虎杖提取物白藜蘆醇對放射性肺損傷防護作用機制研究※

閻皓張恒辛紹斌1王輝△

(天津市人民醫(yī)院腫瘤科，天津300121)

【摘要】目的觀察虎杖提取物白藜蘆醇(Rev)對放射誘導(dǎo)小鼠肺損傷的保護作用及其防護機制。方法將30只C57BL/6雄性小鼠實驗小鼠隨機分為對照組、照射組和照射給藥組，每組各10只。照射組和照射給藥組小鼠用1%戊巴比妥鈉( 30 mg/ kg) 腹腔注射麻醉后固定于照射板架上，每日接受1次`(137) Cs源γ射線胸部照射，共照射5次。對照組小鼠接受偽照射。照射給藥組照射期間及照射后2周予Rev 40 mg/kg每日灌胃給藥，對照組和照射組予等量4.8%乙醇載體灌胃。末次照射后15 d，全身麻醉，處死小鼠。觀察3組小鼠肺組織病理改變，檢測丙二醇(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX1)活性和基因表達水平。結(jié)果與照射組比較，照射給藥組在小鼠肺泡炎水平明顯改善，肺組織MDA含量顯著減少，SOD及GPX1酶活性升高，SOD2及GPX1基因表達水平升高(P<0.05)。結(jié)論虎杖提取物Rev可以提高放射性肺損傷小鼠肺組織的氧化應(yīng)激水平，改善肺組織炎癥。

【關(guān)鍵詞】肺；損傷；疾病模型，動物；虎杖；化學(xué)；藜蘆生物堿類；藥理學(xué)

doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2015.05.029

【中圖分類號】R-332；R563；R282.71

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2015)05-0721-05

通訊作者：△天津市人民醫(yī)院腫瘤科，天津300121

作者簡介：：閻皓(1975—)，女，主治醫(yī)師，碩士。從事中西醫(yī)結(jié)合臨床工作。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腫瘤診治。

Abstract【】ObjectiveTo observe the protective effects and protective mechanism of resveratrol (Rev) extracted from Polygonum cuspidatum on radiation induced lung injury in mice. Methods30 C57BL/6 male laboratory mice were randomly divided into control group, irradiation group and irradiation drug administration group, 10 mice of each group. Mice in irradiation group and irradiation drug administration group received peritoneal injection of 1% pentobarbital sodium (30 mg/ kg), and then were fastened to irradiation grillage. Mice in irradiation group and irradiation drug administration group received thoracic irradiation of `(137)Cs source gamma rays once daily, 5 times totally. Mice in control group received pseudo irradiation. Mice in irradiation drug administration group received daily intragastric administration of Rev (40 mg/ kg) during irradiation and 2 weeks after irradiation. Mice in other two groups received daily intragastric administration of carrier of 4.8% ethanol at the same dose. Mice in all groups were sacrificed 15 days after the final irradiation. The pathological changes of lung tissue, the content of propanediol (MDA), the enzyme activities of Chaoyang tiger dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPX1) and the expression of gene in mice were observed in 3 groups. ResultsThe level of pulmonary alveolitis in irradiation drug administration group had obviously improved as compared with that in irradiation group, and the content of MDA in lung tissue was decreased, the activities of SOD and GPX1 were increased, the gene expressions of SOD2 and GPX1 were increased (P<0.05). ConclusionResveratrol extracted from Polygonum cuspidatum can increase the level of oxidative stress in lung tissue of irradiating mice, and improve the infection reaction of lung tissue.

收稿日期：(2014-01-17)

※項目來源：天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研課題(編號：13131)

1天津市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，天津300121

Mechanism research of the protective effects of resveratrol extracted from Polygonum cuspidatum on radiation-induced pulmonary injuryYANHao*,ZHANGHeng,XINShaobin,etal.*DepartmentofOncology,People'sHospitalofTianjinCity,Tianjin300121

【Key words】Lung; Injury,disease model，animal; Polygonum cusppdatum; Chemical；Veratrum alkaloids； Pharmacology

肺是放射性敏感器官，胸部腫瘤患者在放療過程中可出現(xiàn)放射性肺損傷，導(dǎo)致肺換氣功能衰竭，目前臨床無有效治療手段[1]。研究表明，電離輻射(ionizing radiation，IR)可引起肺組織內(nèi)氧自由基水平持續(xù)升高，引起肺組織氧化應(yīng)激狀態(tài)[2]。氧自由基一方面可以直接損傷組織細胞脫氧核糖核酸(DNA)，導(dǎo)致細胞凋亡，作為信號分子還具有廣泛的生物活性，可以激活多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[3-4]，引起組織炎癥，破壞肺換氣功能，降低患者治療依從性，甚至導(dǎo)致患者呼吸衰竭和死亡[5]。

虎杖提取物白藜蘆醇(resveratrol，Rev)是一種非黃酮多酚類化合物，是一種天然的抗氧化劑，可降低血液黏稠度，抑制血小板凝結(jié)；防治動脈粥樣硬化、冠心病、缺血性心臟病、高脂血癥；對神經(jīng)退行性疾病也具有治療或改善預(yù)后的作用；對多種生物具有延長壽命的作用[6]。其保護作用機制主要是抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性以減少細胞內(nèi)源性活性氧(ROS)的生產(chǎn)，增強過氧化氫酶活性以清除細胞內(nèi)自由基[7]。前期研究表明，Rev對造血細胞具有調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶1 (GPX1)表達和活性，緩解IR引起的造血細胞氧化應(yīng)激水平的作用[8-9]。我們在前期工作的基礎(chǔ)上，研究了Rev對肺組織放射損傷的防護作用及作用機制，結(jié)果如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物雄性C57BL/6小鼠(SPF級) 30只，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所提供，動物合格證號：SCXK(京)2005-0013，體質(zhì)量20～22 g。每籠5只飼養(yǎng)于SPF級動物房，飼養(yǎng)設(shè)施合格證號：SVXK 津2009-0002。全價清潔飼料由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供。隨機分為對照組、照射組和照射給藥組，每組各10只。

1.1.2主要藥物及試劑Rev，美國Sigma公司；丙二醇(MDA)試劑盒，南京建成生物工程研究所；SOD、GPX1試劑盒，江蘇碧云天科技公司；RNA PCR Kit(AWV)試劑盒，日本TAKARA公司。

1.1.3主要儀器光學(xué)顯微鏡，BX51型，日本奧林巴斯公司；照射源為Cs源γ射線Cammacell-40 Atomic Energy，加拿大。

1.2實驗方法

1.2.1模型制備照射組和照射給藥組小鼠以1%戊巴比妥鈉30 mg/ kg腹腔注射麻醉后，固定于照射板架上，每日接受1次137Cs源γ射線胸部照射，劑量率0.76 Gy/min，劑量為2 Gy，共照射5次。對照組小鼠接受偽照射。

1.2.2給藥方法Rev粉劑用96%乙醇溶解為50 mM的儲存液4 ℃避光保存，給藥前用雙蒸水稀釋至2.5 mM。照射給藥組照射期間及照射后2周予Rev 40 mg/kg每日灌胃給藥，對照組和照射組予等量4.8%乙醇灌胃。

1.3觀察指標及方法

1.3.1肺部組織形態(tài)學(xué)觀察末次照射后15 d，3組小鼠全身麻醉處死，解剖取左肺外側(cè)矢狀面，用4%甲醛固定液固定過夜，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，5 μm/片，蘇木素—伊紅(HE)染色。光學(xué)顯微鏡200倍放大觀察3組小鼠肺部組織形態(tài)，每只小鼠至少觀察8個視野。參照文獻[8]將肺泡炎程度分為(-~+++)級：①無肺泡炎(-)；②輕度肺泡炎(+)，受累面積<20%；③中度肺泡炎(++)，受累面積>20%且<40%；④重度肺泡炎(+++)，受累面積>40%。

1.3.2MDA測定取肺組織勻漿30 μL，采用硫代巴比妥酸比色法測定，嚴格按照說明書進行操作。

1.3.3SOD和GPX1酶活性測定取肺組織勻漿30 μL，分別按照SOD、GPX1試劑盒用說明書測定3組小鼠肺組織SOD及GPX1酶活性[9]。小鼠末次給藥后1 d處死，取肺組織勻漿提取總RNA，合成cDNA后行實時熒光定量PCR法在mRNA水平檢測SOD1、SOD2、SOD3、GPX1表達水平。

1.3.4SOD和GPX1基因表達水平測定采用qRT-PCR實驗。取3組小鼠新鮮肺組織，勻漿后常規(guī)提取總核糖核酸(RNA)，用RNA PCR Kit(AWV)試劑盒合成cDNA。引物序列見表1。SYBR染料法檢測SOD1、SOD2、SOD3、GPX1基因的mRNA表達水平，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因。各樣本均設(shè)置3個平行樣，用SYBR Master Mix(ABI，USA)配置25 μL反應(yīng)體系后上機檢測(Prism7500，ABI，美國)，實驗數(shù)據(jù)用△△CT法計算，靶基因表達倍率計算公式為2[-△△CT]。

表1　qRT-PCR實驗引物列表

2結(jié)果

2.1一般情況對照組小鼠皮毛光滑，有光澤，身體健壯，飲食、活動正常，體質(zhì)量增長，實驗結(jié)束時無死亡；照射組小鼠皮毛干枯無光澤，精神弱，反應(yīng)遲鈍，進食不積極，呼吸急促，死亡2只，體質(zhì)量無增長；照射給藥組較照射組比較，小鼠皮毛光澤尚可，身體較壯，飲食、活動積極，體質(zhì)量有增長，無死亡。

2.2病理學(xué)檢查

2.2.1整體形態(tài)觀察對照組肺外觀正常，呈粉紅色，表明光滑有彈性；照射組肺呈黯紅色，部分肺組織呈灰白色，彈性降低，可見散在片狀灰白色斑塊，肺體積縮小，硬度增加；照射給藥組，肺外觀較照射組改善，略呈黯紅色，肺彈性尚可，部分肺葉可見散在白色斑點。

2.2.2光學(xué)顯微鏡觀察對照組肺組織正常，肺泡大小正常，肺泡壁厚度均勻、完整，無炎性細胞。照射組小鼠肺泡間隔增寬，肺泡壁厚薄不均，間質(zhì)中大量淋巴細胞浸潤，肺泡壁破壞，部分肺泡實變，肺泡腔內(nèi)可見炎性細胞浸潤，呈輕度肺泡炎改變。照射給藥組小鼠肺泡間隔較照射組改善，僅輕度增寬，部分由少量炎性細胞浸潤，肺泡炎不明顯。

2.33組小鼠肺泡炎程度比較見表2。

表2　3組小鼠肺泡炎程度比較　只

由表2可見，經(jīng)Ridit檢驗，照射組肺泡炎程度與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，照射組肺泡炎程度較對照組嚴重，放射損傷肺組織動物模型成功；照射給藥組肺泡炎程度與照射組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，照射給藥組小鼠肺泡炎水平較照射組明顯改善。

2.43組小鼠SOD、GPX1基因表達比較見表3。

表3　3組小鼠SOD、GPX1基因表達比較

由表3可見，照射組小鼠SOD1、SOD2和GPX1基因表達水平較照射小鼠均下降，對SOD3的表達無顯著影響(P>0.05)，Rev干預(yù)后可以顯著提高SOD2和GPX1基因的表達水平。與照射組比較，照射給藥組SOD2和GPX1基因表達水平顯著升高(P<0.05)。

2.53組小鼠MDA含量和SOD、GPX1活性比較見表4。

表4　3組小鼠MDA含量和SOD、GPX1活性比較

由表4可見，末次給藥1 d后，照射組小鼠肺組織MDA含量較對照組顯著增高(P<0.05)，SOD、GPX1活性顯著降低(P<0.05)；照射給藥組小鼠肺組織MDA含量較照射組顯著降低(P<0.05)，SOD、GPX1活性顯著升高(P<0.05)。

3討論

急性放射性肺損傷屬中醫(yī)學(xué)咳嗽、喘證、肺瘺范疇。放射線屬中醫(yī)熱毒之邪，可灼傷人體津液，損傷人體津液正氣。放射線導(dǎo)致的疾病與一般外感熱毒外邪不同，其不遵循由表及里的傳變規(guī)律，而是直中臟腑。放射線邪毒最易熏灼肺陰，導(dǎo)致肺燥陰虧。熱毒之邪損傷肺絡(luò)出現(xiàn)氣血內(nèi)阻，痰熱內(nèi)蘊，進而阻滯氣機，氣滯又導(dǎo)致血瘀。肺燥陰虧，瘀血阻肺，使肺宣發(fā)肅降、朝百脈功能障礙，可導(dǎo)致清氣難入、濁氣難出，故放射性肺損傷患者可出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難、胸悶、喘促及憋氣癥狀，嚴重者可因急性呼吸衰竭而死亡。總之，熱毒為放射性肺損傷的主要病因，肺燥陰虧，瘀血內(nèi)阻是該病的主要病機。

虎杖味苦，性微寒，歸肝、膽、腎經(jīng)，具有清熱解毒、活血化瘀、祛痰止咳、祛風(fēng)利濕功效[10]?；⒄人幵簇S富，具有廣泛的藥理活性。現(xiàn)代藥理研究表明虎杖有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)咳、平喘等作用，對人體多個系統(tǒng)、多種疾病具有治療作用[11]。虎杖的主要成分Rev作為藥品和保健品已經(jīng)得到廣泛運用，其抗氧化、抗衰老、抗凋亡的作用[7]也提示在放射損傷防護領(lǐng)域有良好的研究前景。在本研究中，我們對接受肺部放射的小鼠灌胃使用Rev。研究表明，Rev可以明顯改善肺部受損小鼠的一般狀態(tài)，降低肺泡放射損傷和肺間質(zhì)的炎癥水平，并可能與降低受損小鼠肺組織的氧化應(yīng)激水平相關(guān)。

為了深入研究Rev對肺組織放射損傷的防護作用，我們研究了降低氧化應(yīng)激水平的相關(guān)基因SOD和GPX1。SOD是機體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，阻斷因氧自由基對細胞造成的損害。其中SOD2基因編碼錳超氧化物歧化酶(manganese-containing superoxide dismutase，MnSOD)，是以O(shè)2·-為底物的最重要的自由基清除劑，存在于線粒體基質(zhì)中，可以清除線粒體呼吸鏈電子傳遞途徑生成的活性氧，防止自由基累積，保護細胞免受活性氧的損傷[12]。GPX1是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，能使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進H2O2的分解，保護細胞膜結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物干擾及損害[13]。我們通過酶學(xué)實驗和qRT-PCR實驗表明，Rev干預(yù)可以有效提高肺組織及清除氧自由基的SOD、GPX1基因表達水平，提高SOD、GPX1活力，并可能與降低放射損傷小鼠肺組織的氧化應(yīng)激水平起到保護小鼠肺放射損傷作用有關(guān)。

總之，我們闡明了Rev對放射性損傷小鼠肺組織具有防護作用，并初步闡明了其降低放射性肺損傷小鼠氧化應(yīng)激水平的分子機制。提示虎杖對臨床放療患者肺組織損傷具有防護作用。今后研究中我們還要對Rev對肺組織放射防護作用機制做更深入研究，對沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)的激活作用和類雌激素作用將是該研究的重點。該研究還提示以后可以研究與Rev結(jié)構(gòu)近似的化學(xué)物質(zhì)，開發(fā)出更強效的放射損傷防護劑，并積極探討Rev類藥物對消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)的放射損傷防護作用。

參考文獻

[1]Molthen RC，Wu Q，F(xiàn)ish BL，et al.Radiation damage to the lung：mitigation by angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors[J].Respirology，2012，17(1)：66-71.

[2]Zhao W，Robbins ME.Inflammation and chronic oxidative stress in radiation-induced late normal tissue injury：therapeutic implications[J].Current medicinal chemistry，2009，16(2)：130-143.

[3]Puthran SS，Sudha K，Rao GM，et al.Oxidative stress and low dose ionizing radiation[J].Indian journal of physiology and pharmacology，2009，53(2)：181-184.

[4]Zhao W，Diz DI，Robbins ME.Oxidative damage pathways in relation to normal tissue injury[J].The British journal of radiology，2007，(1)：23-31.

[5]Medhora M，Gao F，F(xiàn)ish BL，et al.Dose-modifying factor for captopril for mitigation of radiation injury to normal lung[J].Journal of radiation research，2012，53(4)：633-640.

[6]Saiko P，Szakmary A，Jaeger W，et al.Resveratrol and its analogs：defense against cancer，coronary disease and neurodegenerative maladies or just a fad[J].Mutation research，2008，658(1-2)：68-94.

[7]Pervaiz S，Holme AL.Resveratrol：its biologic targets and functional activity[J].Antioxidants & redox signaling，2009，11(11)：2851-2897.

[8]Zhang H，Zhai Z，Wang Y，et al.Resveratrol ameliorates ionizing irradiation-induced long-term hematopoietic stem cell injury in mice[J].Free radical biology & medicine，2013，54：40-50.

[9]Wang H，Yang YL，Zhang H，et al.Administration of the resveratrol analogues isorhapontigenin and heyneanol-A protects mice hematopoietic cells against irradiation injuries[J].BioMed research international，2014,(24)：282657.

[10]Kirino A，Takasuka Y，Nishi A，et al.Analysis and functionality of major polyphenolic components of Polygonum cuspidatum (itadori)[J].Journal of nutritional science and vitaminology，2012，58(4)：278-286.

[11]Lee CC，Chen YT，Chiu CC，et al.Polygonum cuspidatum extracts as bioactive antioxidaion，anti-tyrosinase，immune stimulation and anticancer agents[J].Journal of bioscience and bioengineering，2014，119(4)：464-469.

[12]Li H，Wang Y，Pazhanisamy SK，et al.Mn(Ⅲ) meso-tetrakis-(N-ethylpyridinium-2-yl) porphyrin mitigates total body irradiation-induced long-term bone marrow suppression[J].Free radical biology & medicine，2011，51(1)：30-37.

[13]Spanier G，Xu H，Xia N，et al.Resveratrol reduces endothelial oxidative stress by modulating the gene expression of superoxide dismutase 1 (SOD1)，glutathione peroxidase 1 (GPX1) and NADPH oxidase subunit (Nox4)[J].Journal of physiology and pharmacology，2009，(Suppl 4)：111-116.

(本文編輯：董軍杰)

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