然而，目前關(guān)于GSK-3β的大多研究都集中于靶向基因敲除的細胞和實驗動物模型，尚未發(fā)現(xiàn)在人類心臟疾病的臨床研究中發(fā)揮同樣的保護作用。而且，GSK-3亞型具有高度同源性，阻礙了藥理學(xué)方面研究特異性的靶向分子抑制劑，期待將來能夠應(yīng)用RNA干擾方法或單克隆抗體方法研發(fā)具有活性靶向位點的小分子抑制劑。

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本文編輯：姚雪莉

R541 【文獻標志碼】A

1674-4055（2016）04-0507-04

1150001 哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

周立君，E-mail：Zhoulj0451@126.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.04.38

2.2Wnt信號通路的調(diào)節(jié) Wnt信號通路是在物種進化過程中高度保守的信號通路，在動物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、細胞的增殖和凋亡、腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移等過程中，發(fā)揮至關(guān)重要的作用［20］。GSK-3β結(jié)合蛋白復(fù)合體包括：骨架蛋白、GSK-3β、β連環(huán)蛋白、腺瘤性結(jié)腸息肉蛋白（APC）等，GSK-3β是Wnt信號通路中的關(guān)鍵蛋白，其激活與抑制決定細胞的命運，主要靶目標是β連環(huán)蛋白［21］。簡單來說，在沒有Wnt信號刺激時，GSK-3β以活性形式磷酸化β-catenin 的Thr41、Ser37和Ser33，導(dǎo)致其泛素化降解，阻斷β-catenin介導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成。然而，生長因子結(jié)合Wnt受體觸發(fā)脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP5和LRP6）的磷酸化，從而激活蓬亂蛋白1（Dvl），進而促進GSK-3β與β-catenin的解聚，β-catenin轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)并與核基因TCF /LEF相互作用發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄作用。

2.3Calpain介導(dǎo)的GSK-3β片段化調(diào)節(jié) GSK-3β活性不僅受到磷酸化、結(jié)合蛋白的調(diào)節(jié)，近年研究報道［22］，鈣激活中性蛋白酶對GSK-3β N端的片段化可導(dǎo)致GSK-3β的抑制結(jié)構(gòu)域喪失，并將GSK-3β分解為兩個分子量為40kDa 和30kDa具有激酶活性的片段，即Calpain的激活可片段化GSK-3β并使其活性升高。Shanshan Ma等［23］研究發(fā)現(xiàn)，Calpain還可使GSK-3β的C末端分解為幾個片段，導(dǎo)致活性升高，并證實其片段化位點在Thr-38-Thr-39和Ile-384-Gln-385，Ser-9/Ser-389位點磷酸化可使Calpain介導(dǎo)的GSK-3β片段化作用減弱。目前Calpain對GSK-3β片段化調(diào)節(jié)機制尚未完全清楚，還需進一步研究。