早產(chǎn)兒氧暴露后外周血單個核細(xì)胞內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生與自噬變化的關(guān)系*

蘇劍董文斌李清平康蘭張蓮玉盧佑英 翟雪松

(四川醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院新生兒科, 四川 瀘州 64600)

【摘要】目的觀察早產(chǎn)兒氧暴露后外周血單個核細(xì)胞內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生與自噬的水平，探討活性氧簇產(chǎn)生與自噬變化的關(guān)系。方法32周以下早產(chǎn)兒根據(jù)用氧濃度不同分為三組，F(xiàn)iO2<30%為低濃度吸氧組、FiO2 在30%～40%為中濃度吸氧組、FiO2>40%為高濃度吸氧組。各組氧療48小后,與對照組中同期未吸氧的32周以下早產(chǎn)兒，經(jīng)橈動脈采血3ml，分離外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)及血清，采用激光共聚焦顯微鏡觀察檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的生成量，硫代巴比妥酸比色法檢測血清丙二醛(MDA)含量，丹(磺)酰戊二胺(MDC)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察自噬表達(dá)水平。結(jié)果早產(chǎn)兒氧暴露后，隨著用氧濃度的升高，PBMCs內(nèi)ROS。與其余三組相比，高濃度吸氧組中ROS，MDA含量和自噬體表達(dá)逐漸增高明顯增加(P<0.05)，各組ROS水平與自噬表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論早產(chǎn)兒氧暴露后，高氧可誘導(dǎo)體內(nèi)ROS增多，并在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。ROS可作為信號分子引起和上調(diào)細(xì)胞發(fā)生自噬反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】早產(chǎn)兒; 活性氧; 自噬

【中圖分類號】R 722.6【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

基金項(xiàng)目：四川省教育廳科研課題(08ZA150)；四川省衛(wèi)生廳科研課題(90191)

通訊作者：董文斌，教授，E-mail:DongWenbin2000@163.com

收稿日期：( 2015-01-09； 編輯： 張文秀)

The relationship between reactive oxygen species and autophagy within peripheral blood mononuclear cells in premature infants after oxygen exposed SU Jian, DONG Wenbin, LI Qingping,etal

(DepartmentofNewbornMedicine,TheAffiliatedHospitalofSichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,Sichuan,China)

Abstract【】ObjectiveTo explore the relationship between reactive oxygen species and autophagy within peripheral blood mononuclear cells in premature infants after oxygen exposed. MethodsAccording to different oxygen concentrations, the preterm infants were divided into three groups including low concentration oxygen group (FiO2<30%), middle concentration oxygen group (FiO2 between30- 40%) and high concentration oxygen group (FiO2>40%). Premature infants less than 32 weeks without oxygen were as control group.After 48h, l blood were taken via radial artery and used to separate peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)and serum. The intracellular reactive oxygen species (ROS) were detected by confocal laser scanning microscopy. The level of malondialdehyde (MDA)in serum were measured by thiobarbituric acid colorimetric. The expression of autophagy within peripheral blood mononuclear cells were observed by monodansylcadaverin combined with confocal laser scanningmicroscope.ResultsAfter premature infants exposed to oxygen, the oxygen, ROS and expression of autophagy and MDA were gradually increased. Compared that of the other three groups, the level of ROS, expression of autophagy and MDA in the high concentration oxygen group were increased significantly (P<0.05). There were positive correlations of autophagy and ROS in PBMCs among the groups(P<0.01). ConclusionHigh oxygen could induce in ROS increased in premature infants. The emergence of autophagy ROS could be used as a signal molecule induced upregulation of autophagy and cell reaction.

【Key words】Premature infants; ROS; Autophagy

近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)水平的發(fā)展，早產(chǎn)兒(特別是低出生體重兒)的存活率有了明顯的提高。由于新生兒(特別是早產(chǎn)兒)呼吸系統(tǒng)疾病常常需要長時間吸入氧氣，早產(chǎn)兒機(jī)體又缺乏抗氧化能力，則長時間、高濃度的氧療易引起急慢性肺損傷的發(fā)生[1,2]。目前對于高濃度吸氧組誘導(dǎo)肺損傷的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但認(rèn)為與氧化應(yīng)激反應(yīng)是有重要關(guān)系的[3]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激激活的狀態(tài)下，細(xì)胞能增加其自噬。但自噬對細(xì)胞有著兩方面作用，通過清除受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)，或在饑餓條件下為細(xì)胞提供能量和底物發(fā)揮有利的作用；同時，激烈的自噬會導(dǎo)致自噬性細(xì)胞的Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，加速細(xì)胞死亡。目前對于早產(chǎn)兒自噬與氧化應(yīng)激相關(guān)研究較少，其相互作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在觀察早產(chǎn)兒氧暴露后體內(nèi)活性氧簇與外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)內(nèi)自噬表達(dá)的情況，來探討探討活性氧簇產(chǎn)生與自噬變化的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2013年3～11月收住于我院新生兒科診斷為呼吸衰竭(Ⅰ型呼衰:PO2<50 mmHg;Ⅱ型呼衰:PO2<50 mmHg,PCO2>50 mmHg)需給氧支持治療的早產(chǎn)兒30例作為氧暴露組胎齡均為32周以下。根據(jù)吸氧濃度不同分為3組，其中低濃度吸氧組10例，吸氧濃度<30%；中濃度吸氧組10例，吸氧濃度30%～40%；高濃度吸氧組10例，吸氧濃度>40%；氧暴露組中男17例，女13例。胎齡28～32周，體質(zhì)量(1250±156)g。同期選擇10例32周以下無其他疾病且未吸氧的早產(chǎn)兒作為對照組，其中男5例，女5例。胎齡30～32周，體質(zhì)量(1328±109)g。氧暴露組與對照組患兒胎齡、出生體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)排除標(biāo)準(zhǔn):①ABO溶血和G6PD缺陷。②先天性心臟病。③驚厥、顱內(nèi)及消化道出血者。④嚴(yán)重感染。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)本采集氧暴露組患兒在用氧48小是地后，對照組患兒在出生48小時后，征得家屬同意并簽署知情同意書，經(jīng)橈動脈采血3ml。其中2ml置于肝素抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMCs。1ml置于含20g/L 2%依地酸二鈉抗凝的試管中混勻，30分鐘 h內(nèi)離心(2500 r/min，10 min)，取上層血清-80℃低溫冰箱保存。

1.2.2活性氧(reactive oxygen species，ROS) 檢測用激光共聚焦顯微鏡觀察檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成量，步驟如下：①涂片：分離取得細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106ml-1。取100μl細(xì)胞懸液涂于防脫玻片上，待干。②固定：4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min后，PBS洗滌3次。③裝載探針：按說明書配制MitoSOX后，加入1ml覆蓋于細(xì)胞上，37℃孵育30min后，PBS洗滌三次。④染核：每張玻片加入100μlDAPI藍(lán)色熒光染料染細(xì)胞核，3min后，PBS洗滌三次。⑤封片，滴入30μl抗熒光淬滅劑于載玻片上，蓋上消毒后的蓋玻片，完成封片。⑥檢測及分析，將處理后的玻片放于激光共聚焦顯微鏡上，調(diào)節(jié)模式為UV-VIS，發(fā)射波長510nm,采集圖像；運(yùn)用 Image Pro Plus軟件測定圖像平均熒光強(qiáng)度，其熒光強(qiáng)度越強(qiáng)， ROS表達(dá)越多。

1.2.3丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測采用硫代巴比妥酸比色法，在試劑有效期內(nèi)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.2.4自噬體檢測采用丹(磺)酰戊二胺(monodansylcadaverin,MDC)自噬體特異性染色劑,終濃度為0.05～0.1mmol/L,作用10～30min洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定單個核細(xì)胞于載玻片上，封片，熒光顯微鏡觀察自噬小體并照相。將MDC染色后的PBMCs用細(xì)胞裂解液裂解，應(yīng)用熒光分度計(激發(fā)光波長380nm,發(fā)射光波長525nm)測定熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析及直線相關(guān)分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組血清MDA含量隨著用氧濃度的升高，患兒外周血血清MDA含量在逐漸增加。由對照組至高濃度吸氧組分別為(9.35±0.22、11.84±2.07、13.38±0.74、15.6±2.01)noml/L。四組MDA含量差異具有顯著性。與對照組相比，其余三組MDA含量明顯增加。而高濃度吸氧組中MDA也明顯高于其余三組(t=9.835，t=6.674，t=4.926；P均<0.05)。見(表1，圖1)。

圖1各組血清丙二醛含量變化

Figure 1The level of MDA of serum

注：1.對照組；2.低濃度吸氧組；3.中濃度吸氧組；4.高濃度吸氧組。▲與對照組相比P<0.05，●與低濃度吸氧組相比,P<0.05，■與中等濃度吸氧組相比P<0.05

2.2各組PBMCs內(nèi)活性氧水平的變化隨著用氧濃度的升高，ROS水平逐漸升高，其光密度值分別為0.025±0.0014、0.036±0.0007、0.044±0.0017、0.053±0.0015。與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。高濃度吸氧組與中濃度吸氧組，低濃度吸氧組，對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.283，t=6.162，t=8.574；P均<0.05)，見圖2，表1。

表1　各組活性氧水平及血清丙二醛含量

注：①與對照組相比P<0.05。②與低濃度吸氧組相比P<0.05。③與中等濃度吸氧組相比P<0.05

圖2各組外周血單個核細(xì)胞內(nèi)活性氧結(jié)果(激光共聚焦×200)

Figure 2Reactive oxygen species within in peripheral blood mononuclear cells (×200)

注：1，對照組 2，低濃度吸氧組 3，中濃度吸氧組 4，高濃度吸氧組

2.3各組PBMCs內(nèi)自噬體水平的變化分離取得PBMCs后，以MDC染色，通過熒光顯微鏡觀察及定量分析發(fā)現(xiàn)，對照組、低濃度吸氧組、中濃度吸氧組、高濃度吸氧組中自噬體水平分別為0.3512±0.0615、0.6213±0.0650、0.8819±0.0514、1.1955±0.0725。高濃度吸氧組中患兒PBMCs內(nèi)熒光水平(染色的自噬小體)明顯比其余三組更高。高濃度吸氧組與中濃度吸氧組，低濃度吸氧組，對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.733，t=20.385，t=25.282；P均<0.05)，見圖3。

圖3各組中外周血單個核細(xì)胞內(nèi)自噬體水平(熒光顯微鏡×200)

Fig 3The changes in autophagy within peripheral blood mononuclear cells ×200)

注：1.對照組; 2.低濃度吸氧組; 3.中濃度吸氧組; 4.高濃度吸氧組

2.4各組中PBMCs內(nèi)自噬體水平與活性氧含量的關(guān)系對不同氧濃度患兒PBMCs內(nèi)自噬體水平變化和ROS做相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)ROS光密度值越高，自噬水平升高越明顯，二者成正相關(guān)(圖4)，經(jīng)統(tǒng)計r=0.995，P<0.01)。

3討論

自噬是真核細(xì)胞在外界刺激或者饑餓狀態(tài)下，自身組分或結(jié)構(gòu)被雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡(自噬小囊泡)包裹起來，再與溶酶體融合，最終被溶酶體水解的過程[5～8]。自噬對機(jī)體的作用是雙向的。在一定程度上，自噬可以維持機(jī)體的能量代謝和降低刺激對機(jī)體損傷，起到保護(hù)機(jī)體的作用；但當(dāng)自噬水平過高時，會因過度"吞噬"胞內(nèi)物而造成細(xì)胞死亡。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧(ROS)的生成超過抗過氧化系統(tǒng)防御能力的一種狀態(tài)。在高氧環(huán)境下，線粒體呼吸鏈通過滲漏機(jī)制產(chǎn)生氧自由基，漏出的電子直接與氧結(jié)合形成超氧自由基，轉(zhuǎn)變?yōu)镽OS。ROS可使生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化、DNA損傷、線粒體功能障礙，從而影響造成細(xì)胞功能障礙，引起組織器官的損傷[8]。

本研究顯示：隨著用氧濃度的升高，各組ROS、自噬表達(dá)水平、MDA逐漸增高。但再氧暴露中，高濃度吸氧組ROS和MDA含量增加更為顯著。同時，對PBMCs內(nèi)自噬小體進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，低濃度吸氧組及中濃度吸氧組PBMCs內(nèi)自噬小體著色較淺，高濃度吸氧組中，自噬小體著色深，高濃度吸氧組內(nèi)自噬小體明顯增多。這說明高氧可誘導(dǎo)體內(nèi)ROS增多，并在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。

圖4各組中PBMCs內(nèi)自噬體水平與活性氧含量的關(guān)系

Figure 4The relationship of autophagy and reactive oxygen species within PBMCs among the groups

注：“○”指對照組，“△”指低濃度吸氧組，“□”指中濃度吸氧組“◇”高濃度吸氧組

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，ROS含量與自噬體熒光水平的增加是呈正相關(guān)的，這與氧化應(yīng)激反應(yīng)可作為刺激因素引起細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬現(xiàn)象的報道一致[9]。提示ROS可通過誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)引起和上調(diào)細(xì)胞發(fā)生自噬反應(yīng)。這與ROS特別是線粒體ROS可作為信號分子參與自噬的調(diào)節(jié)是一致的[10]。

4結(jié)論與啟示

早產(chǎn)兒氧暴露后，高氧可誘導(dǎo)體內(nèi)ROS增多，并出現(xiàn)細(xì)胞自噬現(xiàn)象，但其自噬小體對氧化應(yīng)激損傷是起保護(hù)作用，還是加劇了ROS的蓄積加重了氧化應(yīng)激損傷，尚有待進(jìn)一步的研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Brew N, Hooper SB, Zahra V,etal. Mechanical ventilation injury and repair in extremely and very preterm lungs[J]. PLoS One, 2013, 8(5): e63905.

[2]黨紅星.氧化應(yīng)激與支氣管肺發(fā)育不良研究進(jìn)展[J].國際兒科學(xué)雜志,2012,39(5):433-437.

[3]Iliodromiti Z, Zygouris D, Sifakis S,etal.Acute lung injury in preterm fetuses and neonates: mechanisms and molecular pathways[J].J Matern Fetal Neonatal Med, 2013,26(17):1696-704.

[4]Shintani T,klionsky DJ.Autophagy in health and disease: a double-edged sword[J]. Science,2004,306:990-995

[5]Schmid D, Dengjel J. Schoor O,etal. Autophagy in innate and adaptive immunity against intracellular pathogens[J]. J Mol Med, 2006,84:194-202

[6]Deretic V. Autophagy in innate and Adaptive immunity[J]. Trends Immunol, 2005,26:523-528.

[7]Levine B.Eating oneself and uninvited. guests:autophagy-related pathways in cellular defense[J]. Cell,2005,120:159-162.

[8]Ryter SW, Choi AM.Regulation of autophagy in oxygen-dependent cellular stress[J].Curr Pharm Des,2013,19(15):2747-2756.

[9]錢帥偉,漆正堂,支彩霞.抑癌基因p53與細(xì)胞自噬[J].生命的化學(xué)，2011,31(5):640-646.

[10] 尤壽江,石際俊,張艷林.ROS介導(dǎo)的自噬及其在相關(guān)疾病中的作用[J].中國病理生理雜志,2011,27(1):187-190.